TRANSCRIPCION EN PROCARIOTAS

El dogma central de la biologa molecular y el flujo de la informacin gentica

Transcripcin

Traduccin

DNA

RNA

PROTEINA

Funciones del RNA

a) Material gentico: puede replicarse y retrotranscribirse a DNA. Ejemplos, virus del mosaico
del tabaco y retrovirus.
b) Funcional: RNA ribosmico (rRNA), transferente (tRNA) y otros. No se traducen y
constituyen productos finales de la expresin gnica; regulatoria y catlisis.
c) Informativa: RNA mensajero (mRNA). Se traduce a protenas.

Molculas de RNA en E.coli

Tipo

Cantidad relativa (%)

RNA ribosmico
(rRNA)

80

RNA de
transferencia (tRNA)
RNA mensajero
(mRNA)

15

Coeficiente de
sedimentacin (S)
23
16
5
4

Masa (kDa)
1.2 x 103
0.55 x 103
3.6 x 101
2.5 x 101

Nmero de
nucletidos
3700
1700
120
75

Heterogneo

COMPARACION ENTRE REPLICACION Y TRANSCRIPCION

SIMILITUDES
FENOMENO PROCESIVO
POLARIDAD 5 3
SE UTILIZA COMO MOLDE UNA CADENA DE DNA
COMPLEMENTARIDAD DE BASES
DIFERENCIAS
REPLICACION

TRANSCRIPCION

ADN POLIMERASA
dATP, dGTP, dCTP y dTTP
TODO EL CROMOSOMA
UNA RONDA POR CICLO
DOS CADENAS
CON CEBADOR
ACTIVIDAD CORRECTORA

ARN POLIMERASA
ATP, GTP, CTP y UTP
UNO O POCOS GENES
VARIOS ARN POR GEN EN CADA CICLO
UNA CADENA
SIN CEBADOR
SIN ACTIVIDAD CORRECTORA

Reaccin catalizada por la RNA polimerasa

Los tres tipos de RNA celular en E.coli son sintetizados por la misma RNA
polimerasa segn las instrucciones dadas por un DNA molde.
REACCION GLOBAL
RNA polimerasa
(NMP)n + NTP
RNA

(NMP)n + 1 + PPi
RNA alargado

La RNA polimerasa de E. coli requiere los siguientes componentes para la

sntesis de RNA:
1) Un molde. Preferentemente es un DNA de doble cadena. Tambin
puede servir como molde un DNA monocatenario.
2) Precursores activados. Se requieren los cuatro nuclesidos trifosfato;
ATP, GTP, CTP y UTP.
3) Un in metlico divalente. Son eficaces el magnesio y el manganeso.
La RNA polimerasa cataliza la iniciacin y la elongacin paso a paso de
las cadenas de RNA.

Mecanismo de la reaccin catalizada por la RNA polimerasa

Composicin de la RNA polimerasa

Es un enzima con un peso molecular de unos 500 kDa formado por cinco clases de
subunidades. La composicin subunitaria del enzima completo, llamado holoenzima, es
2 70 y .
Subunidades de la RNA polimerasa de E. coli
Subunidad

Gen
Rpo A

Nmero
2

Masa (kDa)
37

Funcin
Iniciacin de la cadena, interaccin con las protenas
reguladoras y elementos promotores corriente arriba

Rpo B

151

Rpo C

155

Iniciacin y elongacin de la cadena, forma enlaces

fosfodister
Unin al DNA

70

Rpo D

1
1

70
11

Reconoce al promotor e inicia la sntesis

Desconocida

Diferentes Factores reconocen promotores con diferentes secuencias consenso

Gen
rpoD
rpoH
rpoN
fliA

Masa (kDa)
70
32
54
28

Uso
General
Choque trmico
Nitrgeno
Flagelar

Secuencia - 35
TTGACAT
CCCTTGAA
CTGGNA
CTAAA

Separacin
16-18 pb
13-15 pb
6 pb
15 pb

Secuencia - 10
TATAAT
CCCGATNT
TTGCA
GCCGATAA

Funciones de la RNA polimerasa.

a) Localiza en el DNA los centros de iniciacin.
b) Desenrrolla un tramo corto del DNA helicoidal para producir un molde de DNA de
un solo filamento, del cul tomara instrucciones.
c) Selecciona un ribonuclesido trifosfato correcto y cataliza la formacin de un
enlace fosfodister.
d) Localiza las seales de terminacin
e) Interacciona con las protenas activadoras y represoras que modulan la velocidad
de transcripcin.

Tecnica de huellas dactilares con DNasa I como herramienta para identificar los
lugares del DNA que unen protenas especficas.

Estudios del promotor

Promotor A3 de T7

Promotor A3 de T7
- resistentes a la metilacin
- ms vulnerables a la metilacin
- * purinas metiladas que interfieren con la unin
- contactos de fosfatos

Las dos regiones conservadas estn

separadas por dos vueltas de hlice

Identificacin de los residuos G que contactan

con la RNA polimerasa en el promotor del
triptfano de E. coli

La RNApolimerasa de E.coli unida al DNA. Por

conveccin, el sitio de iniciacin de la transcripcin suele
anotarse +1. Los pares de bases que se extienden en la
direccin de avance de la transcripcin se dice que estn
corriente abajo del sitio de inicio; los que se extienden
en la direccin opuesta estn corriente arriba. La
subunidad 70 se une a secuencias especficas cerca de las
posiciones -10 y -35 en el promotor. Las subunidades se
ubican cerca del DNA en direccin corriente arriba. Las
subunidades y se asocian con el sitio de inicio.

Visin general del proceso de transcripcin

La Sntesis de RNA comienza en los promotores y los acontecimientos ms importantes son:
Fase de Iniciacin:
a) Unin a los sitios de iniciacin en el DNA
b) Comienzo de la transcripcin
c) Desalojo del promotor
1 Unin de la RNA polimerasa al DNA y migracin hacia un lugar de iniciacin.

2 - Formacin de complejo promotor cerrado

- Complejo dbil Ka = 107108 M-1
- Vida media de unos 10 seg
- Unin de tipo electrosttico
(dependiente de la fuerza inica)

3 - Formacin de un complejo promotor abierto

-Se desenrolla el DNA desde 10 a + 1
-Complejo estable Ka = 1012 M-1
-Estable al aumento de la fuerza inica
-Depende de la temperatura
-Isomerizacin dependiente de Mg2+,
( aumenta la abertura desde 12 a + 2)

4 - 2 centros para la fijacin de NTP

- Iniciacin: especfico para nucletidos purnicos
semisaturacin 100 M
- Elongacin: semisaturacin 10 M

5 - Comienza la sntesis de RNA con una purina

- Direccin 5 3
- La mayor parte de las iniciaciones son abortivas
(complejos inestables?)
- Despus de la transcripcin de unos 10 nucletidos
se elimina la subunidad . Queda un complejo
estable y comienza la fase de elongacin.

Fase de elongacin
BURBUJA DE TRANSCRIPCION

La fase de elongacin de la transcripcin comienza despus de la

formacin de unos pocos (9-10) enlaces fosfodister y la eliminacin de la
subunidad .

Modelo de una burbuja de transcripcin durante la elongacin del

transcripto de RNA. El DNA dplex se desenrolla en el extremo anterior de
la RNA polimerasa y se rebobina en su extremo posterior. La hlice hbrida
RNA-DNA gira sincrnicamente.

Se han calculado las longitudes del DNA desenrollado y del hbrido

DNA-RNA a partir de las reactividades de los complejos de transcripcin
con reactivos como el KMnO4, que oxida las bases en los cidos nucleicos
de cadena simple. Mediante la tcnica de la huella se determina la longitud
del DNA en contacto con el enzima. Seis o siete nucletidos del RNA
detrs del DNA hbrido estn protegidos del ataque de la ribonucleasa
mediante su unin al enzima.

Retroceso de un complejo de elongacin

Actividad RNasa intrnseca a la RNA pol. Protenas GreA y GreB

Fase de terminacin
A) las regiones transcritas de los moldes de DNA contienen seales de terminacin. Una de ellas, es
una regin palindrmica rica en GC seguida de una regin rica en AT. El RNA transcrito de sta
secuencia es autocomplementario.
B) Terminaciones dependientes de
C) Protenas antiterminacin
D) Seales de terminacin especializadas llamadas atenuadoras

- hexmero/ 72 Nucletidos
-RNA-DNA helicasa
-ATPasa/ RNA monocatenario
-Activacin por secuencias no
contiguas

Fago M 13

Seales antiterminacin
N Protena codificada por el fago que impide la terminacin de la transcripcin
NUT (N-utilization) secuencia especfica entre el promotor y el sitio de terminacin
a) Un tallo asa (horquilla) llamado caja B que interacta con N
b) Una secuencia lineal de unos 12 nucletidos llamada caja A, que interacta con
Nus B y S 10
NUS (N-utilization substances) protenas celulares para la utilizacin de N
a) NUS A factor de elongacin
b) NUS B ?
c) NUS E (S 10) protena de la subunidad pequea del ribosoma
d) NUS G?

Antiterminacin por la protena N del fago y protenas celulares de E. coli. Despus de

que se reconoce la caja del sitio Nut y se une a ella, la protena N interacta con el complejo
Nus A-polimerasa. La posterior fijacin rpida de Nus B, Nus G y S 10 produce un complejo
de antiterminacin estabilizado por mltiples contactos protena-protena. Mientras la
polimerasa se desplaza alo largo del molde de DNA alejndose del sitio Nut, de manera que
se forma un asa de RNA de tamao cada vez mayor. El complejo impide la terminacin, y la
transcripcin prosige. Se muestra la inhibicin de la accin de terminacin del factor
hexamrico; la antiterminacin tambin se produce en sitios independientes.

INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCION
Rifampicina. Antibitico que inhibe la RNA polimerasa in vitro y bloquea la sntesis de
RNAr, RNAt y RNAm in vivo
-amanitina. Toxina contenida en la seta venenosa Amanita. Inhibe las RNA
polimerasas eucariotas II y III, pero predominantemente la RNA polimerasa II
Cordicepina. Terminador de cadena de la transcripcin, el nucletido de la cordicepina
se incorpora a la cadena en crecimiento y esta se para, ya que carece del grupo 3 OH a
partir del cul continuar
Actinomicina D. Se une al DNA intercalandose entre los pares de bases G-C
adyacentes y los brazos del polipptido cclico llenan el surco estrecho prximo.

Modificaciones post-transcrpcionales de los RNA ribosmicos y transferentes.

Procesamiento de transcritos de pre-rRNA en bacterias
-Siete copias en el genoma de E. coli. Difieren en nmero, localizacin e identidad
de los tRNA incluidos en el transcrito primario.
Promotores

Opern

Bases

1 RNasa III
2 RNasa P
3 RNasa E

Nucleasas especficas

Modificaciones postranscripcionales de los tRNA en bacterias

Escisin y modificacin qumica
- Precursores mayores; transcriptos que poseen de uno a siete tRNA 1- Endonucleasa corta por el lado 3.
2- RNasa D, exonucleasa, hasta dos nucletidos de la secuencia CCA- 3
3- RNasa P, genera el extremo 5
4- RNasa D, elimina los dos nucletidos del extremo 3, genera la secuencia CCA- 3
4a- Nucleotidil transferasa aade el trinucletido CCA al extremo 3, si ste est ausente
5- Modificacin enzimtica de las bases: pseudouridinas, 2 isopenteniladenosina,
o2 -metil guanosina, 4-tiouridina, etc.

Maduracin del tRNAtyr de E. coli

Mtodo de extensin del cebador para localizar el extremo 5 de un transcrito

Mtodo de cartografiado con nucleasa S1 para identificar el extremo 5 de un RNA

MAXAM GILBERT

SANGER