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ACTIVIDAD PROMOTORA DEL CRECIMIENTO VEGETAL DE BACTERIAS DE

NDULOS DE MAN: POTENCIAL APLICACIN AL SISTEMA DE ROTACIN DE


CULTIVOS MAN-MAZ
Fernando Ibaez, Mara Eugenia Arroyo, Adriana Fabra
e-mail: fibanez@exa.unrc.edu.ar. Departamento de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Ro Cuarto. Ruta 36 Km 601, Ro Cuarto
(5800), Crdoba, Argentina.

Introduccin
El grupo denominado bacterias promotoras del crecimiento de las plantas o PGPBs (del ingls Plant Growth
Promoting Bacteria), incluye numerosos microorganismos que viven en el suelo y se asocian con distintas
especies vegetales, facilitando o incrementando su crecimiento. La utilizacin de estos microorganismos en las
prcticas agrcolas puede constituir una alternativa vlida para incrementar la productividad de los cultivos en
un esquema de produccin sustentable y amigable con el medio ambiente, reduciendo la aplicacin de
agroqumicos.
En nuestro laboratorio se obtuvo una coleccin de aislamientos bacterianos a partir del interior de ndulos de
man, representativa del rea manisera de la provincia de Crdoba. Estos aislamientos fueron caracterizados
fenotpica y genotpicamente, demostrando que dicha poblacin es altamente heterognea e incluye
microorganismos pertenecientes a los gneros Pseudomonas, Enterobacter y Klebsiella (ubicados en la Clase
-Proteobacterias). Posteriormente, se determin que los microorganismos pertenecientes a esta Clase no eran
capaces de inducir la formacin de ndulos en man, y que carecan de genes de nodulacin. Por lo tanto, estos
aislamientos fueron considerados endfitos oportunistas, capaces de colonizar los ndulos preformados por la
especie rizobiana compatible. Adems, estos estudios demostraron que dichos endfitos de ndulos son
capaces de promover incrementos significativos en distintos parmetros de crecimiento y nodulacin de plantas
de man.
En este marco, el presente trabajo contribuye a la caracterizacin de las propiedades promotoras del
crecimiento vegetal de los aislamientos endofticos de ndulos de la coleccin, as como tambin a la
evaluacin del efecto de su aplicacin sobre el crecimiento de plntulas de maz. Adems, se analiz el carcter
endoftico de los aislamientos en plntulas de este cultivo. Finalmente, y considerando la capacidad de los
microorganismos para interactuar con diferentes especies vegetales, se evaluaron los efectos de su aplicacin
en un ensayo que simula una secuencia de rotacin man-maz.
Materiales y Mtodos
-Aislamientos bacterianos. Se utiliz una coleccin integrada por 7 aislamientos de Gammaproteobacterias
endfitas de ndulos (pertenecientes a los gneros Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas), obtenida a partir
de ndulos de plantas de man cultivadas a campo.
-Determinacin de propiedades PGPB. Se analiz la capacidad de las bacterias para producir siderforos,
cido Indol-Actico (AIA) y de solubilizar fosfato. La sntesis de siderforos se evalu en placas de Petri
conteniendo el medio CAS. La produccin de AIA fue analizada cualitativamente mediante una reaccin
colorimtrica utilizando el reactivo de Salkowski y la capacidad para solubilizar fosfatos fue ensayada en placas
de Petri conteniendo el medio NBRIP.
-Inoculacin de plntulas de maz. Semillas de maz hbrido NK900 TD MAX fueron esterilizadas
superficialmente y pregerminadas. Las plntulas fueron inoculadas a los 4 das post-emergencia con una
suspensin bacteriana preparada a partir de una colonia aislada transferida a medio de cultivo TY o,
alternativamente, YEM. Los cultivos fueron incubados a 28C hasta alcanzar la fase estacionaria de
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crecimiento (~1.10 UFC/ml). Posteriormente se tomaron 4-5 ml de estos cultivos que fueron depositados sobre
la raz de las plntulas. Cuando se inocul simultneamente ms de una cepa bacteriana, stas fueron
cultivadas por separado en sus medios de crecimiento correspondientes, y luego se agreg 5 ml de cada uno
de ellos a las macetas. Las plantas fueron cosechadas a los 30 das post inoculacin y se registraron
diferentes parmetros de crecimiento.
-Determinacin del carcter endoftico de los aislamientos en las races de las plntulas de maz. Las races de
las plantas fueron esterilizadas superficialmente. Luego, se pes 1 gramo de tejido radical estril y se le agreg
-1
9 ml de solucin fisiolgica para obtener la dilucin 10 . Las races fueron homogeneizadas en morteros
estriles para liberar los microorganismos del interior de los tejidos radicales. Posteriormente, se realizaron
diluciones seriadas que fueron sembradas por triplicado en medio TY con el agregado de Cloramfenicol (40
mg/ml). Las placas se incubaron a 28C por 24 hs y los aislamientos obtenidos fueron repicados en el mismo
medio. Finalmente, las colonias obtenidas fueron tipificadas mediante ERIC-PCR. Para confirmar la identidad
de los aislamientos, el perfil ERIC obtenido a partir de los endfitos recuperados fue comparado con el de las
cepas inoculadas.

-Ensayos en sistemas simulados de rotacin man-maz. Semillas de man variedad Runner cultivar Tegua y
maz hbrido NK900 TD MAX fueron esterilizadas superficialmente y pregerminadas. Las semillas de man se
colocaron en macetas inoculadas con una mezcla del aislamiento endfitico y el simbionte (Bradyrhizobium sp.
SEMIA 6144). Como sustrato se utiliz un suelo agrcola estril con bajo contenido de fosfato (7 ppm). En los
ensayos se incluyeron controles negativos (plntulas sin inocular), controles inoculados exclusivamente con
Bradyrhizobium sp. SEMIA 6144 y controles fertilizados (regados peridicamente con una solucin de KNO 3 5
mM). Las plantas se cosecharon a los 60 das post-inoculacin, y se determin el peso seco y fresco de la
parte area y radical, y nmero y peso seco de ndulos. Luego se colocaron, en las mismas macetas, las
semillas de maz. Tres macetas por tratamiento fueron reinoculadas con los aislamientos de
Gammaproteobacterias, con el fin de aumentar su nmero en el sustrato. Las plantas se cosecharon luego de
28 das y se registr el peso seco y fresco de la parte area y radical y la longitud area.
-Anlisis estadstico de los datos. Los datos obtenidos fueron analizados mediante ANOVA, utilizando el
paquete informtico Infostat.
Resultados
El anlisis de las propiedades promotoras del crecimiento revel que todos los aislamientos fueron capaces de
solubilizar fosfatos y producir AIA. Adems, los aislamientos Pseudomonas sp. NCHA35, Pseudomonas sp.
NVAM24 y Klebsiella sp. TT001 produjeron siderforos. Posteriormente, se analiz la capacidad de estas
bacterias para colonizar y promover el crecimiento de plntulas de maz. Los ensayos de inoculacin en este
cultivo revelaron que los aislamientos fueron capaces de promover su crecimiento, ya sea inoculados
individualmente o coinoculados en grupos conformados segn su afiliacin taxonmica. Sin embargo, los
efectos observados en las coinoculaciones fueron superiores, sugiriendo la existencia de un efecto sinrgico
entre los aislamientos. Por otra parte, los aislamientos Enterobacter sp. NMAN11, Enterobacter sp. NONC13,
Pseudomonas sp. NCHA33, Klebsiella sp. TT001 y/o Klebsiella sp. NTI31 fueron capaces de colonizar el interior
de las races de las plntulas de maz. No obstante, la capacidad endoftica de los aislamientos no parece estar
relacionada con el efecto promotor del crecimiento en este cultivo.
Posteriormente, los aislamientos fueron inoculados a plntulas de man, las cuales fueron sucedidas por
plntulas de maz, creciendo en condiciones controladas que simularon una rotacin de cultivos. Los resultados
obtenidos en la primera etapa de este ensayo (cultivo de man) confirmaron la capacidad de los aislamientos
para promover su crecimiento. Se destacaron los tratamientos conformados por la co-inoculacin de
Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Klebsiella, as como la de Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Pseudomonas,
ya que incrementaron distintos parmetros de crecimiento con respecto al control sin inocular. En cuanto a la
segunda etapa (cultivo de maz), los resultados indicaron que numerosos tratamientos fueron capaces de
incrementar significativamente distintos parmetros de crecimiento vegetal. Es interesante destacar que todos
los tratamientos que implicaron reinoculaciones mostraron un incremento significativo en las variables medidas
con respecto al control sin inocular.
Discusin y Conclusiones
Los aislamientos pertenecientes a la coleccin de endfitos de ndulos de man presentan diferentes
propiedades PGP, y son capaces de promover el crecimiento de plntulas de maz ya sea coinoculados en
grupos conformados segn su afiliacin taxonmica o inoculados individualmente. Adems, algunos
aislamientos son capaces de colonizar el interior de las races de este cultivo. Sin embargo, an cuando esta
capacidad puede representar una estrategia ecolgica que incremente la persistencia de los microorganismos
en los suelos, no parece estar relacionada con el efecto promotor del crecimiento observado.
Las bacterias analizadas demostraron un interesante potencial para promover el crecimiento de plntulas de
man y maz en un ensayo de rotacin. Esta caracterstica permitira proponer la aplicacin, al inicio de la
rotacin, de inoculantes bacterianos mixtos que promuevan el crecimiento de ambos cultivos. Sin embargo, y a
pesar de su capacidad para persistir en los suelos, la reinoculacin con los aislamientos luego de la cosecha de
man demostr ser una prctica ms efectiva para la promocin del crecimiento del cultivo de maz. Teniendo
en cuenta los resultados obtenidos en el conjunto de los ensayos realizados, se concluye que la coinoculacin
entre Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Klebsiella, y Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 y Pseudomonas
representan una alternativa interesante para su utilizacin en sistemas agrcolas que impliquen rotacin de
cultivos man-maz. No obstante, resulta necesario comprobar la capacidad promotora del crecimiento de estos
aislamientos en ensayos a campo.
Subsidiado por Fundacin Man Argentino, ANPCyT, SECyT-UNRC.

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