Pokok Bahasan IV : TEKNIK ASEPTIS

Pendahuluan
Teknik kultur jaringan mensyaratkan kondisi aseptik, bebas dari bakteri,
jamur, yeast dan jasad renik lain pada setiap tahapan kegiatannya. Hambatan
utama keberhasilan pelaksanaan kultur jaringan adalah adanya kontaminasi
yang dapat timbul baik selama prosedur tersebut dikerjakan maupun selama
kultur dipelihara didalam ruang inkubator. Kontaminasi oleh mikroorganisme
menjadi problem yang sangat serius, karena mikrobia kontaminan akan segera
mengkonsumsi zat hara yang ada pada medium kultur. Mikroorganisme ini
meskipun berukuran sangat kecil, tetapi jumlahnya sangat banyak dan aktivitas
metabolismenya sangat tinggi, jika pertumbuhannya tidak dapat dicegah maka
dalam waktu yang relatip singkat segera mendominasi kultur. Sel dan jaringan
tanaman yang dikulturkan akan mati, matinya eksplan dapat disebabkan karena
dibebaskanya senyawa-senyawa toksik sebagai hasil metabolisme dari mikrobia
kontaminan, dapat juga karena eksplannya "dimakan" oleh mikrobia kontaminan
tsb.
Kontaminasi dapat timbul pada setiap tahapan dari pelaksanaan kultur
jaringan, prosedur kerja aseptis yang harus dikerjakan untuk menanggulangi
kontaminasi adalah:
1. Sterilisasi ruang kerja
2. Sterilisasi medium dan alat-alat
3. Sterilisasi eksplan.

Tujuan Instruksional Khusus:

Setelah mengikuti kuliah ini diharapkan mahasiswa dapat menjelaskan
prinsip kerja aseptik yang meliputi: teknik Sterilisasi ruang kerja, medium, alatalat dan eksplan.

Subpokok Bahasan 1 : STERILISASI RUANG KERJA, MEDIUM, ALAT-ALAT

DAN EKSPLAN

Pendahuluan
Sebagaimana telah diuraikan pada Pokok Bahasan Laboratorium Kultur
Jaringan, kegiatan aseptis dimulai didalam Ruang Steril dan Ruang Inkubasi /
Kultur, kegiatan utama yang dilakukan meliputi sterilisasi dan penanaman
eksplan diatas atau didalam medium kultur. Laboratorium sederhana setidaknya
mempunyai dua ruangan tersebut, yang kebersihannya senantiasa harus
diperhatikan. Ruang kerja yang kotor, akibat terlalu banyak orang yang lalu
lalang didalamnya, dapat mengundang timbulnya kontaminasi. Ruang kultur yang
tidak terpelihara dapat mengundang serangga-serangga kecil untuk masuk
kedalam botol-botol yang berisi medium kultur. Serangga-serangga kecil ini
menimbulkan permasalahan tersendiri karena spora-spora jamur dan bakteri
biasanya ikut lerbawa masuk kedalam botol kultur. Ruang kerja harus mudah
dibersihkan dan dilengkapi dengan AC sehingga senantiasa kering dan sejuk.
Kegiatan sterilisasi medium dan alat-alat dikerjakan diruang persiapan.
Kebersihan dan organisasi laboratorium yang efisien, ditunjang dengan peralatan
yang memadai, dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali.

Materi Subpokok Bahasan 1

Sterilisasi ruang kerja
Ruang kerja yang digunakan untuk pekerjaan aseptis adalah ruang steril,
ruangan ini harus senantiasa bersih, dinding dan lantai bersihkan setiap pagi
dengan zat anti kuman / desinfektan. Udara didalam ruangan disterilisasi dengan
lampu Ultra Violet (UV) yang kekuatannya disesuaikan dengan besarnya
ruangan yang dipakai, lampu ini hanya dinyalakan jika ruangan tidak dipakai dan
harus dimatikan ketika digunakan untuk bekerja. Radiasi UV tidak berbahaya
bagi manusia karena tidak mengion, namun demikian harus diwaspadai karena
dapat mengubah DNA dengan pembentukan dimer antara dua basa tirnin pada
satu rantai DNA. Penetrasi sinar UV utamanya pada bagian superfisial dari
jaringan sehingga dapat melukai kulit dan retina mata. Sinar UV dapat
menghasilkan ozon sehingga peneliti yang akan bekerja haras menunggu 15-30

menit setelah UV dimatikan, maksudnya supaya ozon tidak terhirup.

Peneliti yang akan bekerja didalam ruangan ini haras memakai jas lab.
masker dan tutup kepala, juga harus mencuci tangan dengan sabun antiseptik,
kalau perlu menggunakan sarung tangan dari karet. Didalam ruangan ini terdapat
alat-alat yang dapat menciptakan kondisi aseptis yang terkendali, antara lain
Laminar Air Flow dan stenl box (entkas).
a. Laminar air flow (laf).
Alat ini sangat baik dan efisien, namun harganya relatip mahal untuk
menciptakan atmosfer yang steril dimana pekerjaan-pekerjaan aseptis
haras dilakukan. Prinsip kerja alat ini yaitu dengan hembusan udara yang
sudah disaring (lihat gambar 1).

Gambar 4.1. Laminar air flow dengan bagian-bagiannya (a) udara masuk (b)
blower (c) HEPA filter (d) ruang kerja aseptis (e) prefllter.

Udara yang dihisap oleh blower dihembuskan melalui HEPA (high

efficiency particulate air) filter dengan porositas 0,22 m, spora-spora
jamur dan bakteri akan tertahan, sehingga udara yang berhembus keluar
sudah suci hama, laf kadang-kadang dilengkapi dengan UV. Sebelum
mulai bekerja, permukaan meja kerja laf disemprot dan dilap dengan kain
yang telah dibasahi alkohol 70% atau spiritus, semua alat-alat
dimasukkan ruang kerja (lihat gambar 2. detail ruang kerja). Alat-alat dan
medium harus sudah steril baik permukaan maupun bagian dalamnya,
untuk botol kultur yang berisi media, permukaannya disemprot atau dilap
dengan alkohol 70%. Untuk laf yang dilengkapi dengan UV, sebelum
bekerja lampu UV dinyalakan selama 30-60 menit untuk mematikan
kontaminan pada permukaan ruang kerja.

Gambar 4.2. Detail ruang kerja dan Laminar air flow, botol berisi medium kultur
dan alat-alat harus diletakkan dikanan kiri ruang kerja dan tidak boleh
menghalangi hembusan udara steril.

Didalam laf juga sering dilengkapi dengan instalasi gas yang diperlukan
untuk sterilisasi alat-alat dengan pembakaran, tetapi ini dapat diganti
dengan lampu spiritus atau baktisinerator.
b. Steril box (entkas)
Alat lain untuk dapat menciptakan ruang kerja yang steril dengan harga
yang relatip murah adalah steril box (entkas). Alat ini berujud seperti
kotak yang terbuat dari bahan kaca (lihat gambar 4.3 ), plywood, papan
kayu atau yang lebih sederhana misalnya dari kardus yang didalamnya
dilapisi aluminum foil. Steril box atau entkas dapat dibuat dengan ukuran
sesuai dengan yang dikehendaki, yang penting untuk diperhatikan adalah
tangan kita dapat menjangkau setiap dinding entkas karena akan
memudahkan untuk membersihkannya.

Gambar 4.3 Steril box (entkas) yang terbuat dari bahan kaca
Sebelum mulai bekerja, dinding entkas dibersihkan lebih dahulu dengan
melap kain yang sudah dibasahi alkohol 70%. Ruang kerja didalam
entkas disterilisasi dengan formalin tablet yang ditaruh didalam cawan
porselin kecil dan diletakkan disudut-sudut ruangan, setiap cawan berisi
satu tablet. Uap formalin ini dapat mensterilkan udara yang terdapat
didalam entkas. Alat-alat dan botol kultur yang berisi media disemprot

permukaannya satu persatu dengan alkohol 70% kemudian dimasukan

kedalam entkas, dibiarkan 30 menit baru mulai bekerja. Pada entkas juga
dapat ditambahkan lampu UV, entkas ini seluruh dinding luarnya harus
ditutup dengan aluminum foil, hal ini diperlukan untuk menghindari mata
dan kulit dari bahaya radiasi UV.
Sterilisasi media dan alat-alat
Media yang mengandung bahan-bahan yang tahan panas sterilisasinya
dilakukan dengan pemanasan basah, menggunakan alat yang namanya
autoclave, bekerjanya dengan tekanan uap. Standar teknis untuk Sterilisasi ini
adalah pada temperatur 121C, tekanan antara 15 - 17 psi dengan waktu antara
15-40 menit tergantung dari banyaknya media yang disterilisasi. Untuk 15 ml
media dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 75 ml, Sterilisasi dilakukan
dengan tekanan 15 psi selama 20 menit. Volume yang lebih besar membutuhkan
tekanan yang lebih tinggi dengan waktu yang lebih lama.
Autoclave yang digunakan ada bermacam-macam, mulai dari yang paling
sederhana sampai yang dapat diprogram (programmable). Autoclave sederhana
pemanasan airnya menggunakan kompor gas, sedangkan pengaturan suhu
tekanan dan waktunya dilakukan secara manual. Pada waktu mengoperasikan
autoclave ini, jangan tergesa-gesa menutup klep pembuang sebelum udara yang
ada didalam autoclave diganti seluruhnya oleh uap air yang mendidih sehingga
akan tercapai temperature 121C ( langkah ini tidak dikerjakan untuk autoclave
yang programmable). Setelah waktu Sterilisasi selesai (15-20 menit) klep-klep
pembuang dibuka pelan-pelan, tekanan uap didalam autoclave pelan-pelan akan
sama dengan tekanan atmosfer, pembukaan klep pembuang yang tergesa-gesa
akan mengakibatkan medium yang ada didalam botol kultur mendidih dan
meluap. Alat lain yang mempunyai prinsip kerja mirip dengan autoclave adalah
pressure cooker, alat yang biasa digunakan untuk memasak didapur ini
kapasitasnya sangat terbatas, sehingga tidak dianjurkan untuk pekerjaan pada
skala laboratorium karena tidak efisien. Autoclave yang paling modern adalah
yang programmable, dapat diatur waktu, suhu dan tekanannya secara automatis
sehingga dapat dijalankan sambi! mengerjakan pekerjaan yang lain.

Tabel 4. 1. Lama waktu minimal untuk sterilisasi media

Volume per wadah (ml)

Waktu minimal sterilisasi pada 121C

(menit)

20 50

15

75

20

250 500

25

1.000

30

1.500

35

2.000

40
(Biondi dan Thorpe, 1978)

Sterilisasi medium kultur dengan menggunakan autoclave mempunyai

banyak kelemahan, antara lain:
1. Sukrosa akan terurai menjadi fruktosa dan glukosa
2. Penggunaan temperatur yang tinggi pada autoclave dapat mengakibatkan
terbentuknya caramel gula yang berwarna coklat, merupakan racun
didalam medium kultur
3. Sejalan dengan lamanya waktu sterilisasi, pH medium dapat mengalami
perubahan, terjadi pengendapan garam-garam dan depolimerisasi agar.
Beberapa komponen medium ada yang tidak stabil kalau kena panas
yang tinggi, misalnya GAs, Ca-panthothenate dan Thiamin-HCl harus disterilisasi
dengan ultra filtrasi (Millipore filter) pada suhu ruangan (25C). Dengan memakai
ultrafiltrasi larutan yang berisi bahan-bahan yang termolabil dimasukkan kedalam
medium kultur yang telah steril, langkah ini dikerjakan didalam ruang steril (laf)
ketika medium agar telah agak dingin tetapi belum memadat. Ada beberapa
macam Millipore filter, yang terbuat dari polyethylene film sekali pakai terus
dibuang (disposable), ada Millipore filter yang dilengkapi dengan holder , filter
holder ini dapat disterilisasi dengan autoclave (autoclavable). Porositas dari
filternya juga bermacam-macam, mulai dari 0,22 - 0,45 m. Untuk larutan
termolabil dalam jumlah sedikit (5-50 ml) dengan mudah dapat disterilisasi
dengan Millipore filter yang dipasang pada ujung syrink (alat suntik). Dalam
jumlah besar (50 - 5000 liter) sterilisasi dengan ultrafiltrasi ini harus dibantu
dengan pompa vakum.

Alat-alat yang digunakan didalam ruang steril antara lain : scalpel, pinset
bermacam-macam ukuran, petridish, cork borrer, pipet, alat-alat gelas (botol
kultur dsb), gunting, kertas saring dsb. Alat-alat tersebut, sebelum disterilisasi,
dibersihkan terlebih dahulu kemudian dibungkus rapi dengan kertas coklat. Alatalat yang akan disterilisasi dengan autoclave tidak boleh dibungkus dengan
aluminum foil sebab uap air tidak dapat masuk kedalam bungkusan. Untuk botol
kultur, sebelumnya harus dicuci kemudian ditutup dengan aluminum foil atau
bahan lain yang terbuat dari karet, kain atau plastik yang tahan panas. Botol
kultur dengan penutup yang berulir, tidak boleh ditutup terlalu rapat ketika
disterilisasi, ini diperlukan agar tidak terjadi perbedaan tekanan dengan ruangan
didalam autoclave, perbedaan tekanan akan mengakibatkan pecahnya botol
kultur.
Sterilisasi eksplan
Eksplan adalah bagian kecil dari tanaman baik itu sel, jaringan, ataupun
organ yang digunakan untuk memulai suatu kultur. Eksplan yang digunakan
didalam kultur jaringan harus yang masih muda (primordia), sel-selnya masih
bersifat meristematik. Sel-sel yang bersifat meristematik dicirikan dengan sifatnya
yang selalu membelah, selnya berukuran kecil tetapi inti selnya relatip besar,
penuh plasma, vacuola kecil-kecil, dinding sel tipis terdiri dari dinding primitip
yang berupa selulosa microfibril. Bagian tanaman yang bersifat meristematik
antara lain terdapat pada ujung (kuncup) batang atau akar, dikenal dengan nama
meristem apikal, pada batang disebut shoot apical meristem sedangkan
meristem yang terdapat pada kuncup diketiak daun disebut meristem aksiler
(gambar 4. 4).

Gambar 4. 4. Tanam dikotil dengan kuncup apikal dan aksiler dimana

didalamnya terdapat sel-sel yang meristematik.
Bagian tanaman yang bersifat meristematik seringkali terdapat dalam
keadaan terbuka sehingga kotoran dan berbagai kontaminan seringkali
menempel pada bagian permukaannya. Kontaminan ini dapat berupa bakteri,
jamur dan spora-sporanya, serangga dan telur-telurnya, protozoa dsb. Keadaan
ini terutama dijumpai pada tanaman donor yang tumbuh dilapangan. Kultur
jaringan mensyaratkan kondisi aseptis yang terkendali, jika kontaminan ini tidak
dihilangkan maka medium yang mengandung banyak nutrisi akan dengan cepat
dipenuhi oleh mikrobia kontaminan tersebut. Untuk mengurangi adanya
kontaminan pada permukaan eksplan, tanaman donor sebaiknya ditanam
didalam rumah kaca. Pada beberapa jenis tanaman seperti ketimun dan umbi
akar wortel, seringkali dijumpai adanya kontaminan internal yang terdapat

didalam jaringan tanaman. Kontaminan internal ini sangat sulit untuk diatasi,
karena sterilisasi permukaan tidak akan efektip.
Eksplan yang digunakan ukurannya sangat bervariasi dari yang hanya
dapat dilihat dengan mikroskop (mikroskopis) misalnya mikrospora, shoot apical
meristem, embrio dsb sampai yang berukuran 1 cm atau lebih misalnya ruas
batang, daun, hipokotil, biji, rhizom dsb. Bagian-bagian tanaman tersebut
seringkali masih tertutup oleh jaringan / sarung-sarung daun misalnya pada daun
tebu, hal ini akan memudahkan prosedur sterilisasi karena secara alamiah
bagian daun yang ada didalamnya masih suci hama. Eksplan yang berukuran
terlalu besar akan membawa resiko kontaminasi yang lebih besar, namun jika
digunakan eksplan yang terlalu kecil pertumbuhan dan respon yang diharapkan
juga tidak sebaik jika menggunakan eksplan yang berukuran besar. Dilemma ini
menyebabkan tidak adanya metoda sterilisasi eksplan yang baku untuk semua
tanaman. Hal penting yang harus diperhatikan pada sterilisasi eksplan adalah
bahwa eksplan dan mikrobia kontaminan keduanya adalah jasad hidup,
kontaminasi harus dihilangkan tanpa mematikan eksplan.
Bahan pensteril yang umum digunakan untuk sterilisasi eksplan adalah
calcium hypochlorite , sodium hypochlorite, sublimat/mercuric chloride (HgCl2),
alkohol dsb. Konsentrasi dan lama waktu sterilisasi sangat bervariasi tergantung
dari jenis eksplan dan tempat tumbuhnya. Eksplan yang ditumbuhkan dalam
rumah kaca relatip lebih bersih, sedangkan yang berasal dari lapangan pada
umumnya lebih kotor, lebih terkontaminasi sejak dari awalnya sehingga prosedur
sterilisasi harus dibuat lebih keras dengan meningkatkan konsentrasi bahan
pensteril atau dengan memperpanjang waktu sterilisasi.
Semua bahan-bahan pensteril adalah toksik terhadap eksplan, sehingga
perlu dilakukan pencucian yang berulang-ulang agar semua bahan pensteril yang
menempel dapat tercuci. Untuk meningkatkan penetrasi bahan pensteril,
seringkali ditambahkan 1 atau 2 tetes agensia pembasah ( Triton-X , Tween 20
atau Tween 80) yang fungsinya menambah tegangan pada permukaan eksplan.
Penggunaan pompa vakum juga dapat meningkatkan penetrasi bahan pensteril
pada permukaan jaringan sehingga dapat meningkatkan efisiensi sterilisasi.

Tabel 4. 2. Efektifitas beberapa bahan pensteril

Bahan pensteril

Konsentrasi

Lama

Efektifitas

perendaman
Cacium hypochlorite

(9-10)%

(5 - 30 ) menit

Sangat bagus

Sodium hypoehlorite

2%(bayclin 20%)

(5 - 30 ) menit

Sangat bagus

(10-12)%

(5 - 15 ) menit

Bagus

(1-2)%

(2 - 10 ) menit

Sangat bagus

1%

(5 - 30 ) menit

Bagus

(0,1 - 1)%

(2 - 10 ) menit

Memuaskan

(4 - 50) mg 1-1

(30 - 60) menit

Cukup bagus

Hydrogen peroxide
Bromine water (H2O2)
Silver nitrate
Mercuric chloride
Antibiotics

Bhojwani & Razdan, (1983)

Pra-sterilisasi dengan mencuci eksplan menggunakan sabun/detergent
dan dibiarkan beberapa saat dibawah pancuran air yang mengalir selama 15-30
menit juga diperlukan untuk memecah koloni kontaminan agar lebih peka
terhadap bahan pensteril. Bahan yang sudah bersih dikecilkan ukurannya
kemudian dibawa kedalam ruang steril untuk disterilisasi lebih lanjut. Untuk
sterilisasi eksplan kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan pensteril,
misalnya direndam didalam larutan sodium hypochlorite kemudian dicuci dengan
air steril dilanjutkan dengan perendaman didalam larutan sublimate dan
pembilasan dengan air steril.
Untuk eksplan yang berdaging (umbi kentang, wortel), eksplan yang
tertutup sarung daun (pucuk tebu), dan biji muda yang masih terdapat didalam
buah (anggrek) dapat disterilisasi dengan merendam didalam alkohol beberapa
saat, kemudian dilewatkan diatas nyala api dan dibiarkan sampai nyala api
padam, cukup efektif untuk membawa kultur bebas dari kontaminasi.

Latihan soal-soal
1. Jelaskan bagaimana prinsip kerja autoclave, apa kelemahan sterilisasi
medium dengan autoclave!
2. Jelaskan apa bahayanya sinar UV yang digunakan untuk sterilisasi ruang
kerja!
3. Jelaskan bagaimana prinsip kerja Laminar Air Flow!
4. Jelaskan cara sterilisasi medium dalam jumlah banyak yang ditambahkan
asam-asam amino dan Gibberellin!
5. Jelaskan tahapan-tahapan yang harus dijalankan untuk sterilisasi eksplan
yang berasal dari lapangan!

Petunjuk jawaban latihan soal-soal

1. Ingat cara kerja autoclave dan akibat yang ditimbulkan oleh pemanasan
yang bertekanan terhadap komponen medium!
2. Ingat sifat-sifat sinar UV!
3. Ingat arti Laminar Air Flow!
4. Ingat cara sterilisasi medium!
5. Ingat cara sterilisasi eksplan secara bertingkat!