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Parasitismo: asociacin biolgica entre dos especies

vivas diferentes, donde el parsito vive a expensas


del hospedador, obteniendo de ste nutrientes y
proteccin fsica.
Parsito: es metablicamente dependiente del
hospedador y puede eventualmente producirle
dao.
Parasitosis: es un caso de parasitismo en el que
existen manifestaciones clnicas producto del
parasitismo.

Comensalismo: Tipo de asociacin biolgica en


que un agente biolgico vive a expensas de otro
sin producirle dao.

Comensales
No es anormal tenerlos.
Reflejan contaminacin fecal del medio.
Se deben informar en el examen de laboratorio.

No requieren terapia farmacolgica

Protista

Animalia

Algae
Slime molds
Protozoo

Helmintos
X
X
Arthropoda
X

Flagelata
Sarcodina
Ciliata
Esporozoa
Plathelmintos

Nematoda
Acanthocephala

Cestodes
Trematodes

Cuando se requiere un nmero importante de


parsitos libre de contaminantes bacterianos o de
materiales del hospedador
Para estudiar la bioqumica, morfologa, fisiologa y metabolismo de los
parsitos
Para obtener informacin acerca del desarrollo y las necesidades
nutricionales del parsito
Para estudios de infeccin controlados
Para el diagnstico de algunas parasitosis: como complemento de otros
mtodos, para la produccin de antgenos / anticuerpos usados en
ensayos inmunolgicos.
Para el screening de drogas, para diferenciar aislamientos resistentes o
susceptibles a determinado agente quimioteraputico
Para estudios epidemiolgicos, para diferenciar distintos aislamientos
Para la produccin de vacunas

En general el cultivo de estos organismos se utiliza ms en


investigacin y docencia y no tanto con fines diagnsticos.

axnico: el parsito crece en ausencia de ninguna otro


tipo de clula
xnicos: el parsito se crece en presencia de una
microbiota indefinida (ej: cultivo primario de parsitos a
partir de muestras de MF)

monoxnicos: el parsito crece en presencia de una


nica especie adicional (ej. aislamiento Acanthamoeba
de biopsias de crnea en presencia de E. coli)
polixnicos: el parsito crece junto a otros organismos,
pero todos ellos de identidad conocida

in vitro
in vivo

Caractersticas
propias
de los parsitos
Ciclos de vida complejos:
Distintos hospedadores
Distintas formas
morfolgicas o estados
Formas intracelulares
Localizacion subcelulares
Respuesta inmune del
hospedador
Mecanismos protectores
del parsito

Numerosas variables
a considerar para
el cultivo
Distintas temperaturas
optimas
Distintos requerimientos
nutricionales
Cultivos
axnicos/monoxnicos
Distintas especies, cepas o
aislamientos pueden
comportarse de manera
diferente

Simular el habitat de un parsito dentro del

hospedador, especialmente en un sistema


de cultivo in vitro, puede ser
extremadamente complejo, aun
asumiendo que uno ha determinado todas
las variables relevantes

Medios de cultivo complejos definidos e indefinidos


Componentes del medio
Co-factores o complementos
Suero (SFB, suero de caballo, suero humano)
Diferentes marcas o lotes
Material plstico/vidrio
Formas de esterilizacin
Forma y tiempo de almacenamiento
Agua
Alta variabilidad de los componentes, pueden resultar nocivos
para el crecimiento del parsito

El cultivo de microorganismos suele ser de gran ayuda para la


identificacin del agente infeccioso:
Para infecciones bacterianas, el cultivo es frecuentemente el
Gold Standard.
En infecciones virales, por rickettsias o amebas, representan un
buen mtodo de referencia.
En la mayora de las infecciones parasitarias, el cultivo no es
usado de rutina para la identificacin del parsito, pero si es
frecuentemente usado como complemento de otros mtodos
diagnstico o para la confirmacin del agente causal, por ejemplo
para infecciones por:
Entamoeba histolytica
Leishmania spp.
Trichomonas vaginalis (InPouch TV)
Strongyloides stercoralis (Harada Mori)
Amebas de vida libre en infecciones SNC

Entamoeba histolytica
Giardia intestinalis
Trichomonas vaginalis
Balantidium coli
Diantamoeba fragilis*
Blastocystis hominis*
* parsitos de importancia clnica controversial

El cultivo generalmente no es usado con


fines diagnsticos como primera opcin,
sino su identificacin por microscopa

Debido a sus habitats naturales, son


frecuente aislados en presencia de
bacterias y hongos
El xito del cultivo
requiere el control o eliminacin del
crecimiento bacteriano/fngico.

T. vaginalis, G. intestinalis: pueden


establecerse directamente cultivos
axnicos
E. histolytica, B. hominis: cultivo en
presencia de otros organismos (xnicos,
monoxnicos) y posterior axenizacin
D. fragilis, B. coli: no se han cultivado
axenicamente

Amebas del intestino humano: Son las mas

numerosas . Entre ellas la de mayor patogenicidad y


de mayor importancia
medica es: Entamoeba
histolytica.
Amebas no patgenas intestinales (comensales): E.
coli, E dispar, E hartmanni , Endolimax nana y
Iodamoeba butschlii. Entamoeba gingivalis es un
comensal de la boca.

Amebas de vida libre (productoras de


meningoencefalitis): Capaces de invadir el

sistema nervioso central y producir cuadros de


meningoencefalitis: son los gneros Acanthamoeba
y Naegleria.

Protozoo unicelular
Ciclo de vida simple: forma replicativa
(trofozoto) y forma de resistencia (quiste).
Transmisin por ingestion de quistes en agua
o alimentos contaminados con materia
fecal (MF)
Humanos pueden infectarse con al menos 6
especies de Entamoeba, pero solo E.
histolytica es patgena
Es la 3 causa de mortalidad y morbilidad
por infecciones parasitarias en el hombre
(despus de malaria y schistosomiasis)
Se estiman 50,000-100,000 muertes al ao
Tratamiento: metronidazol (Flagyl)

Cultivado por primera vez en 1925 por Boeck y Drbohlav en un


medio bifsico inclinado de huevo, previamente usado para
aislar flagelados intestinales
Locke-egg (LE)* es una versin modificada usada hasta hoy
Dobell y Laidlaw introdujeron el uso de almidn de arroz como
fuente de carbohidratos para cultivos xnicos, (no es
rpidamente metabolizado por bacterias permitiendo alcanzar
el balance ameba-bacteria requerido)
Otros medios bifsicos con suero, agar y extracto de huevo,
Medio de Robinson*
Medios monofsicos: Infusin yema de huevo de Balamuth,
Medio de Jones, TYSGM-9 de Diamond*
* Medios ms usados actualmente para el cultivo de amebas,
tambin usado para otras especies de Entamoeba y para
Endolimax nana

Cultivos Monoxnicos:
Cleveland y Sanders,1930: primer cultivo con una nica bacteria en medio
bifsico
Cultivos monoxnicos con tripanosomtidos (T. cruzi, Crithidia fasciculata)
Hoy solo se usan como punto intermedio para alcanzar un cultivo axnico.
Cultivos Axnicos:
Primera vez logrado por Diamond en 1961 en un medio bifsico complejo
1968: Medio monofsico TP-S-1 (Diamond
1978: Medio monfsico TYI-S-33* (Diamond et al.)
Medio de cultivo axnico casero PEHPS, con extractos de hgado y
pncreas, es una alternativa a los medios comerciales (Said-Fernandez et
al.1988)
Cultivos Clonales:
Obtencin de colonias clonales en agar (Gillin y Diamond,1978; Mueller y
Petri, 1995)
Micromanipulacin para obtener clonar cultivos xnicos (Farri 1978) y
axnicos (Diamond et al. 1976)
* Medios ms usados actualmente

La axenizacin de cultivos de E. histolytica es un proceso largo y


demandante, donde un cultivo xenico es primeramente
adaptado al crecimiento monoxnico, generalmente con un
kinetoplstido como organismo aociado, y luego es llevado de
un estilo de vida fagoctico a uno donde los nutrientes son
obtenidos por pinocitosis. Todo el proceso suele durar meses

Principales componentes para medios axnicos:


Fuente de pptidos y aminocidos (Trypticasa Peptona

de casena)
Acidos nucleicos (extracto de levadura)
Carbohidratos (glucosa)
Lpidos (suero)
vitaminas

Para que cultivamos amebas?


Para poder diferenciar E. histolytica, la nica especie del gnero que
causa enfermedad invasiva, de otras especies morfologicamente
idnticas (E. dispar) mediante anlisis de isoenzimas y evitar
tratamiento innecesario.
Para distintas aplicaciones en investigacin
Cmo obtenemos los parsitos?
Muestras de MF
Biopsias rectales
Abscesos hepticos(en este caso, agregar bacterias para cultivo
xenico.
A menos que la muestra provenga de un paciente con disenteria, las
amebas estarn en la forma de QUISTE

El cultivo de Entamoeba histolytica, debe establecerse como un


CULTIVO XENICO.

Debemos evitar que organismos no deseados crezcan


superando a las amebas.
Quienes son los organismos no deseados y como los eliminamos?
Blastocystis hominis (infeccin parasitaria ms comun en el hombre): capaces de
crecer en todos los medios usados para cutltivos xenicos de Entamoeba.

Con Acriflavina (tb afecta a las bacterias y por consiguiente a las amebas)

Mtodo de Dobell y Laidlaw (1926): Tratamiento con 0.1N HCl a RT 10 min, lavar
con H2Od y re-inocular en el medio de cultivo con bacterias adecuadas.
HCl mata bacterias, hongos, B.hominis, trichomonas intestinales y amebas no
enquistadas, permaneciendo viables e intactos los Quistes.

Mtodo de Smedley (1956): Pelletear todos los organismos presentes en el


cultivo, lavar con H2Od 15min a RT, volver a centrifugar e inocular medio de
cultivo fresco. La mayora de los trofozoitos de Entamoeba sobreviven a este
tratamiento, mientras que B. hominis generalmente no. Algunos B. hominis
pueden sobrevivir, en ese caso se debe repetir el tratamineto.

Otros organismos como hongos o trichomonas generalmente desaparecen de los


cultivos xnicos luego de varios pasajes

Medio LE o medio de Robinson, ideales para comenzar el cult a partir de una


muestra de MF.
TYSGM-9 ms usado para obtener grandes nmeros de amebas a partir de
cultivos ya establecidos.
En todos los casos, agregar almidn de arroz (y antibiticos) al medio previo a
la inoculacin
INCULO:
MF emulsificada en solucin salina
Eliminar partculas grandes mediante filtracin o
flotacin,
que a su vez concentra los quistes
Partculas ms pequeas de MF pueden ser incluidas
Es conveniente incluir porciones de MF que parezcan mucosas o
sanguinolientas si estn presenten en la muestra.
Cultivar en paralelo con/sin ATB (Peni/strepto o eritromicina)
Crecer a 35.5 C por 48 hs.
Las amebas se pueden observar adheridas a las paredes de vidrio del tubo o
sobre el medio inclinado en cultivos bifsicos.
Si a las 48 hs no se observa crecimiento, se hace un pasaje a ciegas: Se enfria el
tubo en H2O helada 5 min p despegar las amebas del vidrio, se descarta el SN y
se inocula medio fresco con el sedimento resuspendido en el lquido remanente
(1ml)

Adaptacin a una
nueva forma de vida

Muestra Fecal
Separar elementos grandes
Enriquecer en Quistes de E. histolytica

Cultivo Xnico
Cultivo Monoxnico
Cultivo Axnico
# Organismos

Lavado PBS p/ eliminar exceso de bacterias


Crecer los Trofozoitos en pcia. de su nuevo
microorganismo alimento# y ATB
Eliminar gradualmente el ATB a medida q n
amebas
Luego de 2 pasajes sin ATB, se puede considerar
el cult libre de bacterias
Cult estable sin bacterias
Pasajes en mismo medio, pero sin Critidia: los
flagelados van desapareciendo por dilucin
e ingesta por las amebas.

asociados: C. fasciculata, T. cruzi: son crecidos como cultivo stock a RT, y no crecen
a la T optima de crecimiento de amebas
ATB: depende de la flora pte. en el cultivo xenico; x ej. Cocktail de rifampin, amikacin,
oxitetraciclina, cefotaxima

Pasajes aprox cada 48-72hs.


Variaciones entre aislamientos y flora pte. impide generalizar el
tamao del inculo, la cantidad de arroz o de ATB a utilizar
para el crecimiento ptimo.

Inspeccin visual previa al pasaje


El cultivo restante del pasaje se puede guardar a 33 C como
'backup'.
Pasaje: Enfriar el cultivo (xnico o axnico) en baos de hielo p
despegar los trofozoitos del vidrio, mezclar por inversin, tomar
un inculo y pasar aspticamente a un nuevo tubo con medio
fresco.
Incubar a 35.5 C, en forma vertical(c. xenicos) o a 5 de la
horizontal (c. axenicos establecidos).

Congelado-descongelado de c. axnicos es muy dificil


debido a que E. histolytica es mucho ms sensible que otros
tipos celulares
Protocolos disponibles:
Diamond, L. S. (1995) "Cryopreservation and storage of
parasitic protozoa in liquid nitrogen. J Euk Microbiol 42(5):
585-590"
Samarawickrema, N. A., et al. (2001) "A rapid-cooling
method for cryopreserving Entamoeba histolytica. Ann.
Trop. Med. Parasitol. 95(8): 853-855.
http://entamoeba.lshtm.ac.uk/maintain.htm

QUISTE: forma infectante Estudio del enquistamiento


es importante para el control de infecciones y como
blanco para el diseo de drogas
Dobell y Laidlaw 1926: describen aumento en el nmero de quistes al
cultivar sin almidn por algunas generaciones y luego crecidos con
almidn. Sin embargo los resultados eran muy aleatorios y poco
reproducibles.
A diferencia de otros protozoos parasitos como Giardia y otras amebas
que son inducidos a enquistar bajo condiciones definidas in vitro, para
E. histolytica no se conocen las seales que gatillan el enquistamiento
Solo se han obtenido in vitro algunas estructuras similares a quistes (CLS)
exponiendo trofozoitos axnicos a diversos estmulos:
CO2 y Glc
mezcla de suero bovino, Glc, tetraborato de Na,vitaminas, PO4, CaCl2, extractos de
higado y pncreas
combinacin de cofactores de quitina sintasa (Mg++, Mn++, Co++)
H2O2 y cationes divalentes

1920: Nace en Philadelphia, Pensylvania


1957: TYM, The most widely used medium for
the axenic cultivation of trichomonads
1961: First axenic cultivation of Entamoeba histolytica
1964: Cryopreservation and recovery of protozoa from liquid
nitrogen
1968: TPS-1, First monophasic medium for the axenic cultivation
of Entamoeba histolytica
1972: Viruses of Entamoeba histolytica
1978 - TYI-S-33: The most widely used medium for the axenic
cultivation of Entamoeba histolytica
1989: Description of ribosomal DNA plasmids in Entamoeba
histolytica
1993: Redescription of Entamoeba histolytica to distinguish it from E.
dispar

Protozoo flagelado
(Diplomonadida)
Ciclo de vida simple: forma
replicativa (trofozoto) y
forma de resistencia
(quiste).
Forma infectante: QUISTE
Transmisin por ingestion de
quistes en agua o alimentos
contaminados con materia
fecal (MF)
Tratamiento: metronidazol
(Flagyl)

1960,Karapetyan: Primera vez crecido en un cultivo con Candida


guilliermondi y fibroblastos
1962,1970,1976: Cultivos monoxnicos

1979, Bingham y Meyer: cultivo axnico directo a partir del


desenquistamiento inducido por HCl (pH2)
1980,Visvesvara: cultivo axnico de Giardia en medio de
Diamond TP-S-1. Crece mejor en medio filtrado que atoclavado.
1983, Keister: Cultivo en TYI-S-33 modificado con el doble de
contenido de Cys y bilis*
Tb se han descripto medios sin suero (Wieder et al. 1983)
Medio casero PEHPS modificado (Vargas-Villarreal et al. 2014)
Gullin y Diamond (1980):Mtodo p obtencin de clones como
colonias en agar.
Medios enquistamiento y desenquistamiento en cultivos axnicos
* Medio ms ampliamente usado para el cultivo de Giardia

Establecimiento de Cultivos Monoxnicos:


Aislado a partir de:
FV de biopsia duodenal
Q de MF
Medio: TYI-S-33 (modificacin de Keister) con ATB y antifngicos
(Anfotericina B, Moxolactama, Ticarcilina, Gentamicina,Penicilina)
Opcional: tratamiento previo de los Q con HCl
Cultivo en tubos a 35.5 C en posicin vertical
Cambio de medio + ATB diariamente la primer semana, cada 2 das x 2
semanas ms
Mantenimiento de Cultivos Monoxnicos: ( E. histolytica, Trichomonas)
Pasajes cada 72-96 hs

Inculo determinado por inspeccin visual


Enquistamiento in vitro:
Exposicin a sales biliares
Hambreado de colesterol

Trypanosoma cruzi
Trypanosoma brucei

Leishmania spp.

A)
B)
C)
D)

Promastigote de Leishmania spp. pte. en el insecto vector


Epimastigote de Trypanosoma cruzi pte. en el insecto vector
Trypomastigote tpica forma sangunea de Trypanosoma spp
Amastigote: estadio intracelular de T. cruzi y Leishmania spp.
N, nucleo; K, kinetoplasto; F, flagelo

vertebrado insecto
cambios en la disponibilidad de nutrientes
cambios de temperatura
diferentes formas del parsito
adaptacin a los distintos habitats

1904: Novy y Mc. Neal medio p T. brucei brucei


1908: Nicolle, modificacin del medio anterior
Medio NNN: agar sangre inclinado, inoculado con materiales
infectados
Los parsitos crecen en el H2O condensada sobre la sup del agar
1950: Tobie et al.
Medio bifsico: Solucin de Locke con Glc sobre agar sangre nutritivo
Buen crecimiento, pero difcil cosechar los parsitos para estudios
posteriores
En el cultivo, las formas sanguneas se transforman en
epimastigotes (insecto)
Cultivos prolongadosPrdida de infectividad y/o virulencia
Formulacin de Medios parcialmente definidos
Desarrollo de cultivos sobre una feeder layer de cultivo de tejido que
provee nutrientes para el crecimiento de tripanosomas

Medio HX25
sin sangre
con hemina

Medio para cultivo de


formas sanguneas sobre
feeder layer de fibroblastos

Requiere un agente reductor


(BME)y Cistena
gran variablidad con distintos
sueros
tripanosomas salivaria ms
difciles de cultivar

Esquema gral para aislar T. cruzi o T. brucei de muestras de


sangre o tejido de un hospedador vertebrado.

Protozoo flagelado (Kinetoplastida)


Agente causal de la Enfermedad de Chagas
Ciclo de vida complejo: 2 hospedadores
Hospedador vertebrado: mamferos inlcuido el hombre (zoonosis)
Hospedador invertebrado: insectos vectores triatominos (Triatoma, Rhodnius,
y Panstrongylus)

Distintas formas morfolgica y metablocamente diferentes:


tripomastigotas (sanguneos y metacclicos)
epmastigotas
amastigotas

Transmisin :

vectorial (a traves de las heces de la vinchuca: stercoraria)


transfusiones, transplantes
Transplacentaria o vertical (Chagas congnito)
oral (ingesta de alimentos contaminados con heces de vinchuca infectada)
accidentes de laboratorio

Tratamiento: Benznidazol, Nifurtimox

Diferencias morfolgicas, fisiolgicas, bioqumicas y


metablicas entre los distintos estados

Diferentes requerimientos para el cultivo

Cultivo de epimastigotes (vector):


Medios indefinidos
Citri y Grossowickz (1955):Medio bifsico con jugo de tomate,
hemoglobina y plasma humano
Medio parcialmente definido con hidrolasa de caseina, hemina, BSA,
factores de crecimiento
Zeledon (1959): medio basado en infusin cerebro-corazn (BHI), 10%
sangre cordero (medio selectivo p Tc, T.rangeli no crece)
Medios semidefinidos y definidos
1977: Modificacin del medio HX25 desarrollado p T. brucei
Hendricks et al. (1978) Medio 199, Medio de Grace (p cult de celulas de
insecto)
Otros medios definidos desarrollados para el cultivo de Tc conteniendo
catalasa de hgado
Sadigursky y Brodskyn (1986), introducen medio sin sangre: LIT: Infusin
hgado, triptosa, glucosa (inicialmente se usaba sin SFB y con RPMI 1640 y
M199)
Incorporacin de hemina y SFB
Crecimiento a 28C

Cultivo de amastigotes (intracelular):


Cultivo sobre tejidos:
Kofoid et al. 1935, infeccin de musculo cardaco
embrionario in vitro
Cultivo sobre clulas crecidas en monocapa
Vero
CHO
RAW
Medios libres de clulas: Villalta y Kierszenbaum
(1982):purificacin de amas por centrifugacin en
gradiente, cultivo en medio Leibovitz L-15 modificado
Crecimiento a 37C (33-38 C) en atmsfera de CO2
2-3 das pi, se observan amastigotes
5-7 das pi, comienzan a salir tripomastigotes

Cultivo de epimastigotes (vector):


Medio indefinido
Medios semidefinidos y definidos
Cultivos sin suero

Cultivo de amastigotes (intracelular):


Cultivo en tejido completo
Cultivo con clulas
Medios libres de clulas

Cultivo de epimastigotes
cultivos axnicos en LIT o BHIT
suplementar con Hemina y 10% SFB
pasajes cada 4-7 das
criopreservacin

Cultivo de amastigotes (intracelular)


1. Obtencin de tripomastigotes (forma infectante):
Cultivos envejecidos (metacic. espontnea)
Metaciclognesis in vitro: Medios TAU, Grace
Tripomastigotes obtenidos de animales o clulas
infectados
2. Infeccin in vitro de clulas en monocapa
Lneas celulares Vero, CHO, RAW

Metaciclognesis in vitro
Obtencin de tripomastigotes (forma infectante) a partir
de un cultivo axnico de epimastigotes (forma pte. en el
insecto vector)
Baker (1987): La metaciclognesis no ocurrir en
condiciones que permitan el crecimiento exponencial

Cultivos envejecidos (metacic. espontnea)


Medios TAU
Medio de Grace (p cult de clulas de insecto)

Los helmintos son ms difciles de cultivar


que los protozoos. La complejidad de los
helmintos dificulta obtener el ciclo
completo en condiciones artificiales.
Los parsitos intracelulares obligados
(Plasmodium, coccidia) se crecen en
presencia de cultivos celulares

Aguilar-Daz H, Daz-Gallardo M, Laclette JP, Carrero JC. (2010). In vitro Induction


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