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CARACTERISTICAS MORFOLGICAS Y ESTRUCTURALES DE

Mycobacterium tuberculosis.
Las mycobacterias en general pueden variar mucho en su morfologa, desde formas
cocoides pequeas a largos filamentos, M. tuberculosis suele tener una morfologa
caracterstica, bacilo delgado de forma recta o ligeramente curvada en frotis teidos, y su
tamao suele ser de 1-4 micras de largo por 0,3-0,5 micras de ancho. Ocasionalmente,
forma ramificaciones verdaderas que se observan en cultivos enriquecidos y en frotis de
ganglios linfticos gaseosos.
Son bacilos no formadores de esporas, sin flagelos ni cpsula. La estructura celular de M.
tuberculosis consta de una gruesa pared, separada de la membrana celular por el espacio
periplsmico, con cuatro capas. La ms interna es el glicopptido o peptidoglicano con
molculas de N-acetilglucosamina y cido-N-glucolilmurmico (en lugar del habitual Nacetilmurmico) con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la bacteria que
le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas compuestas, una por polmeros de
arabinosa y galactosa, otra formada por cidos miclicos (que son cidos grasos derivados)
y otra superficial formada por lpidos como los sulfolpidos, el cord factor, llamado as por
su aparente asociacin con la forma acordonada con que se agrupan las mycobacterias
virulentas, y los micsidos que son al igual que el anterior glicolpidos. No difiere del resto
de las bacterias en cuanto al citoplasma y el ADN nuclear. Las mycobacterias son aerobios
estrictos y no crecen en ausencia de oxgeno.
La M. tuberculosis se desarrolla de forma adecuada en medios simples que contienen una
fuente de carbono, una de nitrgeno e iones de metales esenciales entre ellos hierro y
magnesio. Para su cultivo, se requiere un medio ms complejo que contenga una base de
patata-huevo o una base de agar-suero. Los bacilos tuberculosos tienen un crecimiento muy
lento incluso en condiciones ptimas y requiere de 10 a 20 das de incubacin a 37C.
Aunque la proliferacin puede tener lugar a un pH que oscila entre 6 a 7.6, el pH ptimo de
crecimiento es de 7.

Las mycobacterias son muy resistentes a la desecacin. El medio ambiente en el que se


encuentran constituye un factor muy importante para su viabilidad. Por ejemplo, cuando se
exponen a la luz solar directa, los bacilos tuberculosos de los cultivos son destruidos en 2
horas, pero si estos estn presentes en el esputo, pueden permanecer viables durante
periodos ms largos.

Las mycobacterias son ms resistentes a la desinfeccin con productos qumicos que otros
microorganismos no formadores de esporas, probablemente como consecuencia de su
contenido en lpidos. Son sensibles al calor hmedo y son destruidos por las temperaturas
de pasteurizacin.

MTODO DE COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN


La tincin de Ziehl Neelsen fue desarrollada inicialmente por Paul Ehrlich para poner de
manifiesto la presencia de los bacilos causantes de la tuberculosis en muestras clnicas de
pacientes.
Esta tcnica es capaz de diferenciar los bacilos Acido Alcohol Resistentes (BAAR).

La tcnica de Z-N fuerza la penetracin de la fucsina bsica en la pared celular mediante la


accin combinada del fenol y el calor, que aumentan la fluidez de la capa de cidos
miclicos: el calor derrite el componente ceroso y el fenol acta a modo de disolvente,
permitiendo el paso del colorante bsico que se une a los cidos miclicos con carga
negativa. Cuando cesa la aplicacin de calor y/o se elimina el exceso de fenol mediante un
lavado con agua, la pared recupera su consistencia cerosa, pero las molculas de fucsina
quedan atrapadas en su espesor.
Con la coloracin de Ziehl Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente
curvos, rojo fucsia, destacndose claramente contra el fondo azul.
Coloracin:
Disponer dos varillas de vidrio en forma paralela, a una distancia de aproximadamente 5
cm entre una y otra, una sobre un soporte dentro del lavabo/pileta de coloracin.
Filtrar la cantidad de fucsina necesaria para las tinciones a realizar en la jornada. Si el
nmero de baciloscopia a colorear es pequeo, se puede filtrar la fucsina directamente
cuando se la deposita sobre el extendido a travs de un pequeo embudo con papel de filtro.
Colocar sobre el soporte las lminas fijadas conservando el orden numrico con el
extendido hacia arriba y manteniendo una separacin de al menos 1cm entre ellas.
Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina bsica fenicada recin filtrada.
Dispensar el colorante con suavidad, sin salpicar y sin tocar con el gotero o con el embudo
los extendidos.

Con la llama de un hisopo embebido en alcohol calentar suavemente por debajo de los
extendidos, con movimientos de vaivn, hasta que observe que se desprenden los primeros
vapores blancos. No calentar con mechero.
En caso de derrame del colorante, reponer la fucsina, no dejar secar el preparado.
En el trmino de aproximadamente cinco minutos calentar tres veces hasta emisin de
vapores; esto es suficiente para que la fucsina penetre adecuadamente en el bacilo y se fije a
sus lpidos. No hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse
mal.
Con una pinza, levantar cuidadosamente la lmina portaobjetos desde el extremo ms
cercano al operador. Enjuagar con abundante agua a baja presin, con un frasco o un grifo.
Lavar muy suave y cuidadosamente la superficie eliminando totalmente la solucin de
fucsina. Girar el extendido y lavar con cuidado tambin la parte posterior.
Inclinar el portaobjetos para eliminar el exceso de agua y as evitar diluir los reactivos que
se utilizarn a continuacin.

Decoloracin:
Cubrir la totalidad del extendido con solucin decolorante y dejar actuar aproximadamente
3 minutos.
Enjuagar con abundante agua a baja presin.
Verificar que el extendido se ha decolorado (las partes ms gruesas del extendido a lo
sumo conservan un leve tinte rosado). Si se observan cmulos rojos o coloracin rosada
intensa, volver a cubrir con solucin decolorante, dejarla actuar entre uno y tres minutos y
enjuagar nuevamente.

Eliminar el exceso de agua inclinando el portaobjetos

Coloracin de fondo:
Cubrir todo el extendido con solucin de azul de metileno.
Dejar actuar durante un minuto.
Enjuagar las lminas en ambas caras con agua a baja presin y limpiar parte inferior con
un algodn si ha quedado coloreada.
Observar si las lminas conservan la numeracin clara y visible. Si no es as volver a
numerarlas.

Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical en un


soporte sobre un papel absorbente. No apoyar papel absorbente sobre el extendido.

BACILOSCOPIA: OBSERVACIN DE LOS BACILOS TUBERCULOSOS


La baciloscopia, es la tcnica fundamental en toda investigacin bacteriolgica de la
tuberculosis, en la deteccin de casos y control de tratamiento, con un costo bajo y de
rpida ejecucin.
La baciloscopia es una tcnica que permite identificar al 70-80% de los casos pulmonares
positivos, es decir, es muy bajo el riesgo de equivocarse al diagnosticar tuberculosis.
La baciloscopia puede ser realizada en laboratorios de cualquier complejidad, que posean
un microscopio con lente de inmersin en buenas condiciones, algunos insumos de bajo
costo e instalaciones simples en el laboratorio. Deben seguirse normas bsicas sencillas que
aseguren calidad y minimicen los riesgos, Es recomendable que el rea sea exclusiva, pero
no siempre es posible.
Lectura de extendidos coloreados por Ziehl Neelsen
Ubicar cerca del microscopio todos los elementos necesarios:
-aceite de inmersin.
-pauelos o trozos de papel suave.
-el Registro del Laboratorio.
-una lapicera.
-una caja para guardar portaobjetos.
-un frasco con xilol o con etanol a 70%.
Depositar una gota de aceite de inmersin en un extremo del frotis, sin tocar el preparado
con el gotero.
Enfocar el extendido donde ha colocado la gota de aceite, con la lente 100x de inmersin.

Observar cada campo microscpico en superficie y profundidad, moviendo


permanentemente el tornillo micromtrico, antes de desplazarse al campo contiguo.

Seguir un recorrido en lneas rectas, sistemtico para recorrer el extendido evitando repetir
la lectura de algunos campos.
Observar la calidad del extendido y de la coloracin. Si no fuesen buenas, repetir
nuevamente la baciloscopia de esa muestra.
Si se observan anormalidades, identificar las Causas.
Contar el nmero de campos que ha ledo y el nmero de BAAR que ha identificado.

Para calcular el promedio de BAAR encontrados por campo, sumar el total de BAAR
contados y dividir ese total por el nmero de campos observados. Cuando los bacilos se
presentan agrupados, una estimacin aproximada del nmero de bacilos presentes en el
cmulo es suficiente para calcular este promedio.
Los campos ledos deben ser campos microscpicos tiles. Se considera campo
microscpico til a aquel en el cual se observan clulas bronquiales (leucocitos, clulas
ciliadas) o fibras mucosas, que aparecen teidos de azul.
El extendido preparado tal como fue descrito permite observar 100 campos microscpicos
en lnea recta.
Un laborotorista experimentado completa la lectura de 100 campos en aproximadamente
cinco minutos.
Al finalizar la lectura, girar el revolver de los objetivos y retirar el portaobjetos de la
platina.
Comprobar el nmero de identificacin y registrar el resultado.
Antes de examinar el portaobjetos siguiente, limpiar suavemente la lente de inmersin con
un trozo de pauelo de papel absorbente. Esto evita la transferencia de material al siguiente
frotis que se va a leer.
LOS BACILOS MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Y LA COLORACIN DE ZIEHL
NEELSE

El diagnstico de certeza de tuberculosis puede hacerse en forma confiable en el


laboratorio, demostrando la presencia de bacilos en una muestra de la lesin por medio de
la baciloscopia (examen microscpico) o el cultivo. La baciloscopia ser positiva cuando la
muestra tenga como mnimo, entre 5.000 y 10.000 bacilos por mililitro de muestra. Este
alto contenido de bacilos se encuentra en los pacientes con tuberculosis pulmonar,
especialmente en aquellos con enfermedad avanzada y con lesiones cavitadas. Estos
pacientes son los que transmiten los bacilos manteniendo la enfermedad en la comunidad.
La baciloscopia hoy en da, es entonces, la tcnica de eleccin para el diagnstico rpido y
control del tratamiento de la tuberculosis pulmonar del adulto. La coloracin de Ziehl
Neelsen es la tcnica ms apropiada para ser utilizada en todos los laboratorios de los
pases de Amrica Latina. Es la recomendada por la Organizacin Mundial de la Salud
(OMS) y la Unin Internacional Contra la Tuberculosis y Enfermedades Respiratorias
(UICTER) por ser la que asegura resultados reproducibles con un entrenamiento sencillo y
la ms econmica. Esta tincin est basada en el calentamiento del colorante para que este
atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar
con agua, provoca una nueva solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante
ya no pueda salir de la bacteria. Por otro lado el calentamiento aumenta la energa cintica
de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias.

Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se observan de
color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.