Anda di halaman 1dari 10

BAB I

UJI KUALITATIF
Protein adalah zat gizi yang sangat penting, karena yang paling erat
hubungannya dengan proses-proses kehidupan. Nama protein berasal dari bahasa
Yunani (Greek) Proteus yang berarti yang pertama atau yang terpenting.
Seorang ahli kimia Belanda bernama Mulder, mengisolasi susunan tubuh yang
mengandung nitrogen dan menamakannya protein, terdiri dari satuan dasarnya
yaitu asam amino (biasa disebut juga unit pembangun protein) (Suhardjo dan
Clara, 1992).
Protein merupakan polimer yang panjang dari asam-asam amino yang
bergabung melalui ikatan peptida. Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat
dalam protein adalah karbon 55%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%,
sulfur 1% dan kurang dari 1% fosfor (Winarno, 1991).
Uji kualitatif merupakan suatu pemeriksaan atau proses kimia yang menguji
adanya ion atau unsur-unsur dalam suatu senyawa. Analisis kualitatif
berhubungan dengan identifikasi suatu zat atau campuran yang tidak diketahui
dan mengenali komposisi atau struktur bahan kimia dan bertujuan untuk
menetukan adanya unsur penyusun senyawa organik, karbon hydrogen, halogen,
nitrogen, dan sulfur. Selain itu, setiap senyawa organik mempunyai sifat kelarutan
yang khas, yang meliputi jenis pelarut dan jumlah kelarutannya. Sifat kelarutan
akan membantu mempersempit ruang gerak analisis secara kimia maupun
spektrokpis. Analisis kualitatif umumnya selalu didasari oleh reaksi oksidasi dan
reaksi reduksi. Karbon selalu dioksidasi menjadi CO2, hydrogen selalu dioksidasi
menjadi H2O, nitrogen selalu dioksidasi menjadi N2O5 atau direduksi menjadi NH3,
halogen selalu direduksi menjadi halogenida (Harjadi, 1993).
Penambahan bahan-bahan kimia tertentu pada larutan protein kemungkinan
dapat mengakibatkan larutan protein yang semula tidak berwarna menjadi
berwarna. Reaksi pembentukan warna protein ini sering dipakai untuk
menunjukkan adanya protein atau protein tertentu, walaupun beberapa di antara
reaksi-reaksi ini tidak spesifik karena beberapa zat lain dengan reagen yang sama

memberikan hasil yang sama. Analisis protein secara kualitatif dapat dilakukan
dengan beberapa reaksi yaitu (Sumardjo, 2006):
A. Reaksi Biuret
Jika larutan protein encer yang dibuat basa dengan larutan natrium
hidroksida ditambahkan dengan beberapa tetes larutan tembaga sulfat encer,
larutan tersebut akan terbentuk warna merah muda sampai violet. Reaksi ini
disebut reaksi biuret sebab warna senyawa yang terbentuk sama dengan warna
senyawa biuret bila ditambahkan larutan natrium hidroksida dan tembaga
sulfat.
Warna merah muda atau merah jambu terbentuk apabila larutan protein
yang diselidiki mempunyai molekul yang kecil, misalnya proteosa dan pepton.
Warna violet terbentuk apabila larutan protein yag diselidiki mempunyai
molekul yang besar, misalnya gelatin.
Reaki biuret positif untuk semua jenis protein dan hasil-hasil antara
hidrolisisnya jika masih mempunyai dua atau lebih ikatan peptida, dan negatif
untuk asam amino.
B. Reaksi Ninhidrin
Zat pengoksidasi ninhidrin dengan larutan protein membentuk larutan
berwarna ungu sampai biru. Reaksi ini berjalan dengan sempurna pada pH 5-7
dan sedikit pemanasan.
Reaksi ini berlaku untuk semua protein, hasil antara hidrolisisnya dan hasil
akhir hidrolisisnya yaitu asam amino. Khusus untuk asam amino prolin dan
hidroksi prolin akan terbentuk warna kuning.
C. Reaksi Xantoprotein
Protein yang mengandung residu asam amino dengan radikal fenil dalam
struktur kimianya (protein yang mengandung asam amino fenilalanin atau
tirosin) jika ditambahkan dengan asam nitrat pekat akan terbentuk gumpalan
warna putih. Pada pemansan, warna gumpalan putih tersebut akan berubah
menjadi kuning, yang akhirnya berubah menjadi jingga jika ditambah dengan
larutan basa. Sebenarnya, proses ini adalah proses nitrasi inti benzena pada
asam amino penyusun protein tersebut. Proses ini dapat terjadi jika kulit

terkena asam nitrat pekat, yang segera menjadi kuning karena terjadinya
proses nitrasi inti benzena pada asam amino penyusun kulit.
D. Reaksi Hopkin Cole
Asam glioksilat dan asam sulfat pekat dapat membentuk larutan pekat
berwarna violet pada pencampuran dengan larutan protein yang mengandung
residu triptodan dalam struktur kimianya. Gelatin dan protein-protein lain
yang tidak mempunyai residu triptofan dalam struktur kimiana, dengan reaksi
Hopkins Cole tidak dapat membentuk warna violet. Adanya nitrat, nitrit dan
klorat dapat mengganggu jalannya reaksi Hopkins Cole ini.
E. Reaksi Millon
Reaksi millon digunakan khusus untuk protein yang mengandung asam
amino dengan radikal hidoksi fenil sebagai penyusunnya. Oleh karena itu,
reaksi ini khusus untuk protein yang struktur kimianya mengandung residu
tirosin. Jika larutan protein ini ditambahkan dengan pereaksi millon (larutan
merkuri nitrit dan merkuri nitrat dalam campuran asam nitrit dan asam nitrat),
gumpalan berwarna putih akan terbentuk dan segera berubah menjadi merah
pada pendidihan. Protein derivat sekunder, seperti proteosa dan pepton dengan
pereaksi ini pada pemanasan hanya terbentuk larutan berwarna merah.
F. Reaksi Molisch
Larutan protein majemuk yang mempunyai radikal prostetik karbohidrat,
yaitu glikoprotein atau mukoprotein, pada pencampurannya secara hati-hati
dengan larutan alfanaftol dalam alkohol dan asam sulfat pekat akan
membentuk larutan berwarna violet. Pada proses ini, glikoprotein atau
mukoprotein akan mengalami hidrolisis menjadi protein sederhana dan
karbohidrat. Karbohidrat yang terbentuk dengan alfanaftol dalam alkohol dan
asam sulfat pekat memberikan warna violet.
G. Reaksi Sullivan
Dalam larutan basa, larutan protein yang struktur kimianya memiliki
residu sistein dengan pereaksi Sullivan (natrium 1,2-naftokuinon-4-sulfonat
dan natrium hidrosulfit) dapat membentuk larutan berwarna merah. Intensitas
warna yang terbentuk tergantung pada jumlah residu sistein yang terdapat
pada protein tersebut. Selain dengan pereaksi Sullivan, warna merah protein
ini juga dapat terjadi jika protein tersebut ditambahkan dengan larutan natrium
nitroprusid dalam amonia encer.

H. Reaksi Sakaguchi
Larutan protein yang mempunyai residu asam amino arginin dalam
struktur kimianya jika ditambahkan dengan larutan alfa naftol dan natrium
hipoklorit akan membentuk warna merah. Beberapa senyawa organik lain
yang struktur kimianya mempunyai radikal kuanido memberikan hasil yang
sama pada tes ini. Asam amino arginin dengan kadar 0,0004 mg per ml dengan
tes sakaguchi ini masih memberikan warna merah.

BAB II
UJI KUANTITATIF

Analisis kuantitatif merupakan analisis untuk menentukan jumlah (kadar)


absolute atau relatif dari suatu elemen atau spesies yang ada di dalam sampel
(Gandjar, 2007).
Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: metode
konvensional, yaitu metode Kjeldahl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi) dan
titrasi formol yang digunakan untuk protein tidak terlarut, dan metode
modern,yaitu metode Lowry, metode spektrofotometri visible (biuret) dan metode
spektrofotometri UV yang digunakan untuk protein terlarut.
A. Metode Kjeldahl
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen
total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen.
Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang
sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan
alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke
dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak
mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab
hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa
yang pendek (Maria, 2010).
Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organic
dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil
destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi.
Destilat ditampung dalam larutan asam borat. Selanjutnya ion- ion borat yang
terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl (Maria, 2010).
Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga
tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi (Maria, 2010).
1. Tahap destruksi
Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga
terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen
teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan
berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering
ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1).
Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan
penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi
sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah

disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat


mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik
didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi
rendah atau sebaliknya.
2. Tahap destilasi
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia
(NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar
supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan
cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan
logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap
oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan.
Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan
ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk
mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator
misalnya BCG + MR atau PP.
3. Tahap titrasi
Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam
khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar
(0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan
menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan
indikator PP.
%N = N. NaOH 14,008 100%
Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya
asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi
menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir
titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah
muda.
%N = N.HCl 14,008 100 %
Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan
mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini
tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.
B. Metode Titrasi Formol

Titrasi formol merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengetahui


kadar protein dalam suatu bahan. Titrasi formol hanya tepat digunakan untuk
menentukan suatu proses terjadinya pemecahan protein dan kurang tepat
untuk penentuan jenis protein (Achmad, 2011).
Titrasi formol asam amino pada dasarnya merupakan suatu titrasi asam
basa, dimana penambahan formaldehid pada asam amino dimaksudkan agar
pH buffer gugus amino lebih rendah dari pH asalnya, sehingga gugus amino
dapat dititrasi secara kuantitatif dengan titik akhir titrasi ditunjukkan
munculnya perubahan warna dari indikator (Achmad, 2011).
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan
formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini
berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi
antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah PP, akhir titrasi bila tepat terjadi
perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik
(Achmad, 2011).
C. Metode Lowry
Reagen pendeteksi gugus-gugus fenolik seperti reagen folin dan ciocalteu
telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1951) yang
kemudian dikenal dengan metode Lowry. Dalam bentuk yang paling
sederhana reagen folin ciocalteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam
protein) karena kandungan fenolik dalam residu tersebut mampu mereduksi
fosfotungsat dan fosfomolibdat, yang merupakan konstituen utama reagen
folin ciocalteu, menjadi tungsten dan molibdenum yang berwarna biru. Hasil
reduksi ini menunjukkan puncak absorbsi yang lebar pada daerah merah.
Sensitifitas dari metode folin ciocalteu ini mengalami perbaikan yang cukup
signifikan apabila digabung dengan ion-ion Cu (Handayani, 2010).
Metode Lowry mengkombinasikan pereaksi biuret dengan pereaksi lain
(Folin-Ciocalteauphenol) yang bereaksi dengan residu tyrosine dan tryptophan

dalam protein. Reaksi ini menghasilkan warna kebiruan yang bisa dibaca di
antara 500 750 nm, tergantung sensitivitas yang dibutuhkan. Akan muncul
puncak kecil di sekitar 500 nm yang dapat digunakan untuk menentukan
protein dengan konsentrasi tinggi dan sebuah puncak besar disekitar 750 nm
yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein dengan konsentrasi
rendah (Handayani, 2010).
D. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi
adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum
elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang
sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat
dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat
dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak
(visible) (Mulja, 1995).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah
lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram
merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten
mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C) dibanding logam lainnya.
karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu (Mulja, 1995).
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang
memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode
spektrofotometri visible (Khopkar, 1990).
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih
dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan
menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul
spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga
produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil
(Sumardjo, 2006).

Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble
protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu,
larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa
digunakan adalah reagent Folin (Sumardjo, 2006).
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa,
ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang
berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm.
Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa
kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein
terlarut dalam sample (Sumardjo, 2006).
E. Metode Spektrofotometri UV
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV
berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu
deuterium (Mulja, 1995).
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen
yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium
mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki
satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa
Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua
pertikel (Mulja, 1995).
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang
dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki
warna. Bening dan transparan (Khopkar, 1990).
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna
dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa
meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus
dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada
spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada
partikel koloid apalagi suspensi (Sumardjo, 2006).
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika
menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna

dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample


dapat langsung dianalisa (Sumardjo, 2006).
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang
gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap
sample (Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar
(Sumardjo, 2006).
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding
spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus
hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa
lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini
berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa (Sumardjo, 2006).
Asam amino penyusun protein diantaranya adalah triptofan, tirosin dan
fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbsi
maksimum pada 280 nm, sedang untuk tirosin mempunyai absorbsi
maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyerap sinar kurang kuat dan pada
panjang gelombang lebih pendek. Absorpsi sinar pada 280 nm dapat
digunakan untuk estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya
lebih teliti perlu dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan
pengukuran absorpsi pada 260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat
kemungkinan kontaminasi oleh asam nukleat. Rasio absorpsi 280/260
menentukan faktor koreksi yang ada dalam suatu tabel (Sumardjo, 2006).