Anda di halaman 1dari 10

PERCOBAAN IV

IDENTIFIKASI FLAVONOID DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS


A. Tujuan Praktikum
Melakukan analisis kualitatif golongan senyawa flavonoid dengan metode
kromatografi lapis tipis.
B. Pendahuluan
Flavonoid terdapat dalam semua tumbuhan yang berpembuluh tetapi beberapa kelas lebih
tersebar daripada yang lainnya. Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi dan
karena itu menunjukkan pita serapan kuat pada sprektum UV dan sprektum tampak. Flavonoid
pada umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon
falvonoid yang mana pun mungkin saja terdapat dalam satu tumbuhan dalam beberapa bentuk
kombinasi glikosida. Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka
diekstraksi dengan etanol 70% dan tetap ada dalam lapisan air setelah ekstrak ini dikocok dengan
eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila ditambah
basa amonia, jadi mereka mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan. Tidak ada
benda lain yang begitu mencolok dibandingkan flavonoid yang member konstribusi keindahan
dan kesemarakan pada bunga dan buah-buahan di alam. Flavin akan memberikan warna kuning
atau jingga, antosianin akan member warna merah, ungu atau biru yaitu semua warna yang
terdapat pada pelangi terkecuali warna hijau. Secara biologis, flavonoid memainkan peranan
penting dalam kaitannya dengan penyerbukan pada tanaman oleh serangga. Sebagian flavonoid
memiliki rasa yang pahit sehingga dapat menolak sejenis ulat tertentu. (Sastroamidjoyo,1996).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan
komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan
dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan
komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran.
Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang
mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui
kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan
bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya.
C. Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam praktikum adalah lempeng KLT GF 254, metanol,
amonia, pereaksi sitroborat, fase atas dari campuran n-butanol : asam asetat : air
(3 : 1 : 1) v/v sebagai eluen. Sedangkan alat yang digunakan dalam praktikum
adalah chamber KLT, pipa kapiler/ tusuk gigi, pinset, alat penyemprot, oven,
lampu UV 244 nm.
D. Cara Kerja
Sari I, Rutin dalam metanol Sari 2, Kuersetin dalam metanol, Sari 3
Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,
dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm, dan
jarak elusi = 6,5 cm),
Dielusi pada chamber KLT yang telah berisi campuran
n-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1) v/v sebagai
eluen,
Dikeringkan dengan hair dryer,
Dideteksi :
1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,
2. Uap amonia, di bawah sinar tampak dan UV 254,
ditandai bercaknya,
3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oC selama 5
menit, di amati di bawah sinar UV 254, ditandai
bercaknya,
Dicatat Rf, hRf, dan warna yang terbentuk,
Rf, hRf, warna
E. Hasil dan Pembahasan
E.1. Hasil Pengamatan
Gambar 1. Skema Lempeng KLT.
Lempeng KLT dan totolan sampel yang terelusi saat praktikum.
0,5 cm
1 cm
6,5 cm

6 cm
No Perlakuan Hasil Pengamatan
1. Ditotolkan pada lempeng KLT GF 254 (6x8cm,
dengan garis awal = 1 cm, garis akhir = 0,5 cm,
dan jarak elusi = 6,5 cm),
KiriKanan
1. Sari 1
2. Rutin
3. Sari 2
4. Kuersetin
5. Sari 3
2. Dielusi pada chamber KLT yang telah berisi
campuran n-butanol : asam asetat : air (3 : 1 : 1)
v/v sebagai eluen,
Ke-5 sampel terelusi
hingga garis akhir.
3. Dikeringkan dengan hair dryer, Lempeng KLT GF 254
telah kering, siap untuk di
deteksi.
4. Dideteksi :
1. Sinar UV 254, ditandai bercaknya,
Sari I = 4,7 cm
Rutin = 4,8 cm
Sari II = 6,5 cm
Kuersetin = 6,3 cm
Sari III = 6 cm
2. Uap amonia, di bawah sinar tampak dan
UV 254, ditandai bercaknya,
3. Pereaksi sitroborat, dipanaskan 110oC
selama 5 menit, di amati di bawah sinar UV
254, ditandai bercaknya,

Sari I = 4,4 cm
Rutin = 4,5 cm
Sari II = 6,5 cm
Kuersetin = 6,3 cm
Sari III = 6,1 cm
Sari I = 4,5 cm
Rutin = 4,5 cm
Sari II = 6,5 cm
Kuersetin = 6,2 cm
Sari III = 6,1 cm
5. Dicatat nilai Rf dan hRf yang diperoleh

hRf = Rf x 100
Rf1, hRf
Sari I = 0,72 cm, 72 cm
Rutin = 0,73 cm, 73 cm
Sari II = 1 cm, 100 cm
Kuersetin = 0,97 cm, 97
cm
Sari III = 0,92 cm, 92 cm
Rf2, hRf
Sari I = 0,68 cm, 68 cm
Rutin = 0,70 cm, 70 cm
Sari II = 1 cm, 100 cm
Kuersetin = 0,96 cm, 96
cm
Sari III = 0,93 cm, 93 cm
Rf3, hRf
Sari I = 0,70 cm, 70 cm
Rutin = 0,70 cm, 70 cm
Sari II = 1 cm, 100 cm

Kuersetin = 0,93 cm, 93


cm
Sari III = 0,93 cm, 93 cm
6. Dicatat warna yang terbentuk Warna1
Sari I = cokelat kehijauan
Rutin = cokelat kehijauan
Sari II = cokelat kehijauan
Kuersetin = ungu pudar
Sari III = ungu pudar
Warna2
Sari I = cokelat kehijauan
Rutin = cokelat kehijauan
Sari II = cokelat kehijauan
Kuersetin = ungu pudar
Sari III = ungu pudar
Warna3
Sari I = cokelat kehijauan,
lebih pudar
Rutin = cokelat kehijauan
Sari II = cokelat kehijauan,
lebih pudar
Kuersetin = ungu pudar
Sari III = ungu pudar
O
O
1
2
3
54
6
7
8
9
10
1'
2'
3'
4'
5'

6'

(8a)
(4a)

C
B
E.2. Pembahasan
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan kromatografi planar dengan fase
diam berupa lapisan yang seragam pada permukaan bidang datar yang didukung
oleh lempeng kaca, plat almunium atau plastic. Fase gerak sebagai pelarut
pengembang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada
pengembangan secara ascending atau karena pengaruh gravitasi pada
pengembangan secara descending. Pemisahan pada KLT yang optimal akan
diperoleh jika pada penotolan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit
mungkin, dan jika penotolan sampel tidak tepat akan menyebabkan bercak yang
menyebar dan puncak ganda. Parameter pada KLT yang digunakan untuk
identifikasi adalah nilai Rf, dua senyawa dikatakan identik jika memiliki nilai Rf
yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang sama. Analisis kuantitatif dengan
KLT dapat dilakukan dengan mengukur langsung lempeng dengan ukuran luas
bercak atau densikometri (Gandjar, 2007).
Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen.
Pemilihan eluen didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan
campuran beberapa cairan yang berbeda polaritas. Kepolaran eluen sangat
berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh. Faktor retensi (Rf)
adalah jarak yang ditempuh oleh komponen dibagi dengan jarak yang ditempuh
oleh eluen. Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen
tertentu. Hal tersebut dapat digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan
senyawa dalam sampel. Senyawa yang mempunyai Rf lebih besar berarti
mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya. Hal tersebut
dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat
pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah (Anonim, 2013).
Keuntungan KLT :
1. Waktu relatif singkat

2. Menggunakan inestasi yang kecil.


3. Paling cocok untuk analisis bahan alam dan obat.
4. Jumlah cuplikan yang dengan sedikit.
5. Kebutuhaan ruang minimum.
6. Penanganan sederhana.
7. Zat yang bersifat asam/basa kuat dapat dipisahkan dengan KLT.
Kelemahan KLT :
1. Hanya merupakan langkah awal untuk menentukan pelarut yang cocok
dengan pada kromatografi kolom
2. Noda yang terbetuk belum tentu senyawa murni.
Terdapat beberapa tahap yang dilakukan pada KLT yaitu penyiapan plat,
pemilihan adsorben, pemilihan pelarut, menentukan sistem pengembang yang
cocok, pengamatan lokasi bercak pada kromatogram, deteksi dan identifikasi
(Kusmardiyani dan Nawawi, 1992). Langkah pertama yang dilakukan untuk
mengidentifikasi flavonoid adalah dengan mempersiapkan fase diam dan fase
gerak yang digunakan sebagai eluen. Fase diam yang digunakan adalah selulosa
GF254, sedangkan fase gerak yang digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air
(3:1:1) v/v dan cuplikan yang digunakan adalah sari I, sari II, sari III, dan
pembanding larutan rutin serta kuersetin. Dengan digunakannya eluen yang
bersifat polar maka senyawa polar akan terelusi lebih dulu dan memiliki Rf yang
lebih tinggi, dibandingkan dengan senyawa non-polar ataupun semipolar. Pada
KLT ini yang diuji adalah senyawa polar yaitu glikosida flavonoid (rutin) dan
senyawa non-polar yaitu aglikon glikosida (kuersetin). Pelarut n-butanol sebagai
pelarut non-polar yang melarutkan senyawa non-polar dan yang melarutkan
senyawa polar adalah air sebagai pelarut polar. Penotolan dilakukan terhadap sari
I, sari II, sari III dan pembanding larutan rutin serta kuersetin, dengan
menggunakan pipa kapiler. Penotolan dilakukan pada plat KLT, dimana jarak
antar totolan sejauh 1 cm. Setelah dilakukan penotoloan, plat KLT kemudian
dideteksi di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm. Pada saat
deteksi di bawah sinar UV diamati bercak flavonoid yang terlihat kemudian
diukur jaraknya dari garis front. Setelah itu, plat KLT diuapkan amonia dan

dideteksi kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254 nm.


Kemudian, langkah selanjutnya di deteksi dengan pereaksi sitroborat, lalu
dipanaskan. Setelah nilai Rf kedua dihitung, plat KLT disemprot dengan pereaksi
sitroborat dan diamati kembali di bawah sinar UV dengan panjang gelombang
254 nm, setelah itu lakukan perhitungan nilai Rf. Nilai Rf dihitung dengan
persamaan (Gandjar, 2007) :
Rf =
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai
perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k) sama dengan 0 yang berarti
solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak (Gandjar dan
Rohman, 2007). Nilai Rf yang diperoleh dari hasil perhitungan dan warna yang
terbentuk kemudian dibandingkan dengan nilai Rf dan warna fluoresens yang ada
dalam pustaka.
Setelah melakukan percobaan Kromatografi Lapis Tipis maka diperoleh
hasil sebagai berikut, hasil yang di amati dibawah sinar UV254 yaitu sari I
menghasilkan jarak
menurut literatur dapat disimpulkan bahwa sari I
mengandung rutin dan sari II mengandung kuersetin karena antara sari I dan rutin
memiliki nilai Rf yang berdekatan dan pada sari II dan kuersetin juga
mengandung nilai Rf berdekatan (Gross, 1991). Pada saat KLT dilihat dibawah
sinar UV bercak yang tampak yaitu rutin manghasilkan 4,1 cm dan sari II
menghasilkan 5 cm, jadi yang mampu berflourosensi hanya rutin dan sari II
karena yang akan tampak pada UV hanyalah zat yang mampu berflouresensi
(Gandjar, 2007). Kemudian, warna yang terbentuk untuk warna yang pertama
adalah sari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari III
menghasilkan warna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing
menghasilkan warna cokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang kedua, untuk
sari I dan sari II menghasilkan warna cokelat kehijauan, sari III menghasilkan
warna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warna
cokelat kehijauan dan ungu pudar. Warna yang ketiga, untuk sari I dan sari II
menghasilkan warna cokelat kehijauan tapi lebih pudar, sari III menghasilkan

warna ungu pudar, untuk rutin dan kuersetin masing-masing menghasilkan warna
cokelat kehijauan dan ungu pudar.
F. Kesimpulan
Dari praktikum Identifikasi Falovonoid dengan Kromatografi Lapis Tipis
dapat ditarik kesimpulan yaitu sebagai berikut :
1. Senyawa golongan flavonoid dapat diidentifikasi dengan metode
kromatografi lapis tipis (KLT) dan spektrofotometer UV-vis.
2. Nilai Rf ditentukan dengan mengukur jarak titik pusat bercak dari titik awal
dibagi dengan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
3. Dengan adanya warna fluoresens itu dapat mengetahui adanya rutin dan
kuersetin karena hanya rutin dan kuersetin yg dapat berpendar pd Rf standar
dan sampel yang telah ditentukan (0-1).
Daftar Pustaka
Anonim, 2008, Singkong Manihot esculenta Crantz, www.plantamor.com,
Diakses pada 08 Juni 2014.
Anonim, 2013, Kromatografi Lapis Tipis.
http://www.ilmukimia.org/2013/05/kromatografi-lapis-tipis-klt.html.
diakses tanggal 9 mei 2014.
Depkes RI, 1979, Farmakope Indonesia Edisi III, Dirjen Ri, Yogyakarta.
Gandjar, Ibnu Gholib dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka
Pelajar, Yogyakarta.
Kusmardiyani, Siti dan Nawawi As'ari, 1992, Kimia Bahan Alam, Pusat antar
Universitas Bidang Ilmu Hayati, Yogyakarta.
Lenny, Sovia, 2006, Karya Ilmiah Senyawa Flavonoida, Fenil Propanoida, dan
Alkaloida, www.library.usu.ac.id. Diakses pada 08 Juni 2014.
Perry R. H., and Green D., 1984, "Chemical Engineer's Hand Book", six edition,
Mc Graw Hill Book Company.
Robbers.J.E., Speedie.M.K., Tyler.V.E., 1996, Pharmacognosy and Pharmaco,
biotechnology.
Sastrohamidjojo. H., 1996, Sintesis Bahan Alam, Gajahmada University Press,
Jogjakarta.

Wagner H.,S. Bladt and EM. Zgainski, 1984, Plant Drugs Analysis., SpringerVerlag., Berlin.
Lampiran 1. Jawaban Pertanyaan.
1. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya?
Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar,
sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau
etanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk
mempercepat pembentukan kristal.Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat
dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat
hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Terlihat berupa tidak
berwarna pada sinar tampak, berwarnabiru keunguan pada sinar UV
254nm,birukeunguan pada sinar UV 366nm, dan memberikan fluoresensi
berwarna biru terang dengan penampak bercak AlCl3.
2. Apakah dasar pemisahan senyawa dengan metode kromatografi lapis tipis?
Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi
lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap
masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase
diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat
memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama.
Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih
dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang
sama (Gandjar, 2008).
3. Berikan 2 contoh fase gerak lain yang bisa digunakan daam identifikasi
flavonoid?
Metal asetat, heksan, methanol. Methanol sifatnya polar. Heksan sifatnya
nonpolar . Metil asetat sifatnya semi polar.