Anlisis de la funcin mitocondrial y localizacin durante Embrionarias

Humanas Diferenciacin de Clulas Madre En Vitro

Andrew Prowse BJ 1 *, Fenny Chong 1 , David A. Elliott 2 , Andrew G. Elefanty
2,4 , Edouard G. Stanley 2,4 , Peter P. Gray 1 , Trent Munro P. 1 , Geoffrey W.
Osborne 1,3 1 El Instituto Australiano de Bioingeniera y Nanotecnologa de la
Universidad de Queensland, Santa Luca, Australia, 2 de Monash Inmunologa y
Stem Cell Laboratorios, Universidad de Monash, en Clayton, Australia, 3 de
Queensland Brain Institute, la Universidad de Queensland, Santa Luca,
Australia, el Instituto de Investigacin de Nios Murdoch 4, La Real Hospital de
Nios, Parkville, Australia Abstracto De clulas madre de embriones humanos
derivados (clulas madre) son prometedores como viables las opciones de
terapia celular para mltiples trastornos en diferentes tejidos. Los avances
recientes en la biologa de clulas madre han llevado a la produccin fiable y
detallada molecular caracterizacin de una gama de tipos de clulas. Sin
embargo, el papel de las mitocondrias durante la diferenciacin todava tiene
que ser completamente dilucidado. Las mitocondrias median unas clulas que
responden a exigencias alterados de energa (por ejemplo, la contraccin de
los cardiomiocitos) y, como tal, el fenotipo mitocondrial es probable que
cambie durante el proceso dinmico de hESC diferenciacin. Demostramos que
la manipulacin de la biognesis mitocondrial altera compromiso
mesendoderm. Para investigar la localizacin mitocondrial durante la
especificacin de linaje temprana de hESCs hemos desarrollado una lnea
reportero mitocondrial, KMEL2, en el que las secuencias que codifica la
protena verde fluorescente (GFP) estn dirigidos a la mitocondria. La
diferenciacin de las lneas KMEL2 en los tres capas germinales mostraron que
las mitocondrias en estos progenie diferenciada son GFP positiva. Por lo tanto,
hESCs KMEL2 facilitar el estudio de las mitocondrias en una gama de tipos de
clulas y, sobre todo, permitir el anlisis en tiempo real a travs de las
mitocondrias la etiqueta GFP. Cita: Prowse ABJ, Chong F, Elliott DA, Elefanty AG,
Stanley EG, et al. (2012) Anlisis de la funcin mitocondrial y localizacin
durante Embrionarias Humanas Diferenciacin de clulas madre in vitro. PLoS
ONE 7 (12): e52214. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214 Editor: Yao Liang
Tang, de la Universidad de Cincinnati, Estados Unidos de Amrica Recibido 16
de agosto 2012; Aceptado 09 de noviembre 2012; Publicado 19 de diciembre
2012 Copyright: SS 2012 Prowse et al. Este es un artculo de acceso abierto
distribuido bajo los trminos de la licencia Creative Commons Attribution
License, que permite el uso ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier
medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan. Financiacin: Los
autores desean agradecer a El Consejo Australiano de Investigacin (ABJP, PPG,
EDAD, EGS), el Instituto Australiano de Bioingeniera y Nanotecnologa
(http://www.aibn.uq.edu.au/), la Salud y el Consejo Nacional de Investigacin
Mdica (NHMRC) de Australia (DAE, EDAD, bienes y servicios ambientales) y la
de Qatar Fondo Nacional de Investigacin (DAE, EDAD, EGS) para su

financiacin. AGE y bienes y servicios ambientales son mayores becarios de

investigacin de la NHMRC. Los financiadores no tena papel en el diseo del
estudio, la recopilacin de datos y anlisis, decisin de publicar, o la
preparacin del manuscrito. Conflicto de intereses: Los autores han declarado
que no existen conflictos de intereses. * E-mail: a.prowse@uq.edu.au
Introduccin Las clulas madre embrionarias humanas (hESCs) son clulas
pluripotentes que tienen la capacidad de diferenciarse en mltiples tipos de
clulas de la cuerpo de un adulto. Estas poblaciones de clulas diferenciadoras
tienen una amplia gama de perfiles metablicos y los requisitos de energa.
Condrial dria, como las centrales elctricas de energa responsables de la
produccin de ATP, desempear un papel fundamental suministrar la energa
requerida durante la produccin y la especificacin de todos los linajes
celulares. Caracterizacin de diferentes tipos de clulas basados en las
propiedades y mitocondriales localizacin [1,2] indica el fenotipo mitocondrial
es una consideracin importante en el anlisis de clulas madre diferenciadas
progenie. Sin embargo, estudios recientes sugieren que los embriones
fecundados in vitro utilizados para derivar hESCs frecuentemente contienen
ADN mitocondrial mltiple mutaciones [3,4,5]. En este contexto, cabe destacar
que mitocondrias trastornos drial como Ataxia de Friedreich [6] o autosmica
ataxia espstica recesiva de Charlevoix-Saguenay [7] son a menudo celular
tipo especfico. Dada esta asociacin de la disfuncin mitocondrial con la
enfermedad humana, conocimiento del fenotipo mitocondrial puede ser
importante para todas las aplicaciones basadas en clulas madre en el futuro
la medicina regenerativa. Las mitocondrias se heredan por va materna
orgnulos intracelulares con un genoma 16,6 kB [8]. Los codifica el genoma
mitocondrial para 13 de las 80 subunidades de la cadena de transporte
electrnico (ETC) responsable de la produccin de ATP en el punto final de
oxidativo fosforilacin. El genoma mitocondrial tambin codifica 22 ARNt y
ARNr 2 que, en un bucle de autorregulacin, estn involucrados en la sntesis
de las 13 subunidades derivadas mitocondrial de la ETC (revisado en [9]).
Replicacin mitocondrial, herencia, mantenimiento y funcionamiento son
controlados por un estimado de 1.500 genes codificados nucleares [10]. Dos
protenas codificadas nucleares en gamma en particular, la ADN polimerasa
(POLG) y mitocondrial Un factor de transcripcin (TFAM) estn involucrados en
el ADN mitocondrial la replicacin y la transcripcin [11]. Cambios en los
niveles de expresin de TFAM y POLG pueden estar directamente relacionados
con las variaciones en la biognesis mitocondrial y se ha demostrado que estar
presente en niveles diferentes dependiendo del tipo de clula, etapa de
diferenciacin y tejido de origen [12,13]. Clulas madre embrionarias humanas
tienen relativamente pocas mitocondrias y tienen mal crestas desarrollados
[14,15] con las clulas predominantemente depender de gluclisis para la
produccin de energa [16,17]. Las mitocondrias en hESCs aparecer punteada,
estn localizados en la periferia del ncleo (Perinuclear) y tiene una capacidad
oxidativa restringido [15,18,19]. A principios de diferenciacin, las mitocondrias

se someten extensa distribucin y ramificacin a lo largo de la celda [15,18,20]

con una PLOS ONE | www.plosone.org 1 12 2012 | Volumen 7 | Nmero 12 |
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cambiar de la gluclisis a la fosforilacin oxidativa [15,18,21]. Este fenotipo de
localizacin mitocondrial se aplica a mltiples madre categoras de clulas
incluyendo adultos, embrionario o inducida Las clulas madre pluripotentes
[5,13,15]. Esta redistribucin de las mitocondrias dria en hESCs desde una
localizacin peri-nuclear a un ramificado red precede en la regulacin de los
marcadores de clulas madre tpica tales como Oct-4 [20]. Se ha sugerido que
las caractersticas de mitocondrias clulas madre y el metabolismo, como
perinuclear localisa- cin, bajo contenido de ATP y una alta tasa metablica
podran ser utilizados como un marcador de '' stemness '' [3]. De hecho, cada
vez hay ms pruebas que las mitocondrias y sus patrones asociados de
metabolismo y localizacin son, de hecho, inexorablemente ligada a
mantenimiento pluripotencia miento [17] y que hESCs indiferenciadas pueden
suprimir la actividad mitocondrial [13,21]. La inhibicin de la funcin
mitocondrial cin, o ms especficamente la promocin de la gluclisis, mejora
o mantiene la pluripotencia con o sin bFGF, respectivamente, y impide la
diferenciacin temprana [20,22]. Adems, informes recientes sobre las clulas
madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) muestran que durante la
reprogramacin, las propiedades de las mitocondrias y metabolismo tambin
revertir a las de un fenotipo ms clulas madre similares. Esto incluy la
localizacin alterada de las mitocondrias, mitochondri- nivel de expresin de
genes asociados aliado, el contenido de ADN mitocondrial, Niveles de ATP, los
niveles de lactato y el dao oxidativo [13,16,21]. Mientras que la evidencia de
importante el papel de la mitocondria y juego gluclisis en el mantenimiento de
clulas madre de pluripotencia est emergiendo, en la actualidad existe poco
sabe sobre el papel mitocondrias juegan en diferenciacin hESC. Se sabe que
los niveles varan en las mitocondrias diferentes tipos de clulas [23,24] y de
manera similar a su papel en la diferenciacin se ha implicado en mltiples
linajes incluyendo humanos clulas mesenquimales madre [25,26],
mesangioblasts cardacos [27] y clulas madre embrionarias [20]. Con base en
la evidencia reciente, que Indica que el estado de pluripotencia clulas madre
puede ser influenciada por los cambios en la fosforilacin oxidativa y la
gluclisis, se analiz el cambios moleculares en los genes asociados
mitocondrial en respuesta a los agentes de la biognesis mitocondrial. Por otra
parte, nos muestran que la promocin activa de la biognesis mitocondrial y
fosfato oxidativo fosforilacin mejora la diferenciacin de las clulas madre
hacia una primitive- racha como poblacin mesendoderm. Por ltimo, hemos
desarrollado un lnea de clulas madre en el que las etiquetas de las buenas
prcticas agrarias fluorescencia de las mitocondrias biognesis inicial a la
madurez, allanando el camino para la futura detallada estudio de los cambios

mitocondriales como hESCs diferencian hacia tipos de clulas maduras

especficas. En conjunto, nuestros estudios reafirman la papel fundamental que
desempean las mitocondrias en el compromiso linaje temprano y proporcionar
nuevas herramientas para la investigacin de este orgnulo crtica durante
hESC diferenciacin. Materiales y mtodos Declaracin de tica Lnea HESC
mel2 fue derivado anteriormente en embriones de ratn capas alimentadoras
de fibroblastos (MEF) en virtud de la aprobacin de la australiana Nacional de
Salud y Consejo de Investigacin Mdica (Licencia No. 309709). Tissue Culture
Todos los reactivos de cultivo de tejidos de mamferos descritas aqu eran de
Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) a menos que se indique lo contrario. La
lnea reportero MIXL1 se ha descrito [28]. Todas las lneas eran proporcionado
por Stem Core Queensland (Centro de Clulas Madre de Australia) y
rutinariamente mantenida culturas pases como de forma manual en el MEF
capas de alimentacin como se describi previamente [29]. Antes de los
experimentos, las clulas fueron cultivadas en cultivo a granel o adaptados
para una sola clula pasaje como se describe anteriormente [30,31]. La
inmunofluorescencia Las clulas se fijaron en etanol y se tieron durante la
noche a 4uC para marcadores de diferenciacin y pluripotencia de acuerdo con
[32]. Los anticuerpos primarios utilizados fueron IgG de ratn 1 antimitocondria (Clon 113-1, 2 m g / ml), IgG de ratn 1k anti-Oct-4 (2 m g / mL),
IgG de ratn 3 anti-SSEA-4 (2 m g / ml), IgG de ratn 1 anti-Tra-2-49 (2 m g /
ml), IgG de ratn 2a anti-TG30 (1 m g / ml), IgG de ratn 2a anti- a-fetoprotena
(AFP, 2 m g / ml), IgG de conejo anti-nestina (5 m g / mL) y IgG de ratn 1 antiMAP-2 (5 m g / ml), IgG de ratn 1 anti-B3 tubulina, (todos de Merck Millipore).
Isotipo especfico secundaria anticuerpos fueron utilizados conjugados con
Alexa Fluor 488, 568, 633 o 647. Secundaria anticuerpos fueron utilizados en 1
m g / mL. Los ncleos se contador manchado con DAPI en 1 m g / mL. La
fluorescencia se visualizado utilizando un EVOS Florida microscopio invertido
(Avanzada Microscopa Grupo) o un invertido LSM 510 Meta (Zeiss Microscopa,
Alemania). Las imgenes y los datos del perfil de fluorescencia se generaron
utilizando la imagen J (v1.41). Para imgenes de clulas vivas, ncleos se
tieron con Hoechst 33342 (1 m g / ml) y las mitocondrias con LDS-751 (0,2 m
g / ml), Mitotracker profundo rojo (vida Tecno- gas, de acuerdo con las
instrucciones del fabricante) durante 15 minutos a 37uC. MitoSOX rojo se utiliz
a 5 m M durante 30 minutos a 37uC. La citometra de flujo Expresin de TG30
se determin por citometra de flujo usando una BD LSRII citmetro de flujo, tal
como se describe anteriormente [32]. Las clulas muertas fueron discriminados
utilizando 10 m g / ml de yoduro de propidio y la clula dobletes y cmulos
utilizando adelante y caractersticas de dispersin lateral [33]. Flujo se
analizaron en Eclctico y Lucid (Versin 2.0, Walter y Eliza Hall Institute para la
Investigacin Mdica) o Cflow Sampler (v1.0.264.15, Accuri Citmetros).
Imgenes de clulas vivas de LDS-751 manchado clulas madre fueron
tomadas utilizando un flujo de imgenes Amnis Citmetro. Mesendoderm
diferenciacin especfica Deteccin de linaje mesendoderm se realiz utilizando

el MIXL1 lnea reportero [28] con protocolos previamente demostrado promover

la formacin de mesodermo cardaco [34]. En pocas palabras, el da antes
diferenciacin, las clulas fueron cosechadas con TrypLE SELECT y sembraron a
60-80% de confluencia en un matraz recubierto con 1610 4 / Cm 2 MEFs
irradiados. El da siguiente, las clulas se cosecharon y se sembraron a 3000
clulas / pocillo de una de 96 pocillos, sin tratar de U placa inferior (Nalge Nunc
International) en APEL medios con factores de crecimiento, BMP4 (20 ng / ml, R
& D Systems), activina A (20 ng / ml), VEGF (40 ng / ml), SCF (30 ng / ml) y
Wnt3a (100 ng / ml, todos de PeproTech) y establecer como cuerpos
embrionarios giro [34]. MIXL1 relativa la expresin se midi en el da 3 basado
en la fluorescencia de GFP mediante citometra de flujo en un citmetro de
Accuri C6. Tabla 1. secuencias de cebadores qPCR. Cartilla Secuencia Tamao
del producto (base pares) TFAM Fwd-115 CCG AGG TGG TCT TTT TCA GT 203
TFAM Rev-317 TCC CCG CTA TAA GCA TCT TG POLG Fwd-1490 CCC ATG AGG
TTT TCC AGC 127 POLG Rev-1616 AGG TAA CGC TCC CAG TTC doi: 10.1371 /
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Biognesis mitocondrial Para probar el efecto de los agentes de la biognesis
de las mitocondrias, SNAP (S- nitroso-N-acetilpenicilamina), AICAR (5aminoimidazol-4-car- carboxamida 1-BD-ribofuransido) y metformina se
aadieron a MIXL1 cuerpos embrionarios o alimentadoras culturas libres 2D
(Geltrex TM revestimiento de la superficie y StemProH medios de
comunicacin) en 0-500 m M y se cultivaron durante 3 das. Antes de la
extraccin de RNA, clulas madre fueron cosechadas con TrypLE SELECT y se
sembraron a 100.000 clulas por pocillo de una de 24 pocillos placa recubierta
con Geltrex TM en medios StemProH. Las clulas se crecido durante 2 das en
la presencia de SNAP, y AICAR La metformina 0-500 m M antes de la cosecha
para el ARN de la siguiente manera. PCR cuantitativa (qPCR) El protocolo
completo usado de cerca se adhiere a las directrices recientes la realizacin y
presentacin de informes sobre los resultados qPCR [35]. Brevemente, el ARN
se extrado de clulas madre como cultivos de clulas individuales utilizando el
Qiagen Kit de extraccin de ARN RNeasy (Qiagen). El ADN genmico se
eliminado utilizando el kit de ADN libre de Turbo de acuerdo con el
manufacturero instrucciones de er (Life Technologies). Un microgramo de ADN
libre El ARN se convirti en ADNc usando Super- de Life Technologies guin
ADNc III kit de sntesis y oligo (dT) 20 cebadores. CDNA se 01:10 diluido antes

de qPCR. Las secuencias de cebadores utilizados para la qPCR puede se

encuentran en la Tabla 1. QPCR se realiz utilizando un Applied Biosystems
7500 termociclador rpido y SYBRH Verde Maestro Mezclar con 1 paso de 95uC
durante 20 segundos seguido de 40 ciclos de 95uC durante 3 segundos / 60uC
durante 30 segundos. Primer producto- especificidad fue confirmada por la
presencia de un pico en un paso anlisis de la curva de fusin en sabio y la
visualizacin de las bandas en el 1,5% geles de agarosa. Culturas Standard
StemProH se utilizaron como control de la muestra y todos los genes
referenciados a mRNA b-actina humanos utilizando el mtodo Pfaffl [36] para
POLG y TFAM. b-actina se utiliz como el gen de referencia [32]. Todos los
experimentos y se ejecuta qPCR fueron llevado a cabo por triplicado. La
transfeccin El protocolo de transfeccin completa se puede encontrar en
Mtodos S1. Brevemente, las clulas mel2, p32 (diseccin manual) 3 (cultivo
en masa) 11 (clulas individuales) fueron tratados con inhibidor de Rock
(Y27632, 10 m M concentracin final, Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) para
1 hora antes de la transfeccin. Independiente clulas se resuspendieron a
1610 6 clulas / 100 m L en la solucin de NucleofectorH clulas madre
humanas 2 (Lonza) que contiene 2 ug / 100 m L de la disponible
comercialmente ADN plsmido pEF / myc / mito / GFP (Life Technologies).
Aparte a partir de un casete de seleccin de neomicina, el plsmido contena
un GFP secuencia etiquetada a una secuencia de importacin mitocondrial bajo
la control del promotor EF1a. Las clulas fueron transfectadas usando el
programa B-016 en un dispositivo cubeta NucleofectorH II (Lonza). La eficacia
de transfeccin usando este conjunto programa se midi para ser
aproximadamente el 50% con 78% de clulas viables despus de la
transfeccin (no se muestra). Las clulas transfectadas se transfirieron a un
pocillo de un pozo 12 placa pre-recubierto con Geltrex TM y se cultivaron en
StemProH. Las clulas transfectadas se dejaron recuperar durante 24 horas
antes la seleccin en G418. La lnea reportero mitocondrial fue designado
KMEL2. HESC en la diferenciacin in vitro Para evaluar la capacidad de KMEL2
para diferenciar, los medios de KSR era intercambiado por DMEM sin bFGF y
complementado con Suero bovino fetal al 10% (FBS). Las clulas tambin
fueron tratados con El cido retinoico (10 m g / ml, Sigma Aldrich), BMP4 (40 ng
/ mL, R & D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) o activina A (40 ng / ml,
PeproTech) durante un mximo de 10 das para promover la capa germinal
especfica diferenciacin. Para la diferenciacin especfica neural, clulas
KMEL2 se cultivaron alimentador libre en Geltrex TM a 60% de confluencia.
Medios de comunicacin se cambi a KSR suplementado con 100 ng / ml de
bFGF, 5 m M dorsomorphin, 10 uM SB431542 y se cultivaron durante 6 das con
los medios de comunicacin cambiado cada dos das. Grupos de clulas fueron
tratados con colagenasa IV para formar cuerpos embrioides y se transfiere a
cultivo en suspensin en KSR con bFGF, SB431542 y dorsomor- phin durante 3
das. Cuerpos embrionarios, donde luego cultivan para hasta 30 das antes de
la siembra en la laminina de ratn (10 m g / cm 2 , Sigma-Aldrich) recubierto

platos para permitir la derivacin neural. Anlisis Cariotipo Cariotipo anlisis se

llev a cabo en KMEL2 a paso 7 despus de la transfeccin como se describe
anteriormente [37]. 15 metafases por Se analiz la muestra y las imgenes
tomadas con una resolucin de 400bphs. Cariotipo anlisis fue realizado por
Sullivan Nicolaides patologa ga, Taringa, Australia. Anlisis estadstico El
anlisis estadstico se realiz utilizando dos colas emparejado pruebas t de
Student o ANOVA de dos vas con la replicacin. Los valores de P , 0,05 se
consideraron significativos. Todos los experimentos se per- formado con un
mnimo de 3 rplicas biolgicas y un mnimo de 3 rplicas entre experimento.
Resultados Agentes Biognesis mitocondrial Impacto en clulas madre
Diferenciacin Atenuacin de la funcin mitocondrial y la promocin de la
gluclisis se ha utilizado para promover el aumento de expresin de
marcadores de pluripotencia y inhibir la diferenciacin [20]. Por el contrario,
hemos tratado de investigar si la promocin de la mitocondria la biognesis (y
posteriormente un aumento en phosphor- oxidativo ilacin) influira en la
diferenciacin de las clulas madre hacia principios mesodermo. Se
investigaron tres agentes qumicos, SNAP, AICAR y metformina con efectos
conocidos sobre la biognesis mitocondrial y la diferenciacin celular en
especies de mamferos humanos y otros [25,38,39,40]. Para determinar si el
aumento de biogen- mitocondrial ESIS tuvo ningn impacto en la
diferenciacin, independiente de los factores de promover la diferenciacin, las
clulas se cultivaron MIXL1 durante 3-4 das en Geltrex placas en medio de
mantenimiento hESC StemProH recubierto con o sin agentes de la biognesis.
En el da 4, 18.763.2% de las clulas tratadas con 250 m M SNAP fueron
positivos para la expresin MIXL1 (Figura 1a, p, 0,05, n = 3, en comparacin
con los controles no tratados) y demostrado en la regulacin de la TG30
marcador de pluripotencia (Figura 1b) y SSEA-4 (no mostrado). Las
concentraciones de SNAP en Figura 1. Agentes biognesis mitocondrial mejorar
la expresin en la diferenciacin de clulas madre MIXL1. (A) puede inducir la
expresin de SNAP en MIXL1 Culturas StemProH 2D independientes de la
adicin de BMP4 (p, 0,05, n = 4). (B) El marcador de pluripotencia TG30 est
regulado en las clulas positivas para MIXL1 marcador mesendoderm en el
puesto day3 250 mM tratamiento SNAP. (C) La diferenciacin de mesodermo
temprano (da 3) se ve reforzada en cultivos 3D de Adems de los agentes de
la biognesis mitocondrial. Las barras de escala son 200 mM. (D) mM SNAP 250
puede rescatar parcialmente expresin MIXL1 en la eliminacin de activina A o
BMP4. Las muestras de control fueron tratados de acuerdo a ([44], las barras
negras) o cultivadas sin BMP 4 (barras rojas) o sin activina A (barras azules). (E)
La expresin de genes asociados mitocondrial es muy variable despus de
SNAP y AICAR tratamiento. S, SNAP; A, AICAR; M, la metformina; POLG, la
polimerasa gamma; TFAM, factor de transcripcin mitocondrial A; nmeros
representan las concentraciones de los reactivos utilizados mM; D, DMSO sin
agentes biognesis se aadi como controles en volmenes iguales a las
muestras tratadas. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g001 Seguimiento de

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Figura 2. Generacin de una lnea reportero mitocondrial, KMEL2. Las clulas
fueron transfectadas con GFP de un plsmido que codifica orientado
mitocondrialmente expresado bajo el control de un promotor EF1a. (A)
Localizacin subcelular de GFP orientado mitocondrialmente se superpone con
las estructuras detectadas por una anticuerpo anti-mitocondrial. Intensidades
de fluorescencia para cada fluorforo se midieron a lo largo de la lnea de 160
mm se muestra en la imagen de superposicin. (B) La expresin del marcador
de pluripotencia no se efecta por GFP orientado mitocondrialmente. GFP
localizado en la mitocondria es co-expresada con la pluripotencia marcadores
Oct-4 y SSEA4. Las imgenes son de 150 mm de ancho. Co-expresin de
marcadores de pluripotencia GFP y se confirm por citometra de flujo. Los
histogramas mostrar clulas positivas GFP tambin expresan Oct-4 y SSEA-4.
(C) la intensidad de GFP no se pierde durante la regulacin hacia abajo de la
superficie celular marcador de pluripotencia TG30. Clulas (d) KMEL2 tienen un
cariotipo normal. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g002 Seguimiento de las
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Figura 3. LDS-751 manchas mitocondrias de clulas madre embrionarias
humanas basadas en el potencial de membrana. (A) LDS-751 es co-localizada
con las buenas prcticas agrarias en la lnea de reportero mitocondrias KMEL2
y no se superpone con el ncleo. Intensidades de fluorescencia para cada
fluorforo se midieron a lo largo la lnea de 160 mm se muestra en la imagen
de superposicin y trazado como distancia vs intensidad. (B) Las mitocondrias
tincin especfica se pierde cuando se trata con una valinomicina agente
despolarizante membrana mitocondrial. Anlisis del perfil de la lnea
demuestra LDS-751 ya no se localiza en la mitocondria despus el bloqueo de
potencial de membrana mitocondrial. El perfil de la lnea en la imagen
superpuesta representa 140 mm. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g003
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250 m M o superior tenan efectos perjudiciales en el nmero de clulas y
potencial de membrana mitocondrial segn la evaluacin de JC-1 tincin
(Figura S1). Ni AICAR ni metformina aumentaron el porcentaje de clulas
positivas MIXL1 por encima de los controles no tratados Figura 4. mitocondrial
localizacin durante la diferenciacin de linaje neural. Diferenciacin especfica

linaje neuronal mostrando KMEL2 positivo para (a) Nestin y (CE) b-III-tubulina.
clulas positivas b-III-tubulina muestran expandido localizacin de mitocondrias
a travs de excrecencias dendrticas (C y E). bIIIT, b-III-tubulina. Las barras de
escala en (b) son de 1000 mm. Todas las dems imgenes son de 150 mm de
ancho. Imgenes ampliadas en (e) se muestran en las regiones en caja de (c) y
(D). doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g004 Seguimiento de las mitocondrias
durante hESC diferenciacin PLOS ONE | www.plosone.org 7 12 2012 | Volumen
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(Figura 1a). Para determinar si alguno de los agentes de la biognesis podran
aumentar MIXL1 clulas positivas durante la induccin del mesodermo
cardiognico, Spin cuerpos embrionarios fueron diferenciadas utilizando medio
APEL [34] y factores de crecimiento BMP4, activina A, VEGF y SCF. El aumento
de las concentraciones de tanto SNAP y AICAR aument el porcentaje de
clulas positivas MIXL1 17.33611.72 (P, 0,05) y 13.41613.4% (P.0.05),
respectivamente, por encima de los controles (Figura S2) como as como el
nivel relativo de expresin MIXL1 dentro de las clulas (Figura 1c). Con el fin de
determinar un impacto positivo de la biognesis agentes sobre la expresin
MIXL1, cuerpos embrionarios se formaron en el presencia de agentes de la
biognesis diluye en DMSO con y sin los factores de crecimiento clave para la
diferenciacin, BMP4 y activina A. Como eliminacin esperada de cualquiera de
BMP4 o activina A significativamente impactado en la expresin MIXL1 (Figura
1d). Sin embargo, MIXL1 expresin fue parcialmente restaurada en las culturas
que carecen de BMP4 o Activina A por 250 m M SNAP, pero no el control DMSO
o AICAR muestras tratadas (Figura 1D y S2 y 3). Mitocondrial la biognesis en
clulas madre se midi por la expresin de POLG y TFAM, genes codificados
nucleares requeridos para el ADN mitocondrial la replicacin y la transcripcin,
respectivamente (para una revisin ver [11]). No tratamiento produjo un
cambio significativo en la expresin de POLG o TFAM (P.0.05). Sin embargo
metformina y el DMSO controles mostraron una tendencia en la regulacin
hacia abajo de cada gen (Figura 1e). En contraste, SNAP y AICAR tenan una
muy variable efecto sobre la expresin gnica y una tendencia hacia el
aumento de expresin de TFAM y POLG. Figura 5. Variable de localizacin
mitocondrial durante la diferenciacin de linaje especfico. (A) Las mitocondrias
en clulas madre estn localizadas cerca de la ncleo. (B) Las mitocondrias en
las clulas de linaje endodermo positivo AFP. Las mitocondrias en clulas
positivas AFP muestran un granular, dispersa a travs de la localizacin toda la
clula. (C y d) Las mitocondrias en MIXL1 clulas positivas (mesendoderm)
mostrar un densamente poblado, localizacin perinuclear basado en
MitoTracker rojo lejano (c) y LDS-751 (d) la tincin. AFP, alfa fetoprotena.
Imgenes (ac) son de 150 mm de ancho. Lnea perfil en (d) representa 120
mm. doi: 10.1371 / journal.pone.0052214.g005 Seguimiento de las

mitocondrias durante hESC diferenciacin PLOS ONE | www.plosone.org 8 12

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Generacin de un Clulas Madre Embrionarias Humanas mitocondrial Lnea
Periodista: KMEL2 HESCs mel2 transfectadas con pEF / myc / Mito / GFP eran
seleccionado usando G418 durante un perodo de tres semanas. La resultante
GFP lnea hESC positivo fue designado KMEL2. El condrial drial localizacin de
GFP en las clulas KMEL2 se confirm con una anti-anticuerpo mitocondrial
(Figura 2a) y la tincin con MitoSOX rojo (Figura S5). La medicin de la
intensidad de fluorescencia a lo largo de una lnea de perfil muestra una
superposicin precisa de la GFP y mitocondrial seales de anticuerpos que
indican la co-localizacin (Figura 2A). La lnea celular transgnica retuvo la
expresin de la pluripotencia marcadores, Oct-4, SSEA-4 (Figura 2b), TG30 y
Tra-2-49 (Figura S4) entre 5 y 10 pasajes despus de la transfeccin.
Adicionalmente, KMEL2 clulas mantienen un cariotipo normal (Figura 2d). Flujo
Anlisis de citometra mostr que la expresin de GFP se mantuvo robusta en
das (d) 4 de la diferenciacin mientras que la expresin de la pluripotencia
marcadores TG30 (Figura 1c) y SSEA-4 (no mostrado) se redujeron regulado.
Por lo tanto, la expresin de GFP se mantiene durante hESC temprana
diferenciacin. El Fluorocromo LDS-751 localiza a mitocondrias en hESC A fin de
validar el uso de KMEL2 en el seguimiento en vivo de clulas madre
mitocondrias, se utiliz el anlisis de imgenes basada en el flujo para
confirmar GFP localizacin mitocondrial. Se utiliz inicialmente LDS-751 como
una contador de tincin nuclear, porque no tiene ningn solapamiento
espectral significativa con GFP. Sin embargo, en 751 clulas LDS-KMEL2
manchadas, significativa se observ co-localizacin de LDS-751 con GFP
(Figura S5). Esto sugiere LDS-751 no mancha el ncleo en clulas madre. Este
se confirm en un formato de 2 dimensiones utilizando DAPI como nuclear
mancha. LDS-751 no co-localizar con la tincin nuclear DAPI y, en cambio, LDS751 se superponen exclusivamente con GFP importado a la mitocondria (Figura
3a). Adems, LDS-751 co-localizada exclusivamente con MitoSOX rojo (Figura
S5). Despolarizacin de membranas mitocondriales con valinomyocin
inhibieron la localizacin de LDS-751 a la mitocondria (Figura 3b). Condrial
localizacin drial de LDS-751 ha sido previamente reportado en fibroblastos de
ratn y monocitos y, como de clulas madre, era depende de las membranas
mitocondriales polarizadas [41]. Por lo tanto, LDS-751 se puede utilizar como
una herramienta para el seguimiento de las mitocondrias en las clulas
cultivadas. Localizacin mitocondrial durante la diferenciacin de todos Tres
capas germinales Durante la diferenciacin de clulas madre ocurren cambios
significativos en mitocondrial metabolismo, la morfologa y la produccin de
energa (oxidasa fosforilacin dativo vs. gluclisis) [15,18,20]. Sin embargo,
poco se dispone de informacin sobre la localizacin y la morfologa de
mitocondrias durante la diferenciacin de linaje especfico. Se utiliz el Lnea

reportero KMEL2 y SUD-751 para realizar un seguimiento durante las

mitocondrias cido retinoico impulsado diferenciacin neuroectodermo.
Consistente con los datos anteriores [2,15], las mitocondrias en clulas madre
antes de diferenciacin estaban estrechamente localizada en la periferia de la
ncleo en racimos densos muestra con tanto KMEL2 y SUD-751 (Figura 2b, 3b y
5a). En contraste, KMEL2 deriva y Nestin MAP2C clulas positivas se haban
dispersado por toda la mitocondria de clulas en forma granular y los patrones
de hilo (Figura 4A y Figura S4), como se inform anteriormente en clulas
adultas del linaje neuronal [42,43]. Cuerpos embrionarios chapada en laminina
despus de 30 das de neural diferenciacin espectculo GFP especfica (a
travs de anti-GFP unin de los anticuerpos) para la localizacin de las
mitocondrias en b-III-tubulina clulas positivas (Figura 4b-e) confirmados por
co-tincin con un anti- anticuerpo mitocondrial (no mostrado). Adems,
mitocondrial grupos podran ser identificados en excrecencias dendrticas
positivas para b-III-tubulina (Figura 4c y e). La diferenciacin al linaje
endodrmico fue identificado con AFP y la tincin FOXA2 (Figura 5b y S4).
Similar a mitocondrial localizacin en clulas Nestin positivas, las clulas
positivas para AFP contena mitocondrias dispersado por toda la clula en un
granular formacin con una cantidad limitada de perinuclear mitocondrial
agrupacin. Con el fin de observar las mitocondrias durante la formacin de
mesodermo una lnea reportero competente cardaca para la mesendoderm
marcador MIXL1 [28] se utiliza en conjuncin con publicado protocolos para
conducir la induccin de mesodermo cardiognico [44]. Las clulas se tieron
positivas para MIXL1 en d3-d4 de diferenciacin para las mitocondrias, ya sea
utilizando LDS-751 o Mito-tracker de color rojo oscuro. La localizacin
mitocondrial en las clulas positivas es similar MIXL1 de clulas madre
indiferenciadas con mitocondrias densamente localizados a la periferia nuclear
(Figura 5c) .La lnea de anlisis del perfil de fluorescencia cencia intensidades
de LDS-751 y DAPI confirmaron un apretado la agrupacin de las mitocondrias
alrededor del ncleo (Figura 5d). Discusin Con el fin de investigar el papel de
las mitocondrias desempean en la regulacin de el equilibrio entre la
pluripotencia y compromiso linaje nosotros desarrollado un reportero
mitocondrial lnea celular que expresa una hESC mitochondrially localizada
GFP, KMEL2. Es importante destacar que Deming trar que la expresin de GFP
se mantiene en los derivados de todo capas germinales cuando KMEL2 clulas
madre se diferencian. El KMEL2 lnea de clulas madre tambin facilit la
identificacin de la mitocondria biognicas reactivos que promueven la
diferenciacin de primitiva mesendoderm. Herramientas para el anlisis in vivo
Mt En este estudio, hemos desarrollado dos enfoques para la identificacin y el
seguimiento de localizacin mitocondrial en clulas madre y su diferenciacin
progenie ATED. En primer lugar, hemos desarrollado un reportero mitocondrial
lnea celular de clulas madre que producen una construccin GFP etiquetados
a un secuencia de importacin mitocondrial como se ha demostrado para
celular mltiple tipos [45,46]. La lnea de reportero, apodado KMEL2, mostr

co- localizacin de GFP con anticuerpos especficos a las mitocondrias (Figura

2a), expresado marcadores de pluripotencia octubre-4 y SSEA-4 (Figura 2b) y
retenido un puesto cariotipo normal de la transfeccin (Figura 2d). KMEL2 es
particularmente til para el seguimiento de mitocondrias localizacin drial y
alteraciones estructurales durante la diferenciacin. Seguimiento mitocondrial
puede ser importante en la aplicacin teraputica ciones, por ejemplo, el
agrupamiento de las mitocondrias en el celular prolongaciones durante hESC
diferenciacin neural es una caracterizacin istic fenotipo de los trastornos
mitocondriales tales como ARSACS [7]. En segundo lugar, se demuestra que en
clulas madre, SUD-751 co-localizados especficamente con las buenas
prcticas agrarias en la lnea KMEL2 y no mostr coincidencia significativa con
la tincin DAPI nuclear (Figura 3a). Mientras LDS-751 ha sido utilizado
previamente como un marcador nuclear [47] que muestran que localizacin
mitocondrial en hESCs depende de mitocondrias polarizacin de la membrana
drial como el tratamiento con la despolarizante agente valinomicina bloqueado
tincin especfica mitocondrial (Figura 3b). Promocin de la fosforilacin
oxidativa Mejora Diferenciacin La biognesis mitocondrial es controlado por
proliferacin de peroxisomas rador activado del receptor c-coactivador-1a
(PGC-1a), NRF-1 y TFAM [11]. La metformina y AICAR son activadores de
conocidos AMP-activated protena quinasa (AMPK) [39], que a su vez aumenta
la produccin de PGC-1a. PGC-1a co-activa el Seguimiento de las mitocondrias
durante hESC diferenciacin PLOS ONE | www.plosone.org 9 12 2012 | Volumen
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transcripcin de TFAM [48], un regulador directo de la mitocondrial La
transcripcin del ADN y la replicacin. SNAP es un xido ntrico (NO) donante,
tambin sabe que aumenta la expresin de la mitocondria genes biognesis
como TFAM y POLG sin embargo su modo de accin es activar directamente
PGC-1a [49] por lo tanto indirectamente el aumento de la biognesis
mitocondrial. Los cambios veces (1,5 a 3) se observ en la biognesis
mitocondrial y reguladores TFAM POLG, although variable, concurred with
published results [15,21,39,50]. In addition, SNAP and AICAR displayed a trend
of increasing levels of TFAM and POLG suggesting increased mitochondrial
biogenesis. We observed that SNAP induced mitochondrial biogenesis in
cytokine free StemPro media lead to an increased production of MIXL1 + las
clulas. In contrast, neither Metformin nor AICAR induced expression in these
conditions. Conversely, in differenti- ating embryoid bodies both SNAP and
AICAR increased the number of MIXL1 positive cells by approximately 15%
compared to untreated controls (Figure S2). Furthermore, in the absence of the
key differentiation factors BMP4 or ACTIVIN A, SNAP was able to partially
restore MIXL1 expression in embryoid bodies. However, AICAR could not
substitute for these cytokines in the embryoid body assay. This suggests that
SNAP and AICAR may have different modes of action in promoting

differentiation. Para example, SNAP may induce differentiation [38] through

either mitochondrial biogenesis or an as yet unknown pathway, while AICAR
may not induce differentiation but may inhibit pluripo- tency thereby improving
the general differentiation of the cells regardless of lineage. A possible
confounding factor is that embryoid bodies without BMP4 and ACTIVIN A were
smaller compared to controls (Figure S3). Nevertheless, further testing of
differentiation efficiency in combinatorial titrations of AICAR or SNAP in lineage
specific differentiation protocols is needed to precisely define the role of
mitochondria in differentiation. Conclusin Normal cell function requires
coordinated communication between the nucleus and mitochondria for efficient
transcription of ETC components. An essential part of this communication is the
localisation of intracellular ''messengers'' to particular areas of the cell, as is
evident with peri-nuclear localisation of mitochondria in hESC prior to
differentiation. We have generated novel methods for the visualization of
mitochondria in hESC during differentiation and investigated the role of
mitochondria in lineage specific differentiation to mesoderm. These traceable
mitochon- dria provide a powerful means of investigating the changes in
mitochondria during differentiation of varying cell lineages and facilitate the
analysis of the impact of biogenesis on differentiation trajectories. Finally,
mitochondrial characteristics may provide a means of further classifying
differentiated stem cell progeny for use in therapeutic applications. Informacin
de Apoyo Figure S1 Treatment with SNAP lowers hESCs numbers and
mitochondrial membrane potential. a) MIXL1 cells were seeded into 24 well
plates and treated for 24hrs with biogenesis agents indicated or DMSO as
control. Cells were grown feeder free on Geltrex coated plates. On day 3 cells
were harvested and counted using a standard haemocytometer. Error bars are
+/ 2SD of n =3 biological replicates. b) MIXL1 and Nkx2.5 cells were seeded
into 24 well plates and treated for 24hrs with biogenesis (50 or 250uM) agents
indicated or DMSO as control. Cells were grown feeder free on Geltrex coated
plates. On day 3 cells were harvested and treated with 5uM JC-1 for 15mins at
RT. Bars represent relative cell numbers with low membrane potential. Error
bars are +/2SD of n = 3 biological replicates. S = SNAP, A =AICAR, M
=Metformin. (PDF) Figure S2 MIXL1 expression post treatment with biogenesis
agents. a) AICAR and SNAP at 500 m M in the presence of BMP4 and Activin A
increase MIXL1 expression relative to controls. b) Individual replicate data
represented in part ''a'' expressed as MIXL expression relative to control. c)
Raw data of MIXL expression expressed as percentage positive for MIXL
expresin. n/a = test not performed, Dead = cell death prohibited analysis, A =
AICAR, S = SNAP, concentrations listed as A50, A250 etc represent m M, S =
SNAP, A = AICAR, M =Metformin. (PDF) Figure S3 MIXL expression in hESCs
treated with biogenesis agents in the absence of Activin A or BMP4. C = control
(all growth factors VEGF, SCF, BMP4 and Activin A), A- = Differentiation without
Activin A, B- = Differentiation with- out BMP4, A50 and A250= AICAR
concentrations of 50 and 250 m M, S50 and S250 = SNAP concentrations of 50

and 250 m M. (PDF) Figure S4 Lineage specific marker expression in KMEL2. a)

KMEL2 cells express embryonic stem cell marker Tra-2-49. b) KMEL2 cells
express embryonic stem cell marker TG30. Histograms represent flow
cytometry data demonstrating GFP positive cells express pluripotency markers
(blue line) above negative controls (black line). c) Mitochondria show a
dispersed localisation in MAP2C positive cells. d) KMEL2 cells differenti- ated
towards the endoderm lineage express FOXA2. (PDF) Figure S5 Mitochondria
visualisation in KMEL2. a) LDS- 751 (pink) co-localises with GFP in KMEL2 cells
(green). Imgenes taken on an Amnis image stream. b) GFP, LDS-751 and
Mitosox red co-localise in KMEL2 cells. c) Profile analysis of fluorescence
intensity for each mitochondrial marker demonstrates overlapping of peak
signals. Line of profile is shown in overlay image from ''b''. (PDF) Methods S1
Early images of KMEL2 selection post transfeccin. MEL2 hESCs were
transfected to label mitochon- dria as described in Supplementary Method S1.
Scale bars are 200 m m. (PDF) Agradecimientos We would like to thank the
StemCore Facility of Stem Cells Australia (ABJP, PPG, AGE, EGS) and Luke
Hammond of the Queensland Brain Institute for assistance with confocal
microscopy (ABJP, GWO). Autor Aportes Conceived and designed the
experiments: AP FC TM DE AE ES GO. Performed the experiments: AP FC GO.
Analyzed the data: AP FC GO DE AE ES. Contributed
reagents/materials/analysis tools: AP AE ES PG GO. Wrote the paper: AP DE GO
TM. Tracking Mitochondria during hESC Differentiation PLOS ONE |
www.plosone.org 10 December 2012 | Volume 7 | Issue 12 | e52214
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