Prctico: Gentica bacteriana 2007.

Actividad integrada Departamento de Gentica Departamento de

Bacteriologa y Virologa.

OBJETIVOS
Objetivos generales
El estudiante al terminar la actividad prctica podr reconocer y describir:

1- Diferentes mecanismos de intercambio de informacin gentica entre

bacterias.

2- Mtodos de caracterizacin gentica que permiten la comparacin de cepas

bacterianas.

3- Aplicaciones directas para la medicina del estudio gentico de las bacterias

(epidemiologa, prevencin, teraputica, diagnstico).

Objetivos especficos
Evidenciar la presencia de un gen por observacin de caractersticas fenotpicas
de una cepa bacteriana (capacidad para multiplicarse en presencia de un
antibitico).
Evidenciar un mecanismo de regulacin de la expresin gnica (opern lactosa
en accin) y comprender sus aplicaciones para la expresin regulada de genes
heterlogos.
Observar e interpretar mtodos fenotpicos y genotpicos para el anlisis de los
genes y genomas.

METODOLOGA
Los objetivos planteados se alcanzarn por medio de:
-

Discusin basada en la observacin de cultivos de una cepa de E. coli, la

misma cepa que ha sido transformada en el laboratorio con un plsmido en
distintas condiciones de seleccin.
Realizacin de una corrida electrofortica en gel de agarosa del producto
de amplificacin de PCR especfica para un fragmento del plsmido
transformado.
Observacin e interpretacin de los resultados de la electroforesis
Observacin e interpretacin de los productos de la restriccin enzimtica
del mismo plsmido luego de electroforesis en gel de agarosa.

Actividades
1- Discusin al respecto de los posibles mecanismos responsables de variacin de
la expresin gnica en las bacterias, refirindose como gua para la discusin a
la adquisicin de un fenotipo de resistencia a un determinado antibitico (por
ejemplo a Ampicilina) por parte de una cepa bacteriana.
2- Observacin de cultivos de una cepa de E. coli de laboratorio y de la misma
cepa transformada con un plsmido que confiere resistencia a ampicilina o
transformada con el mismo plsmido al que se le ha clonado un gen
eucariota. Estos cultivos se observarn en placas de LB, LB/ampicilina y
LB/ampicilina/IPTG/X-gal.
3- Observacin de fotografas/esquemas del producto de restriccin de este
plsmido con y sin inserto e interpretacin del mapa del plsmido.
4- Discusin para definir un protocolo de PCR para identificar cuales colonias
contienen el plsmido con inserto y cuales no.
5- Realizacin de una corrida electrofortica con estos productos de PCR y
observacin de un gel previamente teido.
6- Discusin al respecto de aplicaciones de PCR/ restriccin enzimtica/ anlisis
de DNA plasmdico/clonacin/transformacin para la epidemiologa,
diagnstico, teraputica, prevencin
7- Discusin final grupal tendiente a asegurar el cumplimiento de los objetivos.

Informacin para la discusin en subgrupos

1)Extraccin de plsmidos y su uso como vectores de
informacin
El ADN de una cepa bacteriana, puede ser extrado de las clulas por diferentes
procedimientos y puede separarse el ADN cromosmico del plasmdico. Con un
extracto de ADN plasmdico, puede realizarse una corrida electrofortica y
visualizarse lo que se denomina el perfil plasmdico de una cepa bacteriana. Este
procedimiento tiene gran aplicacin fundamentalmente en epidemiologa.
A partir de plsmidos obtenidos en el laboratorio, ya sea provenientes de una
cepa o construidos artificialmente, es factible transferir informacin gentica
contenida en estas molculas a una cepa bacteriana. Este procedimiento se
denomina transformacin, y consiste en forzar a una cepa a captar de alguna
forma el ADN extrao. Esta captacin es en general ms eficiente cuando el ADN
a incorporar se encuentra como una molcula circular cerrada, por lo que los
plsmidos son molculas ampliamente utilizadas para transferir informacin de una
cepa a otra en el laboratorio.
Tambin las bacterias en la naturaleza, utilizan la transferencia de ADN plasmdico
como mtodo habitual para intercambiar material gnico, aunque muchas veces
est mediado por contacto entre una clula dadora y una receptora
(conjugacin).

Fig.1 Mapa de un plsmido modificado utilizado como vector de clonado.

2) Seleccin de plsmidos recombinantes por alfa-complementacin,

utilizando IPTG y X-gal
El IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactosido) es un anlogo de la lactosa que no puede
ser utilizado como fuente de carbono o energa por las bacterias. Cuando es
agregado al cultivo de una bacteria que posee el opern lac, acta inactivando
al represor lacZ y por lo tanto induce la transcripcin del opern lac.
E. coli sintetiza una beta-galactosidasa que es capaz de hidrolizar el disacrido
lactosa en los monosacridos glucosa y galactosa. La actividad de esta enzima
puede ser puesta en evidencia utilizando un sustrato cromognico como el X-gal
(5-bromo 4-cloro 3-indolil beta D galactsido) el cual es convertido por la beta
galactosidasa en un compuesto azul insoluble.
Muchos vectores plasmdicos comnmente usados en el laboratorio para el
clonado de genes de inters (pUC, Bluescript, pGem etc) portan un segmento del
DNA de E. coli conteniendo la secuencia regulatoria y la informacin codificante
para los primeros 146 aminocidos de la beta galactosidasa. Incluida en esta
regin del plsmido se encuentra el sitio de policlonado del vector, que mantiene
el marco de lectura y resulta en la incorporacin de unos pocos aminocidos a la
secuencia de la beta galactosidasa.
Este tipo de vectores pueden ser utilizados en cepas de laboratorio que expresan
la porcin carboxi-terminal de la beta galactosidasa. Una cepa de este tipo de
por si sola no podr expresar la enzima, pero cuando es transformada con el
plsmido, la beta galactosidasa podr sintetizarse de forma completa de manera
de ser enzimticamente activa.
Este tipo de complementacin, en el cual las mutaciones por delecin del
segmento proximal del gen lacZ son complementadas por mutantes beta
galactosidasa negativos que poseen la porcin proximal de lacZ intacta, es
llamada alfa-complementacin.

Las bacterias lac+ que resultan de esta alfa-complementacin, son fcilmente

reconocidas en presencia del sustrato cromognico X-gal, observndose de color
azul.
La insercin de un fragmento de DNA exgeno en la zona de policlonado del
vector resultar en la produccin de una subunidad de beta galactosidasa que
no ser capaz de complementar la actividad enzimtica, por lo que las colonias
portadoras del plsmido conteniendo el inserto no sern capaces de metabolizar
el sustrato cromognico y se observarn incoloras en los cultivos.
Este mtodo permite el screening de varios miles de colonias transformantes para
encontrar alguna que haya incorporado una copia del plsmido recombinante.
Hay que considerar que el mtodo de seleccin no es infalible, ya que existe la
posibilidad de que la insercin no inactive la capacidad de complementacin
(sobre todo cuando se trata de insertos menores de 100pb que no cambian el
marco de lectura) y que no todas las colonias blancas porten plsmidos
recombinantes.
Para corroborar que las colonias seleccionadas poseen el inserto de inters es
necesario extraer el DNA plasmdico y corroborar por restriccin enzimtica y/o
PCR especfica la presencia del inserto.

Fig.2 . Esquema del sistema de alfa complementacin en E.coli.

Fig. 3. Esquema de una estrategia tpica de clonado en un plsmido.

A.

Digerir blanco y plsmido con una misma enzima de restriccin

B.

Ligar ADN blanco y plsmido.

C.

Transformar clulas bacterianas con el producto de ligacin

D.

Seleccin de colonias

3) Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Esta tcnica consiste en la amplificacin in vitro de secuencias especficas de
ADN, imitando el proceso de replicacin del ADN celular. Se basa en el uso de
oligonucletidos (primers o cebadores) que son complementarios a las secuencias
que delimitan el fragmento que se quiere amplificar. Es una tcnica con alta
sensibilidad y especificidad que permite a partir de unas pocas molculas de un
ADN molde, amplificar millones de veces un fragmento de inters para que pueda
ser visualizado.
Utiliza una ADN polimerasa (generalmente Taq pol.), una mezcla de
deoxiribonucleotidos-trifosfato (dNTPs), un par de cebadores especficos y un
buffer que brinda las condiciones inicas apropiadas para la polimerizacin.
La reaccin se lleva a cabo en un equipo (termociclador) que trabaja por ciclos
de temperatura: desnaturalizacin (por ej. 95), luego de hibridizacin de los
cebadores y por ltimo la temperatura de polimerizacin a la cual acta la
enzima. Estos pasos se repiten unas 30 veces, aumentando exponencialmente el
nmero de copias de la secuencia blanco.
Los fragmentos amplificados podrn ser evidenciados de varias formas siendo la
ms usada la visualizacin directa en geles de agarosa mediante tincin con
bromuro de etidio reconociendo una banda que corresponde al peso molecular
esperado.
Otra tcnica muy aplicada al revelado de reacciones de PCR, es la hibridizacin
con sondas especficas. Habitualmente se realiza una corrida electrofortica y se
transfiere el DNA a una membrana de nylon o nitrocelulosa (proceso llamado
Southern blot).
A la membrana se le agrega una solucin de cido nucleico marcado (sonda)
complementario a la secuencia que se quiere detectar. De estar presente la
secuencia buscada, la sonda se hibridizar y luego de revelar se detectar una
seal que vara segn el tipo de marca (por ej. radioactiva o colorimtrica)
La PCR es desde hace tiempo una tcnica ampliamente utilizada en el laboratorio
con fines de investigacin, para identificar la presencia o ausencia de regiones
precisas tanto en ADN de procedencia eucariota como procariota. Cada vez ms
se utiliza en el laboratorio clnico, con fines de diagnstico fundamentalmente.

4)Corrida electrofortica de ADN en gel de agarosa

La electroforesis es una tcnica que permite separar distintos fragmentos o
molculas de ADN en funcin de sus pesos moleculares y/o de su conformacin
(circular superenrrollada, circular relajada o lineal). El DNA a pH neutro est
cargado negativamente por lo que migra hacia el polo positivo cuando es
sometido a un campo elctrico. La distancia recorrida esta en relacin inversa con
el tamao del ADN, por lo que las molculas pequeas migrarn ms que las de
mayor tamao. Las molculas de ADN circular como los plsmidos pueden
encontrarse en distintas conformaciones con diferente movilidad electrofortica.
Preparacin del Gel
Segn el tamao de las molculas de ADN que se van a estudiar, se preparar el
gel con diferentes concentraciones de agarosa. El buffer a utilizar en la corrida
electrofortica es el mismo utilizado para diluir la agarosa. En el prctico se
trabajar con agarosa 0,7% en buffer TBE.

Se calienta la suspensin agitando, hasta alcanzar el punto de ebullicin. Se deja

enfriar hasta 60-70 C y se vierte en el portagel conteniendo el peine, hasta un
espesor de aproximadamente 0,5 cm. Se deja solidificar unos minutos en una
superficie nivelada.
Se retira el peine y se coloca en la cuba de electroforesis, la cual se llena con
buffer de corrida hasta cubrir la totalidad del gel.
Siembra de las muestras
Sobre una superficie limpia y lisa, se mezcla un volumen adecuado de la muestra a
ensayar (por ejemplo 5 l de un preparado de DNA plasmdico), con el buffer de
muestra (el cual contiene azul de bromofenol que marcar el avance de la
corrida electrofortica y glicerol para darle consistencia a la muestra facilitando
su carga en los hoyos del gel).
El buffer a utilizar se encuentra 6 veces ms concentrado que la dilucin de uso,
por lo que deber diluirse 6 veces en la muestra (por ejemplo 5 ul muestra ms 1 ul
buffer). Se mezcla bien con micropipeta y se carga el hoyo.
Se repite la operacin por cada muestra a correr.
Corrida electrofortica
Se cierra la cuba conectando los electrodos y se larga la corrida.
Se recomienda en general aplicar un voltaje de hasta 5 voltios por cm (medido
entre electrodo y electrodo), por ejemplo, para una minicuba de 15-20 cm, se
trabajar a 70-100 V.
Revelado y observacin.
Una vez que el frente de corrida ha avanzado lo suficiente, se para la
electroforesis, se abre la cuba y se retira el portagel. El gel se sumerge en una
solucin previamente preparada de Bromuro de Etidio durante unos minutos y se
observa el gel en un transiluminador o fuente emisora de luz ultravioleta.

Figura 4. Electroforesis en agarosa de

DNA plasmdico.
Carril 1, marcador de peso molecular.
Carriles 2, 4 y 6, DNA plasmdico extrado de
distintas colonias, s. Carril 3, 5 y 7, l
os mismos plsmidos digeridos con 2
enzimas de restriccin.