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------------------------------------------------------------------------------------------------------------------INDICE GENERAL
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------PRCTICA
P GINA
Indice General ..
Programa y Planificacin ..
14
16
18
20
22
31
Anexo 1.
38
Anexo 2.
42
Anexo 3
51
Guia de Informes .
.52
53
55
58
60
Page 1
Page 2
EVALUACIO N
TEO RA (65 %)
Proyecto= 20%
O BSERVAC I N: Los temas y fech as de los sem inarios tericos sern fijados el
segun do da de clases.
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ABREVIATURAS.
(entre parntesis se indica la abreviatura utilizada generalmente en ingls)
AIA (I AA)
ABA
Acido Abscsico
ANA
(NAA)
Acido Naftalenactico
BA BAP
6-Bencilaminopurina
2,4-D
Acido 2,4-diclorofenoxiactico
GA3
Acido giberlico
IBA
Acido Indolbutrico
Cinetina
MS
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PRCTICA N1
Preparacin de medios de cultivo.
Condiciones de asepsia.
INTRO DUCCIO N
Las plantas que crecen en la naturaleza tienen tres fuentes esenciales para su
nutricin. Los nutrientes minerales los o btienen, junto con el agua, desde el suelo a travs
del sistem a radical. El dixido de carbono atm osfrico es utilizado en el proceso de la
fotosntesis para proveer carbono como fuente bsica de ener ga; por ltim o, el cuerpo de
la planta, utiliza los carbohidratos y nutrientes para sintetizar las vitam inas y sustancias de
crecim iento esenciales para su crecim iento y desarrollo normal.
Los requerim ientos para que un tejido vegetal crezca in vitro, en general, son
similares a aquellos de las plantas intactas creciendo en la naturaleza. Sin em bar go, en la
m ayora de los casos s lo se cultivan tejidos aislado s o una parte pequea de los rganos
de la planta; estos tejido s u r ganos aislado s carecen de la capacidad para sintetizar sus
propios carbohidratos, la m ayora de las vitaminas, y las sustancias de crecimiento
vegetales. Por lo tanto, todas las sustancias que necesitara una planta intacta en la
naturaleza deben ser sum inistradas artificialmente a los tejidos cultivados.
El establecim iento y crecimiento exitoso de un tejido vegetal in vitro, generalm ente
esta determinado por la naturaleza del explante, por la com posicin del m edio nutritivo, y
varios factores am bientales (luz, tem peratura, etc.).
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MACRO
elementos
N
P
Ca
Mg
S
MICRO
Fe
Zn
B
Mn
Cu I
Co
Ni
Al
Mo
pH
K
Extracto de Levadura
Agua de coco
Extractos vegetales
Hidrolizado de Casena
Peptona y Triptona
2-
Agregue las vitaminas: la Tiamina esta preparada en una solucin 0.08 g/l.
4-
5-
Page 6
6-
Una vez que el m edio contenga todos sus componentes, enrase con agua destilada
hasta el volum en deseado.
8-
9-
Pese el agar o gelrite para tener una concentracin final de 8 g/l o 2 g/l
respectivamente y adalo al medio.
10 -
Caliente el m edio en el horno m icroondas hasta que el agar est disuelto; y luego
reparta el m edio en envases adecuado s previamente rotulados: tipo de m edio,
equipo, fecha.
BIBLIOGRAFIA.
-
Ozias-Akins, P. y I.K. Vasil. 1985. Nutrition of Plant Tissue Cultures. En: Cell
Culture an d Som atic Cell Genetics of Plants, Ed. I.K. Vasil., V.2. pags. 129-147.
Gamborg, O.L., T. Murashige, T.A. Thorpe y I.K. Vasil. 1976. Plant Tissue
Culture Media. In Vitro 12(7): 473-478.
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AGREGAR HORMONAS
0.1 m l 2,4-D (stock 1 m g/m l)
AFORAR A 100 m l
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AUXINA
C ITOQ UININA
V DE
NRO . DE
TEJIDO Q UE SE VA A
(m g/l)
(m g/l )
MEDIO
ENVAS E
SEMBRAR
(ml)
600
30 fcos.
floema zanahoria
callo tabaco
yem as y micro-esquejes
embriones
1 2,4-D
200
10 fcos.
floema zanahoria
0.5 AIA
100
5 fcos.
callo tabaco
100
5 fcos.
callo tabaco
0.5 AIA
100
5 fcos.
callo tabaco
0.1 ANA
0.5 BA
100
5 tubos
hojas Begonia
0.1 ANA
1 BA
100
5 tubos
yem as-microesquejes
0.1 AIA
100
5 tubos
embriones
NO TA: Todo s los medios contienen los com ponentes bsicos de Murashige y Skoog
(1962) indicados en el anexo N1.
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Los explantes que se siem bran para establecer cultivos iniciales son
sometidos a un proceso de desinfeccin que se describe en detalle en cada
prctica. El procedim iento de desinfeccin depende del tipo de tejido y en
qu condiciones f ue cultivado.
2.
esterilizados en una cm ara de flujo lam inar que elimina por filtracin las partculas
suspen didas en el aire garantizando un ambiente no contam inado.
3.
Para trabajar en el cuarto de cultivos donde estn las cmaras de flujo laminar se
deben seguir las norm as siguientes:
El am biente debe m antenerse limpio, la superficie de trabajo se desinfecta con
alcohol 70% antes y despus de usarla, se debe usar bata de laboratorio y lavarse
bien las manos antes de entrar, los in strumentos como pinzas, bistur, etc. se
desinfectan flamendolos, la vidr iera utilizada se esteriliza en el autoclave.
Las m anipulaciones que se hacen en la cm ara de flujo lam inar, se hacen cerca de
la llam a del m echero,
PRECAUCI ON: MANTENGA ALEJADO EL FRASCO DE ALCOHOL Y EL
ALGODON IMPREGNADO DE ALCOHOL DE LA LLAMA DEL MECHERO,
PUEDEN PRENDERSE.
4. Al finalizar el trabajo, se apaga el m echero, se cierra la llave del gas, se lim pia con
alcohol la m esa de la cmara (no las paredes porque se manchan), se apaga la
cmara y se deja el cuarto con la luz ultravioleta.
PRECAUCION: LA LUZ ULTRAVI OLETA ES DAINA PARA LA SALUD,
NO SE EXPONGA A ELLA NI LA MIRE.
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PRACTICA N 2
Induccin de embriognesis somtica.
1. O BJETIVO S
a.
b.
Establecer las caractersticas f undam entales del proceso de embriognesis som tica
a partir de los tejido s sem brados de zanahoria, y en otros sistemas (caa de azcar
y caf) establecidos en el laboratorio.
1. INTRO DUCCIO N.
La em briognesis somtica es el proceso por el cual clulas somticas haploides o
diploides se desarrollan hasta form ar un em brin, sin que hay a f usin de gametos. Este
proceso ocurre en form a natural en una cantidad de especies, pero generalmente se le
conoce m ejor como una ruta para la regeneracin in ducida por cultivo de tejidos.
Un embrin som tico puede definirse com o una planta en su etapa inicial de desarrollo
que presenta una estructura bipolar, con raz y vstago en polo s opuestos de un mismo eje,
no tiene conexin vascular con los tejido s m aternos y su origen es unicelular o multicelular
pero las clulas que lo originan no son productos de la fusin gam tica. Hay do s formas
esenciales de em brio gnesis somtica in vitro: La em briognesis somtica directa, es
aquella en la cual los embriones se originan directamente de un tejido sin que haya
previamente proliferacin de callo, y la embriognesis somatica indirecta, es aquella en
la cual la proliferacin de callo es un requisito previo para el desarrollo del embrin.
La induccin de em briones somticos tiene diversas aplicaciones: permite la
propagacin vegetativa masiva de genotipos selectos, es m uy til en las plantas don de la
propagacin vegetativa por mtodos agronmicos tradicionales no es eficiente. En varios
cultivos se estn utilizando em briones somticos para producir las llamadas sem illas
sintticas, donde el embrin es encapsulado en un medio artificial que sim ula la semilla y
luego puede utilizar se de modo similar a la misma. La induccin de em brio gnesis
somtica in vitro se ha visto como un sistem a m s fcilmente manipulable para hacer
estudios que perm itan determ inar los eventos bioqumicos y genticos que ocurren durante
el proceso.
En la presente prctica se sembrarn explantes tom ados de una zanahoria, este fue
el primer sistema en el cual se logr inducir el proceso de embr iognesis somtica in vitro,
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 11
y ha sido muy estudiado, por ello es uno de lo s sistem as que ha sido mejor caracterizado
hasta el presente y se lo considera un m odelo de cultivo in vitro y en especial de
embriognesis somtica, por ello lo hemos escogido para este trabajo de laboratorio,
adem s se o bservarn otros sistem as de cultivo que se trabajan en el laboratorio, para
compararlos con la zanahoria, y permitir considerar las aplicaciones que dichos mtodos
han tenido en la investigaciones que llevamos a cabo actualmente.
3. MATERIALES Y METO DOS.
Procedimiento de siembra de los explantes.
a. Desinfeccin de lo s tejidos
Lave la zanahoria con agua, jabn y cepillo. Crtela en trozos de
aproximadam ente 4 centmetros de largo y colquelas en una solucin de cloro
al 20 % por 15 m inutos. Lleve a la cmara de flujo lam inar y enjuague 2 veces
con agua destilada estril.
b. Siembra
Se sem brarn los explantes en los medios 1 y 2.
Tome un trozo de zanahoria con una pinza estril, colquelo en una placa
de Petri y con un sacabocados saque cilindro s de xilem a + floema + cambium .
Corte disco s con un bistur y simbrelos sobre el m edio, tomando en cuenta la
polaridad. Siembre 3 discos en cada frasco, selle los frascos con envoplast e
incube en el cuarto de cultivo o en luz.
c. Repique
Bajo con diciones aspticas, transfiera los tejidos a m edio control (m edio 1,
sin hormonas) fresco.
6. BIBLIO G RAFIA.
Reinert, J. y Yeoman, J.J. 1982. Plant Cell and Tissue Culture. A Laboratory Manual.
Ed.Sprin ger- Verlag, Berln, 83 pags.
Page 12
PRCTICA N 3
Organognesis
1. O BJETIVO S
a. Inducir organo gnesis usan do hojas como explantes.
b. Inducir or ganognesis indirecta en callos de tabaco.
c. Establecer curvas de crecim iento de callos utilizan do diferentes parm etros.
2. INTRO DUCC IO N
La organognesis es el proceso de r egeneracin que ocurre mediante la formacin
de rganos de novo, com o vstagos, races, flores, hojas, etc. Puede ser directa si ocurre
sin la formacin previa de callo o indirecta si se requiere la formacin previa de callo. El
callo es un tejido no or ganizado y poco diferenciado formado por clulas en proliferacin
que se producen tanto in vivo como in vit ro. Estos ltimos pueden ser de dos tipos segn
su consistencia. a) friables, formados por clulas unidas en forma laxa, cuyas paredes
celulares presentan mayores concentraciones relativas de hem icelulosa y pectina que de
celulosa. b) com pactos form ados por clulas f uertemente unidas entre si, cuyas paredes
celulares presentan m ayores concentraciones de celulosa que de hemicelulo sa y pectinas.
Los callos in vitro en general se forman a partir de explantes cultivado s en
presencia de altas concentraciones de auxinas.
La organo gnesis indirecta tiene inters en program as de seleccin en lo s que se
requiere variabilidad gen tica adicional a la ya existente en la naturaleza como por ejemplo
la resistencia a antibiticos, herbicidas, sequa, etc. La organognesis directa se utiliza en la
m icropropagacin de plantas lites.
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El da en que se inicie el cultivo, tom e una m uestra del callo y anote su peso (peso
fresco). Luego envulvalo en papel de alum inio y colquelo en la estufa bien
identificado, por varios das, hasta que est totalmente seco y determine su peso seco.
Repita el procedimiento tom ando m uestras del material en cultivo durante 6 semanas.
Elabore las respectivas curvas de crecim iento.
4. BIBLIO G RAFIA.
-
Page 14
PRACTICA N4
Cultivo de yemas y microesquejes.
1. O BJETIVO
Observar la form acin de brotes en yemas de ro sa y microesquejes de crisantem o.
2. INTRO DUCC IO N
Las plantas adultas presentan meristemas en los extremos del eje principal y en las
ramificaciones del vstago de la raz. Los m eristem os del vstago o domo meristemtico
se encuentran rodeados por los prim ordios foliares y en conjunto constituyen las yemas
apicales o axilares dependiendo de su posicin en la planta. Las yemas axilares aisladas o
las presentes en nm ero variable en los n udo s de microesquejes cultivados in vitro en
presencia de hormonas, generalmente de citocininas, form an brotes. El nmero de brotes
formados dep ender del n m ero de yem as preexistentes, de la concentracin de horm onas
end genas, as como de las concentraciones relativas de las hormonas aadidas. Lo s brotes
formados pueden provenir de yemas axilares preexistentes o de yemas adventicias; estas
ltim as pueden form arse al proliferar en si m ism a la yema axilar. Generalm ente las yemas
adventicias se forman en presencia de altas concentraciones de citocininas.
El cultivo de yem as y m icroesquejes se utiliza en la m icropropagacin clonal masiva
de plantas lites. El cultivo de lo s domos meristemticos o de yemas con pocos primordios
se utiliza para la obtencin de plantas libres de virus.
Page 15
diseccin. Siembre una yema por frasco, selle los frascos con envoplast e incube en
el cuarto de cultivo.
4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS.
Realice observaciones semanales en el microscopio estereoscpico:
-
5. PREG UNTAS.
a.
b.
c.
Cules son las tcnicas que se combinan con el cultivo de m eristem as para
obtener plantas libres de vir us?
6. BIBLIO G RAFIA
-
Page 16
PRACTICA N5
Cultivo de embriones cigticos.
1. OBJETIVO
Observar la regeneracin de plantas a partir del cultivo in vitro de em briones
cigticos.
2. INTRO DUCCIO N.
El cultivo de embriones cigticos consiste en el aislam iento y crecimiento in vitro
en condiciones estriles de un embrin inm aduro con el fin de obtener una planta viable.
En principio existen dos tipos de cultivos de embriones: a. cultivo de em briones
inmaduros, los cuales se originan de semillas que no acabaron de m adurar. El xito de
este tipo de cultivo depen de principalmente del estado de desarrollo del em brin utilizado.
b. Cultivo de em briones maduros, los cuales a su vez se encuentran en semillas m aduras.
Este tipo de cultivo es relativamente fcil.
Algunas de las aplicaciones del cultivo de em briones son: acortamiento del ciclo de
m ejoram iento, prevencin del aborto em brionario, produccin de haploides y para
conseguir la form acin de callos, rescate de embriones hbridos interespecficos.
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4. EVALUACIO N DE LO S RESULTADOS.
Realice observaciones semanales en relacin a:
-
5. PREG UNTAS.
a. Cules otras aplicaciones tienen los cultivos de embriones?
6. BIBLIO G RAFIA.
-
Pierik, R.L.M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mun di-Prensa.
Page 18
PRCTICA N 6
Extraccin de protenas en tejidos vegetales
cultivados in vitro
1. O BJETIVO S
Al fin alizar esta prctica el estudiante debe ser cap az de:
1.1. Realizar extracciones de proten as de tejido s vegetales cultivado s in vitro.
1.2. Aplicar el m todo de Bradford p ara estimar la con centracin proteica.
1.3. Preparar geles de poliacrilamida
1.4. Realizar corr idas electroforticas de protenas en geles de po liacrilam ida
1.5. Visualizar protenas en geles de poliacrilam ida por tincin con Azul de
Coom asie e interpretar los p atrones electrofortico s de protenas.
2. INTRO DUCCI N
Una form a de est udiar la diver sidad gentica es analizar la expresin de
protenas, que son los pro ductos primarios de los genes. Tambin han sido muy
utilizadas las iso enzimas que son las difer entes formas m oleculares de un a protena que
presenta la m ism a especificidad en zim tica. Han sido establecido s mapas genm icos
isoen zim ticos para varias especies de plantas. Las protenas e isoen zim as tambin son
m uy tiles para detectar diferen cias en la expr esin gentica durante el desarro llo. Uno
de lo s mtodos m s utilizados para est udiar las protenas es la electroforesis, m ediante
la cual las protenas migran por el efecto de la aplicacin de un cam po elctrico so bre
un m edio de soporte slido, que en esta prctica estar con stituido prin cipalm ente por
poliacrilamida. El gel tam bin p uede ser de alm idn, agarosa, etc.
Segn las
condicion es de la corrida electrofortica, en geles con SDS (Do decil sulfato de so dio)
las protenas adquieren car ga negativa y se separan de acuer do a su tamao. Cuando las
protenas son colocadas en un gel con un gr adiente de pH, las protenas migran de
acuer do a su punto isoelctrico (valor de pH al que la molcula no posee car ga elctrica
y es incap az de desplazarse en un cam po elctrico). Para detectar isoenzimas se realiza
una corr ida electrofortica en condiciones no desnat uralizantes y luego se debe
suministrar el sustrato y los cofactores apropiado s para que ocurra una reaccin tal que
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 19
ciertos patrones de
dif erenciacin se ha utilizado como punto de p artida para lograr el aislam iento de genes
asociado s a un aspecto determ inado del desarrollo, por ejem plo para identificar genes
relacionados con el pro ceso de em brio gnesis. Kiyosue et al. (1992) lo graron aislar un
clon de cDNA que codif ica ECP31, una proten a asociada con clulas em br iognicas de
zanahoria.
En esta prctica se harn extracciones de protenas de tejido s vegetales
cultivados in vitro, posteriormente se separar n por electroforesis en geles de
poliacrilamida y sern visualizadas por tincin con Azul de Coomassie. Fin alm ente, se
analizarn los resultado s o btenidos y su aplicacin al est udio de los cultivos de tejidos
vegetales.
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3. MATERIALES Y M TO DO S
3.1. Extraccin y cuantificacin de protenas.
a. Pesar 500 mg de hojas, p ulver izar las con nitrgeno lquido y m acerar en fro con 1 m l
(2 volm enes) de am ortiguador de extraccin A. (2,3 v eces). Prep arar el
am ortiguador de extraccin A en el momento de usar (10 ml Stock Buff er A + 150
mg PVP, 100 l -Mercaptoetanol).
b. Transferir el macerado a tubos de microcentrf uga y centrifugar por 20 m inutos a
13.000 rpm.
c. Recoger el so brenadante en otro tubo y centrif ugar nuev am ente por 10 minutos.
d. Tomar 100 l del sobr enadante para determ inar la concentracin de protenas
solubles por el m todo Bradfor d. Par a esto, se le aade 1 m l del r eactivo de Bradfor d
a los 100 l del extracto, usan do 100 l de Amortiguador de Extraccin A como
blanco, la con centracin se estim a utilizando una curva patrn de Albmina de Suero
Bovino ( el mtodo de Br adford se encuentra descrito al fin al de esta prctica).
e. Medir el volumen del resto del sobrenadante y calcular la cantidad total de protenas
en el extracto.
f. Para precip itar las protenas, se a aden al so br enadante 1/10 vo lm enes de cido
Tricloroactico 100% (-20C) con 1 % -Mercaptoetanol, y se incuba durante 2
horas a -20 C, en este punto se p uede dejar toda la noche.
g. Recoger las protenas por centrif ugacin a 5.000 rpm, 4C, 5 m inutos.
h. Descartar el so brenadante decantando. Elim inar la mayor cantidad po sible de cido
Tricloroactico invirtien do lo s tubo s so bre pap el absor bente.
i. Lav ar el precipitado con etanol 100% (-20C) tres veces, 5 minutos cada vez. En cada
lavado, use el vortex para despegar el p ellet del tubo.
j. Descartar el etanol decantando, y dejar que se evaporen los restos de etanol en fro, es
decir, sobre hielo y en la cam pana extractora de gases.
k. Resuspen der las protenas en am ortiguador de m uestra Laemm li 2X m odif icado (5 m l
Laemmli 4X + 500 l -Mercaptoetanol + 4.5 m l Agua destilada).
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
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El clculo del vo lum en del Amortiguador Laem mli que se utilizar para resuspen der
las proten as precipitadas, se determ ina en base a la cuantificacin de protenas que
se hizo por el m todo de Bradfor d. La p astilla se resuspen de en un volumen de
am ortiguador tal, que permita cargar en el carril del gel 50-200 g de protena. Por
ejemplo, que en 25 l de am ortiguador (volum en mximo que p uede car gar se en el
bolsillo del gel) queden disueltos 50 a 200 g de proten a.
l. Transferir el extracto de protenas a un tubo de microcentrfuga. Centrifugar 3-5
minutos, calentar a 95 C por 5 m in y aplicar la muestra al gel el m ism o da. Si no se
va a aplicar el m ismo da, se almacena a -70C por el menor tiempo posible. Nota:
Hacer un pequeo agujero a los tubo s eppen dorf antes de calentar para que las tapas
no se abr an por la pr esin del vapor.
c. Utilizan do el peine como gua, hacer una marca en el nivel hasta el cual debe llegar el
gel.
d. Preparar las m ezclas de acrilamida para el gel sep arador y el gel con centrador segn
la siguiente tabla. Se prepar a la mezcla para am bos geles sim ultneamente pero sin
agr egarle el N,N, N, N- Tetrametil-etilendiam ina (TEMED) n i el Per sulfato de
Am onio (P SA), estos do s se agr egan justo antes de vertir la mezcla en el m olde.
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Solucin
Gel Separador
(14%)
Gel C oncentrador
(5%)
4.67 m l
0.84 ml
3.76 m l
1.46 m l
50 l
0.63 ml
3.48 ml
25 l
TEMED
10 l
5 l
PSA 10%
50 l
25 l
Pasteur llenar con esta m ezcla el espacio entre lo s dos v idrio s, hasta la
marca hecha prev iam ente. Esto debe realizar se rpidamente y evitando que queden
bur bujas en el gel.
f. Con un a pipeta Pasteur, agregar suavem ente agua sobre el gel, y esper ar hasta que el
gel polimerice (aprox imadam ente 20 min).
g. Se saca el agua con mucho cuidado y se seca utilizan do pap el de filtro. Colocar el
peine, agregar el TEMED y PSA a la mezcla del gel concentrador y vertirlo de la
misma forma que el gel separador.
Esper ar que polim erice el gel concentrador (aproximadam ente 10 m in), y retirar el
peine con m ucho cuidado. Lavar lo s bolsillo s con un piceta con agua destilada.
h. Agr egar una pequea cantidad de grasa de vaco a la U gris del electrodo y arm ar el
sandwich con los geles. Agr egar am ortiguador de corrida en la estruct ura que
contiene lo s geles par a comprobar que no hay f uga de lquido. Colocar el sandwich
dentro de la cubeta de electroforesis que ha sido llenada previamente con
am ortiguador de corr ida.
i. Usando un a jerin ga Ham ilton, car gar en el gel lo s m arcador es de peso m olecular
previamente calentados a 95 C dur ante 5 min utos, y luego el volum en de muestra
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 23
Page 24
minutos justo
antes de cargar en el gel.- Car gar 12 l de esta m ezcla para un carril en m inigeles
(aprox.3.6 g de cada marcador) o Car gar 30 l en geles gran des. Preparar aparte el
Quim iotripsingeno: Mezclar 8 l de Quim otripsingeno con 92 l de
Am ortiguador Laemm li de m uestra 2X.
f. Am ortiguador de Corrida TRIS-G licina 10X: Disolv er en agua destilada 15 g de
Tris Base, 72 g de Glicina y 5 g SDS, afor ar a 500 ml con agua destilada. Para
realizar la corrida tomar 50 ml del stock 10X y llevar a 500 ml con agua destilada,
mezclar bien la solucin antes de a adirla a la cmara de electroforesis.
g. Solucin de Tincin Azul de Coom assie R. Mezclar 150 ml de metanol con 50 m l
de cido actico, llevar el volum en a 500 ml, luego agr egar 1 g de Azul de
Coom assie R y disolver.
h. Solucin de Destincin: Mezclar 100 m l de metanol, 100 ml cido actico y llevar el
volum en a un litro con agua destilada.
4. BIBLIO G RAFA
Harris, E:L. V. y An gal, S. (Eds.). 1989. Protein purification m ethods. Ed. I. R.L.
Press, Oxfor d, 317 pags.
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 25
Kiyosue, T., Yamaguchi-Shino zaki, K., Shinozaki, K., Higashi, K., Satoh, S.,
Kamada, H. and Har ada, H. 1992. Iso lation and characterization of a cDNA that
encodes ECP31, an em bryo genic-cell protein from carrot. Plant Molecular Biology
19: 239-249.
Laemmli, U.K. 1970. Clevage of struct ural protein s durin g the assem bly of the head
of bacteriophage T4. Nature 227 : 680-685.
Menndez- Yuff, A., Gar ca de Garca, E. y Segur a-Nieto, M. 1994. Com parative
study of protein electrophoretic patterns during em bryo gen esis in Coffea a rabica cv.
Catim or. Plant Cell Reports 13: 197-202.
Page 26
Aplicar un
clculo de regresin lineal y dibujar la recta estim ada. Esta curva se utilizar p ara
estimar la cantidad de protenas en una muestra pro blem a.
Anlisis de regresin lineal:
Y = B + AX
Donde:
Y = absor bancia
X = concentracin de la solucin a medir
B = p unto de corte con el eje Y
A = p endiente de la recta
Page 27
PRCTICA N 7
Extraccin de A DN vegetal
1. O BJETIVO S
1.1. Fam iliarizar al estudiante con la tcnica de extraccin y purificacin de
ADN genmico de plantas.
1.2. Determinar la p ureza y concentracin del ADN extrado m ediante tcn icas
espectrofotom tricas.
1.3. Realizar la electroforesis en gel de agaro sa del ADN extrado.
1.4. Enfatizar la importancia de la o btencin de ADN vegetal en la aplicacin de
la tecnologa del ADN recombinante.
2. INTRO DUCCI N
Desde que W atson y Cr ick en 1953 form ularon la natur aleza de doble h lice
complem entaria del ADN, el anlisis de su estruct ura y f uncin aclar las bases de los
procesos biolgicos. Mucho de nuestro entendim iento actual de la gentica m olecular
est basado en lo s hallazgos de las funcion es del ADN, las cuales vien en determinadas
en gr an extensin por la estr uctura fsica de la doble h lice.
Una cadena de ADN es un polmero lar go, no ramificado, com puesto de slo
cuatro tipos de subunidades. Estos son los desoxiribon ucletidos que contienen las bases
Adenina (A), Citosina ( C), Guanina ( G) y Tim ina (T). Los nucletidos estn unido s por
enlaces fo sfo diester covalentes que un en al Carbono 5 de un gr upo desoxiribo sa con el
Carbono 3 del prximo.
La caracterstica esencial del modelo de do ble hlice, es que todas las bases de la
m olcula de ADN estn en el lado interno de la doble hlice, con los azcares fo sfato
del lado externo. Esto hace que las bases de una hlice estn m uy cercanas a las de la
otra hlice, lo cual requier e un apareamiento entre un a base pur ina gr ande (A o G) en
una cadena y una base pirimidina pequea (T o C) en la otra. Luego los estudios
bioqumicos dem ostraron que el apareamiento ocurra entre A y T y entre G y C.
La estructura del ADN provee las bases de la h erencia. Un gen lleva la
informacin biolgica en una form a que debe ser copiada fielmente y transm itida de
cada clula a todas las de su pro genie.
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 28
11
10 pb en Arabidop sis thaliana hasta 2 x 10 p b p ara ciertas gim nosperm as. Estudio s en
biolo ga molecular de plantas han mostrado que la mayora del ADN en plantas de
genom as gr an des, es ADN repetitivo. En contraste con el ADN que codifica par a genes
que son traducido s a proten as, el ADN repetitivo, en vez de codificar para genes, juega
un pap el en la or gan izacin del genoma vegetal, expresin gn ica y desarrollo.
Page 29
3. MATERIALES Y M TO DO
3.1. Extra ccin y purificacin de ADN
Mtodo segn Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1990. I solation of plant DNA from fresh
tissue. Focus 12:13-15.
a. Macerar de 100 a 150 mg de material vegetal con Nitrgeno lquido.
b. Mezclar con 700 l de amortiguador par a la extraccin de DNA ( CTAB 2X, 10% de
-mercaptoetanol, el cual se aade antes de usar).
c. Co locar el macer ado vegetal en un tubo Epp en dorf de 1.5 ml.
d. Incubar a 65C durante 45 m inutos, agitando en un vortex cada 15 minutos.
e. Permitir que las m uestras se enfr en a temperatura ambiente durante 2 minutos.
f. Centrif ugar en una centrifuga Eppen dorf a m xima velocidad durante 20 m in utos.
g. Transferir el sobrenadante a un tubo Eppendorf de 1.5 m l y aadir 500 l de CIA
(Cloroform o: Alcohol isoamlico 25:1), mezclando el tubo suavemente por
inversin, para evitar la ruptura del ADN.
h. Centrif ugar la m ezcla durante 5 m in utos a mxima velocidad en un a centrif uga
Eppen dorf.
i. Transferir la fase acuosa (super ior) (teniendo cuidado de no contaminarla con la
interfase blanquecina) a un tubo Eppendorf de 1.5 ml, y agregar 50 l de CTAB
10X. Mezclar suavem ente.
j. Repetir la extraccin con CIA (p aso g-h).
k. Agregar 500 l de I sopropanol fro (- 20 C). Mezclar por inversin del tubo varias
veces y m antener a -20 C durante 30 m inutos par a la precipitacin del DNA.
l. Centrifugar a 14.000 r.p.m . por 20 m inutos.
m . Eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el pellet de ADN, que se
dejar secar de 1 a 2 minutos invirtiendo el tubo so bre un papel absor bente.
Page 30
Page 31
[FINAL]
[STO CK]
100 ml
2%
2,00 g
1,4 M
8,12 g
20 mM
0,5 M pH 8.0
4 ml
100 mM
1.0 M
10 m l
PVP
Agua destilada
1%
1 gr
Volum en final 100 ml
Page 32
REAC TIVO S
[FINAL]
[STO CK]
100 ml
2% CTAB( Hexadeciltrimetilamonio)
10 %
10,00 g
0,7 M
4g
20 mM
0,5 M pH 8.0
4 ml
100 mM
1.0 M
10 m l
Agua destilada
c. Am ortiguador TE
Reactivos
10 mM Tris HCl p H: 8,00
1 mM EDTA pH: 8,00
[Stock]
1l
1M
10 ml
0.5 M
2 ml
4. BIBLIO G RAFA
Br uce, A., B. Dennis, J. Lewis, M. Raff, K. Ro berts, J.D. Watson. 1994. Molecular
Bio lo gy of The Cell. Thir d Edition. Gar lan d Publih ing, Inc. N.Y. 1294 pp.
Nordheim , a., R.E. Herrera, K. Meese, L. Runkel, P.M. Scholten, H. Schrter and
P.E. Shaw. 1988. Str uct ural an d Topological Polymorphism of DNA. In: Kah l, G.
Page 33
(De.) Architecture of Eukaryotic Gen es. VCH Ver lagsgesellschaft m bH, D-6940
Weinheim . 518 pp.
Sambrook, J., Fr itsch, E. F. and Maniatis, T. 1989. Molecular Clonin g. A Laboratory
Manual. 2nd. Edition. Cold Sprin g Har bor Laboratory Press. N.Y.
Taiz, L. an d E. Zeiger. 1991. Plant Physiolo gy. The Benjamin/ Cumm ings P ublishin g
Company, Inc. N.Y. 565 pp.
Doyle, J.J. an d J.L. Doyle. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus
12:13-15.
Page 34
ANEXO N1.
FORMULACIONES DE MEDIOS DE CULTIVO
MEDIO DE MURASHIGE Y SKO OG (1962)
NO MBRE
CONSTITUYENTES
DEL STO CK
CONC. DEL
STOC K
g/l
VO L. STOC K
PARA 1 l
DE MEDIO
CONC. FINAL
EN EL MEDIO
mg/l
NH4 NO3
82.5
20
1 650
KNO3
95.0
20
1 900
H3BO3
KH2PO4
KI
Na2MoO4.2H2O
Co Cl2.6H2 O
1.24
34.00
0.166
0.050
0.005
6.2
170.0
0.83
0.25
0.025
CaCl2.2 H2O
88.0
440.0
MgSO4.7H2O
MnSO4.4H2O
Zn SO4.7H2O
CuSO4.5H2 O
74.0
4.46
1.72
0.005
Na2EDTA
FeSO4.7H2 O
3.72
2.78
10
37.2
27.8
TIAMINA-HCl
0.08
1.25
0.1
370.0
22.3
8.6
0.025
mio-Inositol
100
cido nicotnico
piridoxina
glicina
0.5
0.5
2.0
SACAROSA
30 g/l
AGAR
o
GELRITE
8 g/l
2 g/l
Page 35
NO MBRE
CONSTITUYENTES
CONC. DEL
STOC K
g/l
VO L. STOC K
PARA 1 lt DE
MEDIO m l/l
CONC. FINAL
EN EL MEDIO
mg/l
NH4 NO3
82.5
20
1 650
KNO3
95.0
20
1 900
H3BO3
1.24
6.2
KH2PO4
34.00
170.0
KI
0.166
Na2MoO4.2H2O
0.050
0.25
Co Cl2.6H2 O
0.005
0.025
CaCl2.6 H2O
88.0
MgSO4.4H2O
74.0
370.0
MnSO4.4H2O
4.46
22.3
Zn SO4.7H2O
1.72
CuSO4.5H2 O
0.005
Na2EDTA
3.72
FeSO4.7H2 O
2.78
TIAMINA-HCl
0.08
0.83
440.0
8.6
0.025
10
37.2
27.8
0.4
mio-Inositol
100
AGAR
8 g/l
o
GELRITE
2 g/l
Page 36
M EDIO B5 DE GAMBO RG
CO NC . DEL
V DEL
CO NC . FINAL
STOC K g/l
STO CK
m g/l
ml/l
MACRO NUTRIENTES
KNO3
125.0
20
2 500
MgSO4.7H2O
12.5
20
250
FeSO4.7H2 O
2.78
10
27.8
Na2EDTA
3.36
10
33.6
CaCl2.2 H2O
15.0
10
150
NaH2PO4. H2O
15.0
10
150
(NH4)2 SO4
13.4
10
134
1000.0
10
H3BO3
300.0
Zn SO4.7H2O
200.0
25.0
0.250
CuSO4.5H2 O
2.5
0.025
Co Cl2.6H2 O
2.5
0.025
75.0
0.750
MICRO NUTRIENTES
MnSO4.H2O
NaMoO4.2H2 O
KI
VITAMINAS
mg/40 ml
Ac. Nicotnico
20.0
Piridoxina
20.0
Tiamina
200.0
Inositol
Sacaro sa
1
2
1
10
100 mg/l
20 g/l
Page 37
SO LUC IO N HO AGLAND
MAC RO ELEM ENTO S
MO LARIDAD
SO LUCIO NES S TO CK
VO LUMEN A AGREG AR
PARA 1 LT DE MEDIO
(ml)
Ca( NO3)2
1M
K(NO3)2
1M
MgSO4
1M
KH2PO4
1M
FeCl3
1M
MO LARIDAD
VO LUMEN A AGREG AR
SO LUCIO NES S TO CK
PARA 1 LT DE MEDIO
MIC RO ELEMENTO S
(ml)
H3BO3
2.86 g/l
MnCl2.4H2O
1.81 g/l
ZnCl2
0.11 g/l
CaCl2.2 H2O
0.05 g/l
Na2MoO4.2H2O
0.025 g/l
Page 38
ANEXO 2
TRMINO S UTILIZADO S EN CULTIVO DE TEJIDO S VEG ETALES
ADVENTIC IO . Desarrollo de una estructur a en p untos de origen inusuales, por ejem plo
vstagos o races originados de un callo o embriones que no se forman a partir de cigotes.
ANTIBI TICO . Sustancia nat ural, de peso m olecular relativamente bajo, producida por
m icroorganismos, inhiben el crecim iento o destruyen a otros organismos. La toxicidad
generalm ente es selectiva.
PIC E. (shoot tip, stem tip, shoot apex) Comprende el m eristem a y los primordios
foliares.
ASEPSIA. Sin infeccin o m icroorganismos contaminantes en el cultivo.
BIO TEC NO LO GA. Aplicacin de principios cientficos y de in geniera al
procesam iento de materiales por agentes biolgico s para producir bienes y servicio s.
C ALLO (C ALLUS). Un tejido constituido por clulas dediferenciadas generalm ente
producido como resultado de heridas o al cultivar un explante in vitro.
C EPA C ELULAR. Una cepa celular se deriva ya sea de un cultivo primario o de una
lnea celular por la seleccin o clonaje de clulas que tienen propiedades o marcadores
especficos. Al describir una cepa celular, deben definir se sus caractersticas especficas.
C L N. Grupo de organism os genticamente idnticos producido por proceso asex ual o
sexualmente por autopolinizacin (inbreeding) de lneas puras. En cultivo de clulas
procariticas o eucariticas, el trm ino cln es em pleado para describir un a poblacin de
clulas descen dientes de un solo pro genitor. En biolo ga m olecular se utiliza para copias
m ltiples de secuencias idnticas de DNA que son pro ducidos cuando son insertados
dentro de un vehculo como un plsmido u otros vectores.
C RECIMIENTO . Aum ento irreversible en el tamao, volum en o longitud, el cual
generalm ente es acompaado por un increm ento en peso seco y en la cantidad de
protoplasma. Generalmente el crecim iento incluye divisin y alargamiento celular.
C ULTIVO DE TEJIDO S VEG ETALES. Mantenimiento o crecimiento de clulas
vegetales, tejidos, r ganos o plantas com pletas in vitro. El cultivo de tejido s vegetales son
una serie de mtodos que se utilizan en la m ultiplicacin y mejoramiento de plantas y
actualmente se emplean para hacer estudios fisiol gicos, bio qum icos, de m orfognesis,
anatoma, etc.
C ULTIVO DE CLULAS. Este trmino es usado para denotar el crecim iento de clulas
in vitro incluyen do el cultivo de clulas aisladas. En los cultivos celulares, las clulas ya
no estn organizadas en tejidos.
C ULTIVO DE RGANO S. Es el mantenimiento o crecimiento de primordio s de
rgano o del total o partes de un rgano in vitro de tal m odo que p ueda permitir la
diferenciacin y preservacin de su arquitectura y funcin.
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
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Page 40
Page 41
Page 42
Page 43
YEMA. Rudimento de un vstago, que se form a habitualm ente en la axila de las hojas y
suele estar protegida por una serie de catfilo s. Este tipo de yem a se llama axilar, para
diferenciarla de la yema term inal del vstago, constituida por el punto vegetativo y por las
hojitas jvenes m s prximas, que, dotadas de rpido crecimiento, se comban sobre l.
G LO SARIO
ADN RECO MBINANTE
BIBLIO TEC A DE DNA. Es un conjunto de fragmentos clonados de DNA que en su
totalidad representan el genoma com pleto de un or ganismo.
BIBLIO TEC A DE cDNA. Secuencias de DNA clonadas deriv adas de la transcripcin
reversa de todos los mRNAs de un organism o.
cDNA. Es un DNA de cadena simple complem entario a un RNA.
C EBADO R ("PRIMER"). Es una secuencia corta (a m enudo de RNA) que se aparea
con una hebra de DNA de cadena sencilla y que provee un extremo 3'-OH en el cual la
DNA polimerasa inicia la sntesis de una caden a de desoxiribon ucletido.
C ISTR N. Un segm ento de DNA que especifica una cadena de polipptido en la sntesis
de protena.
C L N. Se denomina as a un gran nm ero de clulas o molculas
todas idnticas a una molcula ancestral.
C LO NAJ E. El clonaje de un fragm ento de DNA perm ite producir cantidades in defin idas
del fragm ento.
DES NATURALIZACI N. del DNA o RNA describe la separacin de las dos cadenas
de una m olcula duplex de DNA; con frecuencia la separacin de las cadenas se logra por
calentam iento. Desnaturalizacin de una protena describe su conversin desde la
conformacin fisiolgica a alguna otra conform acin (inactiva).
DNA RECO MBINANTE. Conjunto de procedim ientos por los cuales se r econstruyen
m olculas de DNA por unin de secuencias de f uentes diferentes.
DNA SATLITE. Consiste de muchas repeticiones en serie (idnticas o relacionadas) de
una unidad bsica corta repetitiva.
"DOWNSTREAM". (corriente abajo). Son las secuencias de DNA que se encuentran
despus del p unto de iniciacin de la transcripcin de un gen, la transcripcin usual del
m RNA se hace en sentido 5' a 3'. Norm alm ente la transcripcin o curre de izquierda
("upstream") a derecha ("do wnstream"). Identifica secuencias que se encuentran ms all
en la direccin de expresin; por ejem plo, la regin co dif icante de un gen est
"down stream " desde el co dn de iniciacin.
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Page 45
NO RTH ERN "BLO T". Es una tcnica para transferir RNA desde un gel de agaro sa a
una m atriz slida en el cual p uede se hibr idizado con un DNA com plementario.
PAR DE BASES (bp). es una asociacin de A con T o de C con G en una do ble hlice de
DNA; otros pares son posibles en el RNA bajo ciertas circunstancias.
PCR. (Reaccin en cadena de la polim erasa). Es la m ultiplicacin de un fragm ento de
DNA a partir de un par de cebadores o "primers" (oligonucletido) en ciclos r epetidos por
accin de una DNA polimerasa termoestable llam ada Taq polim erasa. Representa una
forma de clonaje molecular sin clulas.
PLSMIDO . Es un DNA circular extra cromosm ico autnom o y autorreplicativo.
PRO MO TO R. Es una regin del DNA involucrada en la un in de la RNA polimerasa
para iniciar la transcripcin, por lo cual representa un punto crtico en el control de la
expresin gentica.
REPETICIO NES DIREC TAS. Secuencias de DNA idnticas o estrecham ente
relacionadas presentes en dos o ms copias en la misma orientacin en la m ism a
m olcula:
Ejem plo:
5' AGTCA.................AGTCA 3'
3' TCAGT.................TCAGT 5'
RFLP. (" Restriction Fragment Lenght Polymorphisms"). Se ref iere a las diferencias en el
DNA que alteran los sitios de r estriccin de enzimas. Por ejem plo, el cam bio de bases en
el sitio diana de una enzima de r estriccin causa que al hacer el clivaje de esta cadena de
DNA con dicha enzima, los fragm entos resultantes tengan diferentes tamaos, lo cual
puede evidenciar se al separar dicho s fragmentos en un gel.
RAPD. (" Ran dom Amplified Polym orphic DNA"). Amplificacin al azar de segmentos
de DNA mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (P CR) con cebadores de
secuencias ar bitrarias de nucletido s.
REPETICIO NES INVERS AS. Comprende dos copias de la misma secuencia de DNA
repetidas en orientacin opuesta en la m ism a m olcula. Las repeticiones adyacentes
invertidas con stituyen un palndrom e.
SECUENCIA CO NSENSO . Es una secuencia idealizada en la cual cada posicin
representa la base encontrada m s frecuentem ente cuando se com paran muchas
secuencias reales.
TERMINADO R. Es una secuencia de DNA, que le in dica a la RNA polim erasa la
terminacin de la transcripcin.
TRANSC RIPTASA REVERSA. Una enzim a que sintetiza DNA usan do RNA como
templado. Las tecnologas de DNA r ecom binante la utilizan para la sntesis de DNA
complem entario (cDNA) a partir de mRNA.
Page 46
SO UTH ERN (Transferencia por el m todo Southern, "So uthern blot"). Describe el
procedim iento para transferir DNA desde un gel de agarosa a un filtro de nitrocelulosa,
donde puede ser hibridizado con un cido nuclico complem entario.
TRANSFO RMACI N. En cultivos celulares de plantas, la introduccin e integracin
genm ica estable de DNA forneo en una clula vegetal por algn m edio, resultando en
una m odificacin gentica.
TRANSG NICO . Son todos aquello s organismos superiores que han sido modificados
genticam ente por ingeniera gen tica.
TRANSPOS N. (elem ento transponible). Segmento discreto de DNA que es capaz de
replicarse o escin dirse e in sertarse en una nueva posicin del genoma. (segmentos de
DNA que tienen la capacidad de cam biar su posicin en el genoma).
"UPS TREAM" (corriente arriba). Son las secuencias de DNA que se encuentran antes
del punto de iniciacin de la transcripcin de un gen, la transcr ipcin usual del m RNA se
hace en sentido 5' a 3'. I dentifica secuencia que se encuentran en direccin opuesta a al
expresin.
"WESTERN B LO T". Tcnica anloga al Southern, la cual luego de la separacin de
protenas por electroforesis en un gel, las transfiere a una m atriz donde son inmobilizadas,
y luego son visualizadas utilizando sondas inm unolgicas marcadas con radioactividad o
fluorescencia.
Page 47
ANEXO N3
Axilar
Blade
Bud
Branches
Glasshouse
Culture
Clean
Cut
Check
Container
Culture m edia
Dispense
Dip
Develop
Embryo
Excised
Explant
Field
Fresh
Flask
Growth
Glass
Gr eenhouse
Hood
Harden
Leaf
Leaflet
Labware
Tissue culture
W ash
axilar
Measurem ent
medida
lmina u hojilla
Main
principal
yema
Mature
maduro
ramas
Night
noche
invernadero
Nodal (node)
nudo
cultivo
Output
produccin
lim piar, limpio
Overgrown
sobrecrecimiento
cortar
Only
solamente
verificar
Plants
plantas
depsito
Planting
transplantar
m edio de cultivo
Placed
colocar
distribuir
Pot
maceta
sumergir
Plasticware
material de plstico
desarrollo
Petri dish
placa de Petri
em brin
Primordium (dia)
primordio(s)
seccionar
Root
raz
explante
Rot
pudricin
campo
Rinse
enjuagar
fresco
Supply
sum inistro
frasco
Surface
superficie
crecer
Shoot
vstago
vidrio, cristal
Stem
tallo
invernadero
Set
conjunto
campana
Sh ipm ent
enviar
dureza
Seedlin g
plntula
hoja de la planta
Seed
sem illa
fololo
Size
tam ao
m aterial de laboratorio Shaker
agitador
cultivo de tejidos
lavar
Page 48
Papa
Crisantemos
Papa
GUIA DE INFORMES
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
Page 49
GUA DE INFORME
PRCTICA N2
S EM ANA
MEDIO 1
MEDIO 2
MEDIO 1
MEDIO 2
(sin hormonas)
(sin hormonas)
2
4
6
8
10
12
14
Escala a utilizar:
0
+
++
+++
=
=
=
=
no crecim iento
muy poco crecim iento
crecim iento intermedio
m ucho crecim iento
b. Cada dos sem anas, tome nota de las siguientes caractersticas de lo s cultivos:
b1. Color acin
b2. Presencia de tran sformaciones hiperhdricas
b3. Presencia de p seudotalos
b4. Consistencia del callo (fr iable o com pacto)
b5. Presencia de embrion es somticos:
b5.1. Describir m orfolgicamente lo s embr iones
b5.2. Contar el n mero de embrion es por explante
Guia de Cultivo d e Tejidos Vegetales
Page 50
Page 51
GUA DE INFORME
PRCTICA N 3
Organognesis
1. Realice observacion es de los cultivo s de callo de tabaco en el microscopio
estereo scpico cada 2 sem anas y
de transform aciones
hiperhdricas.
c. Presencia y cantidad de brotes y/o races. En este caso anote aparte sus
caractersticas morfolgicas.
Para facilitar el registro de las o bservaciones en la tabla, utilice las abr eviat uras
siguientes:
Cuantifique el crecim iento desde 0 h asta +++
TH = presencia de transform acin hiperhdrica
CF = callo friable, CC = callo compacto (no friable)
V = color ver de, M = color crem a
PT = presencia de p seudotalo s
B = presencia de brotes, ( ) indicar entre par ntesis la cantidad
R = presencia de r aces, ( ) in dicar entre parntesis la cantidad
Ta bla 1. Cultivo de callo de tabaco
S EMANA
M EDIO 1
MEDIO 3
MEDIO 4
MEDIO 5
(control)
2
4
6
8
10
12
14
Page 52
2. Relacione la com posicin de los medios de cultivo con las r espuestas observadas en
los tejido s. Compare los resultados con los reportados por Skoog y Miller (
).
SEMANA
OBSERVACIO NES
2
4
6
8
10
12
14
Ta bla 3. Peso fresco (PF) y peso seco (PS) de los callos de tabaco crecidos en
diferentes medios de cultivo.
SEMANA 1
Medio 1
Medio 3
Medio 4
Medio 5
1
2
3
4
5
6
Page 53
6. Con lo s datos de la Tabla 3 elabore un grf ico par a cada parm etro (PF, P S) y en
cada uno dibuje las curvas de cr ecim iento para cada medio de cultivo.
7. Interprete el gr fico elabor ado en el p unto 6 y com pare el efecto de la com posicin
de los medios de cultivo sobr e el crecim iento de los cultivos.
8. Cul de los p arm etros m edidos considera usted m s aprop iado para evaluar el
crecim iento de lo s tejido s?. Considera usted que lo s m todo s utilizados son
igualm ente apropiado s para estim ar el crecimiento en otros sistem as de cultivo in
vitro (cultivo s en susp ensin, em br iones cigticos, microesquejes, races, etc.)?
Page 54
GUIA DE INFORME
PRCTICA N 6.
Extraccin de protenas en tejidos vegetales
cultivados in vitro .
1. Durante la realizacin de la prctica, com plete el siguiente cuadro con sus dato s.
Muestra
D.O .
g de Protena
Volumen de
Protenas
Volumen de
en 100 l
sobrenadante
Totales en la
acetona para
(ml)
muestra
precipitar
(g)
(ml)
g de protena total
Volumen de
Volumen de
en la muestra
Resuspensin
C arga
(l)
(l)
NO TA: recuerde tomar nota del or den en el cual carg los estndares de peso m olecular
y las m uestras en el gel.
3. Anexe a este inform e una fotocopia de la foto del gel obtenido en la prctica, y
seale en dicho gel lo siguiente:
a. Al lado de cada ban da correspon diente a los estndares de peso molecular, indique
su peso.
Page 55
Page 56
GUIA DE INFORME
PRCTICA N 7
Extraccin de A DN vegetal
EXPERIMENTO 3.2.
1) Anexe una fotocopia de la fotograf a del gel de agarosa luego de la corrida
electrofortica, y se ale los siguientes aspectos:
a- Identifique cada carril del gel.
b- El peso m olecular (p b) de las ban das del marcador de peso molecular utilizado
c- El peso molecular (p b) aprox imado del ADN extrado.
2) Discuta so br e la cantidad de ADN genmico en plantas superior es.
3) Discuta acerca de la integridad y p ureza del ADN extrado y relacion e lo o bservado
con el paso o) del protocolo, exper imento 3.1.
4) Cm o podra Ud. calcular la concentracin aproximada de ADN en el extracto
utilizando slo la corrida electrofortica?
5) Qu propiedades influyen en la movilidad de los cidos n ucleico s en la
electroforesis en geles de agarosa?
1) Complete la siguiente tabla.
Muestra
DO 260
DO 280
C oncentracin
(g/m l)
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