Department of Food and Agricultural Products Processing Technology

Faculty of Agricultural Technology Gadjah Mada University

Jalan Flora No. 1, Sleman, Yogyakarta 55281 Indonesia

ELECTROPHORESIS
ELECTROPHORESIS
Yunika Mayangsari, S.Si., M. Biotech
2012

Warming up

Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya
dalam sebuah medan listrik.

Prinsip kerja :

Na+Cl-

cathode

anode

Sifat partikel bermuatan

Bergerak ke kutub yang berlawanan
dengan muatannya (partikel/ion positif
bergerak ke katoda dan sebaliknya)

Perbedaan muatan dan ukuran partikel
mengakibatkan laju bergerak berbeda

terjadi pemisahan

Jenis elektroforesis

Elektroforesis kertas dan Selulosa

Asetat

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)

Prinsip kerja keduanya sama, perbedaan

pada media penyangga

Berperan pada pemisahan protein atas
dasarmobilitasnya pada pH tertentu

Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan
bergerak dalam medan listriknya.

Titik isoelektrik ??

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)

Elektroforesis Kertas, menggunakan kertas
saring sebagai medium penyangga, sesuai untuk
latihan
murah ; kelemahan : lama (running
semalam) dan pemisahan kurang baik.

Elektroforesis Selulosa Asetat, selulosa asetat
sebagai medium penyangga, keuntungan: elusi
lebih baik, shg pemisahan lebih baik, running lbh
cepat dibanding kertas (1 jam).


Elektroforesis gel

Matriks berupa polimer berpori

Ukuran pori (konsentrasi materi

polimer) menentukan nilai koefisien

gesekan (f)
semakin besar
prosentase gel semakin kecil ukuran
pori

Matriks yang biasa digunakan:

Poliakrilamida
Agarose (polisakarida)

Struktur agarose dan poliakriamida

Aplikasi

Elektroforesis

Analisis protein (ukuran)
SDS-

PAGE

Analisis DNA (ukuran,
sekuensing)
Agarose

APPLICATION OF
Electrophoresis Gel

Separation of protein

mixture
Separation of glycoprotein
Lipids separation
Nucleic acid (DNA, RNA)
Enzymes mixture
separation

10

Analisis protein (SDS-PAGE)

Molekul Protein

Muatan bervariasi
Muatan per massa bervariasi

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS PAGE)

Digunakan secara luas untuk analisis protein

lebih menguntungkan dibanding kertas dan
selulosa asetat
pemisahan lebih baik

Medium penyangga : hasil polimerisasi akrilamida
dan bis-akrilamida, dengan katalis amonium
persulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED)

Pada sampel protein, ditambahkan SDS dan
merkaptoetanol untuk merusak struktur 3 dimensi
protein
(remember: reduksi ikatan ?)

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS PAGE)
(lanj.)

Pemisahan

molekul didasarkan pada

perbedaan berat molekul.

Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran
pori yang terbentuk, makin rendah
konsentrasi akrilamid yang digunakan,
makin besar ukuran pori gel, gel semakin
lunak dan mudah rapuh.


Hubungan antara konsentrasi akrilamid dan pori-pori

(sumber : Kurniawati dan Wanandi, 2001)

% Poliakrilamid

Ukuran pori (nm)

4.4

3.6

10

2.6

20

1.8

30

1.3

SDS (sodium dodesil sulfat)

SDS berfungsi menghilangkan perbedaan muatan dan

perbedaan konformasi diantara protein-protein yang

ada pada sampel, dengan cara memberikan muatan
negatif.

Pemanasan sampel dilakukan untuk tahap denaturasi
protein. (remember biokimia dasar: denaturasi??)

Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang
dan bermuatan negatif, muatan tidak dipengaruhi pH
(kisaran pH 7-10)

Sehingga, migrasi polopetida hanya berdasarkan berat
molekulnya. Makin besar berat molekul, makin
lambat migrasinya dalam gel elfo.

Sistem Buffer

Buffer digunakan untuk menjaga kestabilan pH

medium pada elfo

Pada umumnya inert, akan tetapi buffer
tertentu, co: borat, dapat membentuk kompleks
dengan medium seperti pati, sehingga tdk tepat
digunakan untuk elfo

Biasanya digunakan konsentrasi 0,05 0,10 M

semakin besar molaritas , semakin tajam
zona pemisahan yang dihasilkan, akan tetapi
1
= m c 2 waktu pemisahan lebih lama
2

Sodium phosphate buffer has higher ionic
strength than tris-hydrochloride buffer

= ionic strength ; m = molarity of an ion ; c =
the charge carried by the ion

SDS-PAGE : Sistem Buffer

Diskontinyu

Sistem buffer yang umum digunakan pada

SDS-PAGE adalah sistem buffer Diskontinyu

Sistem ini menggunakan ion buffer sample
(Komposisi dan pH) yang berbeda dalam gel
dengan larutan buffer elektroda.

Keunggulan : pemisahan protein
berlangsung lebih baik dan lebih tajam

Gel elektroforesis
Gel yang digunakan dalam sistem ini terdiri atas gel
penumpuk (Stacking gel) yang berpori besar dan Gel
pemisah (separating gel/ resolving gel) yang berpori
lebih kecil.
Molekul sampel yang melewati gel penumpuk berada di
atas gel pemisah dan sampel diletakkan di atas gel
penumpuk.
Sampel yang tertumpuk (stacked) pada gel penumpuk
(pori besar), setelah dialirkan arus listrik maka
molekul akan bergerak melewati pori-pori gel
pemisah, dan terpisahkan berdasar BM.

Recipe for Discontinuous SDS PAGE

(example)
Stock solution

Stacking gel

Gel concentration, %
20.0

10.0

5.0

Reservoir buffer, ml

Acrylamide-bisacrylamide
(30:0.8)

2.5

20.0

10.0

5.0

Stacking gel buffer stock

5.5

Resolving gel buffer stock

3.75

3.75

3.75

Reservoir buffer stock

100

10% SDS

0.3

0.3

0.3

1.5% ammonium
persulfate

0.2

1.5

1.5

1.5

Water

11.3

4.45

14.45

19.45

900

TEMED

0.015

0.015

0.015

0.015

Stacking gel
Resolving gel
Resolving buffer
08.01.14

: 0.0125M Tris-HCl, pH 6.8

: 0.375M Tris-HCl, pH 8.8
: 0.025M Tris, 0.192M glicine, pH 8.3
suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

19

Separating Gel Preparation

Prepared all reagents needed

Mix all except ammonium persulfate and

TEMED
Degassed the solution under a vacuum to
prevent air bubbles during polymerization
Add ammonium persulfate and TEMED, soon
the gel is ready to be polymerized
Before the gel polimerizes, introduce solution
into gel sandwich using pipet as soon as
posible
Stop when gel solution reach about 1.5 cm from
top of front plate or 0.5 cm below level where
teeth of comb will reach
Gently layer about 1 cm of water on top of
separating gel solution
Allow gel to polymerize, 30-60 minutes
08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

20

Stacking Gel Preparation

Prepare all reagents need for stacking gel

Pour off water covering separating gel

Mix all reagents except ammonium persulfate

and TEMED
Degassed the solution under a vacuum to
prevent air bubbles during polymerization
Add ammonium persulfate and TEMED, soon
the gel is ready to be polymerized
Before the gel polimerizes, pipet stacking gel
solution onto separating gel until solution
reaches top of front plate
Carefully insert comb into gel sandwhich
until bottom of teeth reach top of front plate

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

21

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Sample must be protein isolate

To prepare a sample protein :

Extraction

Determination of protein content

Concentrating protein solution

Protein extraction :

Samples may be taken from whole tissue or from cell culture. In most cases,

solid tissues are first broken down mechanically using a blender, homogenizer,
or by sonication

A combination of biochemical and mechanical techniques including various
types of filtration and centrifugation can be used to separate different cell
compartments and organelles

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

22

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Determination of protein content :

Absorbance at 280 nm (absolute method; rapid method)

Bradford (biorad) assay : reaction of bradford reagent (serva

blue G) with protein gives a blue color which can be measured at

595 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin
(BSA)

Lowry assay : reaction of lowry reagent (folin-ciocalteu phenol)
with protein gives a blue color which can be measured at 750 nm.
The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

Bicichoninic acid (BCA) assay : reaction of BCA and protein
gives a blue color which can be measure at 562 nm. The standar
curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

23

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Concentrating sample protein :

Using trichloro acetic acid (TCA)

Sample and TCA solution is mixed, incubated in ice for 30 minutes.

The prcipitate protein is collected by centrifugation, washing with
ethanol-ether (1:1) to remove TCA

Using organic solvent : acetone

Cold acetone is added to sample, mixed, and incubated at -20oC for

10 minutes. The precipitae protein is collected by centrifugation
(10.000 x g for 5 minutes)

Polyethylene glycol (PEG) precipitation : solution of 50%

polyethylene glycol

Ultrafiltration

Lyophylization (freeze drying)

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

24

Loading sample

The solution of proteins to be analyzed is

mixed with SDS, an anionic detergent

which denatures secondary and non
disulfidelinked tertiary structures, and
applies a negative charge to each protein
in proportion to its mass. Heating the
samples to at least 60oC shakes up the
molecules, helping SDS to bind

Spin down protein solution for 1 second

Introduce sample solution into well using
syring. Be careful to avoid introducing air
bubbles as this allow some of sample to be
carried to adjacent well

08.01.14

Note :

A tracking dye may be added to the protein to allow the
experimenter to track the progress of the protein solution
through the gel during the electrophoretic run

Precipitation of protein in sample buffer may be due to
denatured protein, too litle SDS, too litle reducing agent,
overlay acidic condision, or presence of pottasium which
precipitates SDS

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

25

Running a gel

Attached electrode plugs to

proper electrodes
Turn on power supply and set
the voltage to 200 V and tyhe
ampere about 60-110 mA
depend on gel thickness
Turf off power supply
Remove electrode plugs from
electrodes
Carefully remove a spacer

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

26

STAINING

Protein :

Coomassie blue R250 stain : coomassie blue R-250, methanol, glacial acetic

acid

Silver stain : silver nitrate, NaOH, ammonium hydroxide, citric acid,
formaldehyde

Glycoprotein: basic fuchin sulfite stain

Lipids : sudan black B. Staining is carried out before electrophoresis

Nuclein acid :

RNA with pyronine Y : pyronine Y, lanthanum acetate, acetic acid, methanol

Native DNA with methylene green : methylene green, acetate buffer pH 4,1

Denatured DNA with pyronine B

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

27

Staining and destaining a gel

with coomassie blue

Pick up the gel and transfer it into a small

container containing coomasie stain solution

Agitate for 5-20 minutes depend upon the gel
thickness
Cover container with lid or plastic wrap during
staining and destaining
Pour out stain and rinse the gel with water
Add commasie destain and agitate overnight
Rinse the gel with water

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

28

STAINING WITH COOMASSIE BLUE

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

STAINING WITH SILVER NITRATE

29

Gel elektoforesis

SEE YOU NEXT MEETING

IDENTIFICATION / INTERPRETATION
Calculate retardation factor (Rf) of sample and standard
If Rf sample and Rf standard is same then it can be assumed sample is same with standard

08.01.14

suwedo hadiwiyoto : elektroforesis

32

Gel Agarosa (Identifikasi

DNA/RNA)

Gel ini tersusun atas agarosa.

Agarosa untuk kualifikasi fragmen-fragmen DNA

dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga 20.000

kb.

Agarosa tidak bersifat toksik, kompleks berupa bubuk
yang terdiri dari campuran polimer dengan 2 unit
dasar galaktosa, agarosa dan agaropektin.


Agarosa dilarutkan dalam cairan buffer mendidih dan

akan membentuk gel pada suhu sekitar 38 derajad C.

Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer yang
mengandung air dalam kadar tinggi, struktur seratnya
baik, ukuran porinya besar dan tahan terhadap
gesekan.

Molekul DNA bermuatan negatif di dalam medan
listrik dan molekul DNAbergerak melalui gel pada
kecepatan yang berbeda bergantung pada ukurannya.

Keuntungan : DNA dapat dideteksi

 DNA bermuatan negatif.

Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif
(anode).
Gel agarose digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan terpisah
berdasarkan ukurannya.

DNA

Power

+
Gel agarose berpori-pori, DNA
bergerak melewati
Scanning Electron Micrograph of


Agarose Gel (11 m)

Seberapa cepat DNA migrasi?

Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose
ukuran DNA!
*DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang
elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya
DNA

kecil
besar

Power

Membuat Gel Agarose

Gel agarose dibuat dengan

mendidihkan serbuk agarose dalam
larutan bufer.

Bufer

Labu utk mendidihkan

Agarose

Electrophoresis Equipment
Power supply

Tutup

Tangki Gel

Kabel


Casting tray
Sisir Gel 

Gel casting tray & combs

Preparing the Casting Tray

Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting
tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the
surface of the casting tray.

Agarose

Larutan bufer

Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is

several times larger than the volume of buffer.

Membuat Gel Agarose

Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri).

Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan).

Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose
to dissolve.
***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and
may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

Menuangkan gel

Diamkan larutan agarose mendingin (~60C) dan kemudian

tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung
udara.

Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel.

Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot
sisir dan selotape.

Letakkan gel dalam alat elektroforesis.

DNA

buffer 

wells

Cathode
(negative)

Anode

(positive)

Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap

sumuran terisi bufer.

Preparasi Sample
Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel
masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat
sampel.

6X Loading Buffer:

Bromophenol Blue (for color)
Glycerol (for weight)

Memasukkan sampel ke Gel

Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample.
The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the
gel with the pipette tip.

Running the Gel

Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power

supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode
(merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode

Cathode
(-)

wells
Bromophenol Blue

DNA
(-)

Gel
Anode
(+)

Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar.

Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.

Standar tangga DNA

12,000 bp
5,000

DNA
migration
Note: bromophenol
blue migrasi = 300 bp
DNA

bromophenol blue

+

2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100

Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to
determine the sizes of unknown DNAs.