Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM KIMIA BAHAN ALAM

Kelompok/ gelombang : Chalkon/ IIA


Nama Kelompok :
1.
2.
3.
4.
5.

Ratna Mutiara
(G1F013017)
Triana Dewi
(G1F013019)
Desi Purnamasari
(G1F013021)
Ira Yuliana
(G1F013025)
Nurul Kamilah S.
(G1F013027)

Tanggal Praktikum

: 27 Mei 2015

Nama Asisten Jaga

: Gita dan

Nama Dosen Jaga

: Harwoko, M.Sc, Apt.

LABORATORIUM BIOLOGO FARMASI


JURUSAN FARMASI
FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2015

ISOLASI GLIKOSIDA FLAVONOID DARI Manihot utilissima FOLIUM DAN


IDENTIFIKASI DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I.

II.

TUJUAN PRAKTIKUM
Memahami dan melakukan isolasi dan analisis kualitatif golongan
senyawa flavonoid dari daun ketela pohon (Manihot utilissima) dengan metode
kromatografi lapis tipis.
PENDAHULUAN
Salah satu senyawa yang terkandung di dalam daun singkong adalah
flavonoid rutin. Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mengandung 15
atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6 yaitu cincin benzene yang
dihubungkan oleh tiga atom karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk
cincin ketiga.Flavonoid biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosid. Molekul
yang berikatan dengan gula tadi disebut aglikon. Hampir lebih dari 500 aglikon
dan kurang lebih 2000 flavonoid yang telah dikenal (Mursyidi, 1989). Beberapa
penelitian menunjukkan bahwa rutin memiliki aksi fisiologis yang luas seperti
antiinflamasi, antitumor, antibakteri, dan dapat juga memperbaiki fungsi kapiler
yang abnormal dengan mengurangi kebocoran, mengurangi kerusakan kapiler
vena karena ketidakcukupan ekstremitas bawah (Ghica & Brett, 2004).
KLT dapat digunakan untuk identifikasi senyawa baku. Parameter pada
KLT yang digunakan untuk identifikasi adalah nilai Rf. Dua senyawa dikatakan
identik jika mempunyai nilai Rf yang sama jika diukur pada kondisi KLT yang
sama. Rf (Retardation faktor) merupakan harga perbandingan titik noda dengan
jarak elusi yang ditempuh pada lempeng fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).
KLT untuk analisis senyawa flavonoid pada prinsipnya sama dengan yang
digunakan untuk analisis senyawa organik lain. Pengerjaan KLT pada analisis
flavonoid bertujuan untuk mengisolasi flavonoid murni pada skala mikro. Cara
analisis ini cukup sederhana, dikerjakan dalam tempo yang singkat, dan
dibutuhkan sampel yang sedikit. Sebagai fase diam, selulose mikrokristal, yaitu
avicel sangat cocok untuk isolasi flavonoid. Di samping itu dikenal juga fase
diam lain yaitu silika dan poliamid (Mursyidi, 1989).

III.

BAHAN DAN ALAT


a. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain : aquadest, eter, asam klorida
(HCL 2 N), natrium sulfat anhidrat, lempeng selulosa/kertas kromatografi,
metanol, amonia, pereaksi sitorobat, fase atas dari campuran n-butanol : asam
asetat : air (4:1:5) v/v sebagai eluen.
b. Alat

Alat-alat yang digunakan antara lain : panci infusa, corong besar,


erlenmeyer (50 ml & 250 ml), tabung reaksi, corong pisah (250 ml), cawan
porselin, flakon (3), chamber KLT, pipa kapiler, pinset, alat penyemprot, oven,
lampu UV366 nm.
IV.

CARA KERJA
1. Isolasi glikosida flavonoid dari Manihot utilissima folium

2. Identifikasi flavonoid dengan kromatografi lapis tipis

V.

HASIL PENGAMATAN
No
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.

Perlakuan
Simplisia daun singkong ditimbang
sebanyak 40 gr
Ditambahkan aquades sebanyak 400 ml
dan diinfusa
Infusa dimasukan kedaam erlemeyer dan
disimpan dalam almari es selama
beberapa hari
Kertas saring I ditimbang
Kertas saring II ditimbang
Infusa disaring dan dioven
Sedikit endapan dilarutkan dalam
metanol:air (50:50)
Sisa endapan ditambahkan 10 ml HCl 2
N
Larutan direfluks selama 1 jam
Lapisan bawah dikeluarkan dan
dipanaskan dalam waterbath
Dimasukan kedalam corong pisah dan

Hasil pengamatan

Infusa
Terbentuk endapan
0,44 gram
0,787 gram
Endapan kering
Berwarna agak kehijauan (sari I)
Larutan jernih
Larutan berwarna merah muda
terdapat endapan
Larutan berwarna merah muda
tanpa endapan
Terdapat dua lapisan

12.
13.

23.

ditambahkan n-hekasan 10 ml dikocok


Lapisan bawah dikeluarkan dan
dipanaskan pada waterbath
Lapisan atas disaring dengan
menggunakan kertas saring yang
sebelumnya sudah ditambahkan 1 gr Nasulfat anhidrat
Diupakan tanpa adanya pemanasan
Ditambahkan 2 ml metanol
Disiapkan fase diam (selulosa) fase
gerak (n-butanol:asam asetat:air) (4:1:5)
Cupliakan sari I,II,III dan laruta standar
ditotolakan pada plat KLT
Dimasukan kedalam chamber yang
sebelumnya sudah dilakukan penjenuhan
Dideteksi pada sinar UV 366
Dilakukan penguapan amonia dan
dideteksi dibawah sinar UV 366
Disemprotkan pereaksi sitroborat
kemudian dipanaskan 110 C selama 5
menit dan diamati dibawah sinar UV 366
Ditandai bercak flavonoid

24.

Dicatat nilai Rf dan warna yan terbentuk

14.

15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.

VI.

Berwarna jingga (sari III)


Berwana bening

Sari II

7 cm

1 2
1 2

3
3

4
4

Ket : 1 : sari I
2 : sari II
3 : standar sari I
4 : standar sari II

PEMBAHASAN
Ketela pohon atau Manihot utilissima Pohl. Merupakan tumbuhan yang
bagian daunnya dikenal mengandung flavonoid. Pada percobaan ini, yang
dipelajari adalah melakuakan isolasi glikosida flavonoid dari daun ketela pohon
dan kemudian melakukan analisis kualitatif flavonoid dengan menggunakan
metode kromatografi lapis tipis (KLT) serta analisis kuantitatif dengan metode
spektofotomerti terhadap isolasi tersebut. Langkah pertama, serbuk simplisia
dimasukkan ke dalam panci infusa dan ditunggu sampai mendidih atau suhu panci
atas mencapai 900C dan diabiarkan selama 15 menit. Infusa adalah suatu ekstraksi
dengan pelarut air pada temperature penangas air (bejana infus tercelup dalam
penangas air mendidih, temperature terukur 96-980C) selama waktu tertentu (1520 menit) (Voigt, 1995).
Campuran simplisia yang telah di infusa disaring menggunakan corong
Buchner sehingga diperoleh filtrate yang jernih dan dipindahkan ke dalam
Erlenmeyer. Disimpan di dalam lemari es selama 1 minggu sehingga terbentuk

kristal amorf putih kekuningan. Kristal yang terdapat di dasar Erlenmeyer disaring
dengan kertas saring dan kristal dicuci dengan air es agar kemurnian filtrate
bertambah dan terbebas dari pengotor-pengotor yang tidak ingin diisolasi, tetapi
dengan pencucian ini tidak menyebabkan kristal larut. Kertas saring bersama
endapan dikeringkan pada suhu 500C untuk memperoleh hasil rendemen.
Sedikit endapan dilarutkan dalam campuran methanol-air (sari 1) dan sisa
endapan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan HCL. Sari 1 ini
berisi flavonoid yang masih mengandung glikon dan aglikon (rutin). Flavonoid
merupakan senyawa polifenol dan senyawa polihidroksi yang bersifat polar
sehingga dapat larut dalam pelarut polar seperti methanol, etanol, aseton, air,
butanol, dimetil formamida. Gugus glikon yang terdapat pada flavonoid
menyebabkan flavonoid larut dalam air. Sehingga proses melarutkan sari 1 ke
dalam campuran methanol-air untuk melarutkan gugus aglikon dan glikon yang
terdapat pada flavonoid rutin. Penambahan HCl dimaksudkan untuk proses
hidrolisis agar glikosida flavonoid rutin terhidrolisis sehingga aglikon flavonoid
(kuarsetin) terpisah dengan molekul gulanya. Kuarsetin ini termasuk aglikon
flavonoid (zat bukan gula) yang berdasarkan strukturnya dapat digolongkan
menjadi flavonol. Endapan dilakukan refluks pada penangas air mendidih selama
1 jam dengan ditaruh corong kecil berisi kapas untuk mencegah penguapan.
Refluks mengubah warna larutan flavonoid-HCl menjadi merah muda. Refluks
adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperature titik didihnya selama waktu
tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relative konstan dengan adanya
pendingin balik (Ditjen POM, 2000).
Selanjutnya larutan ini diletakkan di dalam corong pisah kemudian
ditambahkan n-heksan. Perlakuan tersebut akan membentuk dua lapisan. Lapisan
atas merupakan larutan n-heksan dan lapisan bawah merupakan larutan air. Hal ini
menunjukkan terpisahnya glikon dan aglikon. Diantara glikon dan aglikon,
senyawa glikon lebih polar daripada aglikon jadi aglikon akan larut pada pelarut
nonpolar begitu juga dengan glikon akan larut pada pelarut polar. N-heksan
merupakan pelarut nonpolar sehingga akan melarutka aglikon dan air merupakan
pelarut polar yang akan melarutkan gula. Lapisan n-heksan berada di atas
dikarenakan berat molekul n-heksan lebih kecil daripada air. Kemudian kedua
lapisan tersebut dipisahkan. Dilakuakan ekstraksi keduakali dengan penambahan
n-heksan lagi untuk menambah kemurnian kedua larutan. Larutan n-heksan
disaring melalui kertas saring yang berisi 1 gram natrium sulfat anhidrat ke dalam
cawan porselin. Penyaringan melalui natrium sulfat anhidrat dikarenakan untuk
menarik air yang masih terikut dalam larutan n-heksana. Kemudian larutan nheksan diuapkan hingga residu diperoleh dan residu dilarutkan dalam methanol
(sari 2). Metanol digunakan untuk melarutkan senyawa aglikon karena aglikon
larut dalam pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton,

dimetilformadida, dan dimetilsukfosida. Larutan air diupakan di atas penangas air


sampai cairan tinggal kira-kira 1 ml (sari 3) (Grotewold, 2008).
Analisis kuantitatif dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis.
Sebelum dilakukan analisis, dipersiapkan fase diam dan fase gerak (eluen). Fase
diam yang digunakan adalah silica yang bersifat polar dan fase gerak berupa nbutanol: asam asetat: air dengan perbandingan (4:1:5) yang bersifat sangat polar
karena mengandung air dan mampu memberikan pemisahan terbaik. KLT
merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa berdasarkan perbedaan
distribusi dua fase yaitu fase diam dan fase gerak. Kepolaran fase diam dan fase
gerak hampir sama, tetapi masih lebih polar fase gerak sehingga senyawa
flavonoid yang dipisahkan terangkat mengikuti aliran eluen, karena senyawa
flavonoid bersifat polar. Eluen yang baik ialah eluen yang bisa memisahkan
senyawa dalam jumlah yang banyak yang ditandai dengan munculnya noda. Noda
yang terbentuk tidak berekor dan jarak antara noda satu dengan lainnya jelas
(Harborne, 1987).
Fase gerak yaitu campuran larutan n-butanol: asam asetat: air didiamkan
selama 24 jam sehingga terbentuk dua lapisan. Lapisan atas yaitu lapisan yang
mengandung butanol jenuh air digunakan sebagai fase gerak. Detektor yang
digunakan adalah lampu UV366warna/fluoresensi yang terbentuk adalah
fluoresensi kuning-kuning kehijauan dibawah sinar UV366 nm (Bohm, 1998), uap
ammonia, dan pereaksi sitoborat yang bereaksi dengan flavonoid menghasilkan
kompleks berwarna kuning. Sari 1 dan 2 yang telah diperoleh ditotolkan ke plat
KLT sebanyak 5 kali, hal ini bertujuan agar senyawa yang di analisis dapat terbaca
dengan jelas. Di dalam plat KLT senyawa yang ditotolkan selain sari 1 dan 2
adalah standar rutin dan kuarsetin sebagai pembanding dalam melakukan analisis.
Selanjutnya plat KLT dimasukkan ke dalam chamber KLT berisi fase gerak yang
telah dijenuhkan. Cara untuk mengetahui bahwa fase gerak tersebut jenuh di
dalam chamber dengan menggunakan kertas saring yang di masukkan ke dalam
chamber KLT.
Hasil KLT berupa bercak yang terlihat berwarna kuning berasal dari
standar rutin sedangkan senyawa yang di analisis tidak menimbulkan bercak
karena hidrolisis yang belum sempurna dan pemisahan KLT yang kurang
sempurna membuat analisis sulit dilakukan sehingga sulit untuk menghitung nilai
Rf senyawa rutin dan kuarsetin.

VII.

DAFTAR PUSTAKA
Bohm, B, A, 1998, Introduction to Flavonoids, Harwood Academic Publishers,
Netherland.
Ditjen POM, 2000,Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat Cetakan
Pertama, Departemen Kesehatan RI, Jakarta.
Gandjar, G.H., dan Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Ghica and Brett, 2004, Electrochemical Oxidation of Rutin, Departamento de
Qu_mica, Faculdade de Ciencias e Tecnologia, Universidade de Coimbra,
3004-535
Coimbra,
Portugal,
Journal,313-318,
(online),
(http;//www.Electrochemical Oxidation of Rutin, diakses 02 Juni
2015).Grotewold, E, 2008, The Science of Flavonoids, Springer, USA.
Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia Jilid II, Penerbit ITB, Bandung.
Mursyidi, achmad. 1989. Analisis metabolit sekunder,UGM Press, Yogyakarta.
Voight, R., 1995, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, diterjemahkan oleh
Soendari Noerono, Gajah Mada University Press, Yogyakarta.

Pertanyaan
1. Apakah perbedaan antara infusa dengan dekokta?
Jawab :
Infusa adalah sediaan cair yang dibuat dengan menyari simplisia dengan air
pada suhu 900 C selama 15 menit sedangkan dekokta adalah sediaan cair yang
dibuat dengan menyari simplisia dengan air pada suhu 900 C selama 30 menit
2. Sebutkan keuntungan dan kerugian penyarian glikosida flavonoid dengan air?
Jawab :
Keuntungan :
1. Murah dan sederhana
2. Tidak beracun
3. Tidak mudah menguap
4. Tidak mudah terbakar
Kerugian :
1. Mudah tercemar oleh bakteri dan kapang
2. Tidak stabil bila disimpan dalam waktu yang lama
3. Diperlukan waktu yang lama untuk pengeringan
4. Banyak komponen polar yang larut bersama air
3. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?
Jawab :
Deteksi warna dapat dilakukan untuk mengetahui bahwa hidrolisis yang
dikerjakan telah sempurna.
4. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glokosida) dan aglikonnya?
Jawab :
Rutin merupakan salah satu jenis glikosida flavonoid yang bersifat polar,
sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut polar, seperti air, methanol atau
etanol. Filtrate yang didapat dari hasil penyarian didinginkan untuk
mempercepat pembentukan kristal.Pemisahan aglikon dan glikosidanya dapat
dilakukan dengan hidrolisis asam, seperti menggunakan HCl. Akan didapat
hasil berupa kuersetin dan glukosa dari hidrolisis rutin. Terlihat berupa tidak
berwarna pada sinar tampak, berwarnabiru keunguan pada sinar UV254nm,
biru keunguan pada sinar UV 366nm, dan memberikan fluoresensi berwarna
biru terang dengan penampak bercak AlCl3.
5. Apakah dasar pemisahan senyawa dengan metode kromatografi lapis tipis?
Jawab:
Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan kromatografi
lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan sifat daya serap
masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan terbawa oleh fase
diam (penyerap) dengan membandingkannya dengan standar yang sangat
memakan waktu dan harus dilakukan terpisah pada kondisi eluen yang sama.
Dalam hal ini untuk mendapatkan resolusi yang baik, penting untuk memilih

dua campuran pelarut yang berbeda, meskipun dengan kekuatan pelarut yang
sama
6. Berikan 2 contoh fase gerak lain yang bias digunakan dalam identifikasi
flavonoid?
Jawab :
1. Air-methanol-asam asetat (1:18:1)
2. Benzene-asam asetat-air (125:75:5)