1.

INTRODUCCIN

El objetivo de esta prctica es el observar las diferentes formas, tamaos y

agrupaciones que presentan los microorganismos aplicando un mtodo simple de
tincin.
Existen varios tipos de tinciones, pero la que se us en la prctica de laboratorio
fue la Tincin simple. Se caracteriza por necesitar fijacin previa, el uso de un solo
colorante y porque permite la visualizacin de la morfologa bacteriana. Sus fines
son observar la morfologa de la bacteria as como la agregacin o tipo de
distribucin bacteriana. Se basa en la afinidad de los colorantes a los distintos
componentes celulares, ya que las clulas bacterianas en medios a pH neutros
suelen presentar una dbil carga negativa. As pues, la bacteria cargada
negativamente se combinar con los iones positivos de los colorantes bsicos,
llamados cromforos. Esto explica el por qu en las tinciones simples los colorantes
utilizados suelen ser de tipo bsico.1
Las tinciones simples se pueden clasificar a su vez en:
-

Tinciones simples con colorantes bsicos.

Tinciones simples con colorantes cidos.
Tinciones simples con colorantes neutros.

El uso del microscopio compuesto es vital para nuestras observaciones. Como

vamos a tratar de muestras muy pequeas se procede a hacer uso de uno de los
lentes objetivos que es especial, llamado de inmersin. Este lente se usa mediante el
empleo del aceite de inmersin que tiene las mismas caractersticas pticas (como el
ndice de refraccin) que el vidrio, para que de esta manera los rayos de luz pasen
directamente del portaobjetos al lente del objetivo. En ausencia de este aceite, los
rayos se refractaran (desviaran) debido al aire presente entre el portaobjetos y el
objetivo, entrando menos luz al microscopio.2

1 Adaptado de Granados, R; Villaverde, (1996).

2 Adaptado de Wisteich & Lechtman (1973)

2. MATERIALES
1.
2.
3.
4.
5.

Guardapolvo blanco
Mascarilla
Gorro
Gua de laboratorio
Lminas portaobjeto
6. Asa de siembra
o de Kolle

7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.

Encendedor o fsforos
Piseta
Cristal violeta
Fucsina
Azul de metileno
Algodn
Alcohol etlico
14. Mechero

15. Soporte para tincin

16. Microscopio
compuesto con lente
objetivo de inmersin
17. Aceite de inmersin
18. Tubo con cultivo de
bacteria

14

1
3. MTODOS
a) Preparacin de una muestra fija de bacterias

Colocar previamente una gota de agua

en una lmina portaobjeto

Secar la lmina con la llama del

mechero para fijar las bacterias
matndolas sin que se pierda su
estructura

Prximo a la llama de un mechero,

colectar una muestra de la bacteria
presente en el cultivo dado

Con el asa de Kolle dispersar la muestra

sobre la gota de agua hasta forma una
pelcula delgada. Esterilizar el asa con
la llama del mechero

11

16
17

b) Tincin simple con colorantes bsicos

Colocar las lminas preparadas en un

soporte para tincin

Lavar la lmina para quitar el exceso de

colorante y evitar la formacin de
cristales

Dejar secar la lmina y limpiar con

algodn humedecido con alcohol por la
base

Colocar unas 5 o 6 gotas sobre la

muestra, dejando que actu sobre ella

Colocar las lminas preparadas en un

soporte para tincin

4. RESULTADOS

Muestra
Grado de Aumento
Observaciones

Grado de Aumento
Observaciones

Muestra
Grado de Aumento
Observaciones

Escherichia Coli
Escherichia
Colicon
coloreado
coloreado
Fucsina
con Azul de metileno
1000x
No se observ la presencia de
las bacterias
coloreadas,
Escherichia
Coli
formacin
de cristales
coloreado
con Cristal
Violeta
1000x
Apreciamos las bacterias
teidas de color prpura
dispersas en la mayora de la
muestra, y en cierta regin
agrupadas. Tambin
observamos dos o tres
asociaciones de otras bacterias
de forma bacilar

1000x
Las bacterias estn coloreadas
de un color fucsia, pero estn
concentradas en un solo punto,
no se puede diferenciar.
Formacin de emulsiones

5. DISCUSIONES

Sobre la bacteria observada, Escherichia Coli

Segn las observaciones en las tres lminas en diferentes tinciones, pudimos

observar que la Escherichia coli es una bacteria en forma de cocobacilo. Las
opiniones sobre su morfologa varan dependiendo el autor, pues segn Kingsbury et
al (1989) nos refuerza dicha posicin afirmando que la familia Enterbacteriaceae (a
la cual pertenece E.coli) es cocobacilar; por otro lado, segn Madigan (2009) la
misma familia comparte una forma bacilar recta.
Se observ aisladas muchas veces, tal como lo seala Singleton (2004) al
mencionar que estas suelen no presentar asociaciones resaltantes al anlisis de
microscopio. Segn el mismo autor, esta bacteria tambin presenta apndices finos
rodeando toda la clula, parecida a pelos, llamados flagelos.

Sobre la tincin con azul de metileno:

En la muestra teida con azul de metileno no se encontraron clulas teidas,
para su observacin, esto pudo ocurrir por no utilizar el tiempo adecuado para su
tincin. Tambin pudieron desprenderse algunas bacterias al someterlas con un
chorro del agua dirigido directamente sobre ellas. Se observ cristales precipitados
en la muestra, los cuales fueron el exceso que no pudo haber sido lavado. El azul
de metileno suele ser un sal doble de colorante y cloruro de zinc. (Salle. 1965) es
por eso que se pudo observar los precipitados de estos.
Este colorante se utiliza frecuentemente para detectar, clasificar o identificar
bacterias, o para observar componentes especficos de las bacterias, los colorantes
bsicos como este tambin se utilizan para teir cidos nucleicos y protenas. (M.
Prescot, P. Harley, A. Klein. 2002). Tambin es muy til para apreciar con rapidez la
poblacin bacteriana de la leche.

Sobre la tincin con fucsina:

En esta muestra se puede observar que algunas partes estn ms teidas que
otras y segn Granados & Villaverde (1996) esto se debe a que la muestra no fue
muy bien lavada con agua destilada a la hora de terminar con el teido a base de
Fucsina bsica. Tambin se ven como unas pequeas gotas esfricos debido a que
como no fue muy bien lavada, el aceite se junt con el agua sobrante formando
emulsiones.
Segn los autores Rodrigo Valenzuela et. al (2012), la membrana celular
externa e interna de la E.coli presenta con mayor frecuencia los siguientes cidos
grasos: cido esterico (18:0), cido mirstico (14:0), cido lurico (12:0), cido
palmtico (16:0), cido trans oleico (18: 1 t), cido cis oleico (18: 1 c), cido cis
linoleico (18: 2 c) y cido araqudico (20:0). Tambin se puede encontrar distintos
tipos de cidos grasos, entre los que se incluyen 2 hidroxicidos: cido
hidroximirstico y hidroxidecanoico. La E.coli posee como cido graso de
mayor abundancia al cido palmtico con un porcentaje en peso de 34.68 2,510.

Con la investigacin anterior se puede decir que la tincin a base de Fucsina

se debi a que este tinte, aparte de ser un tinte bsico, tambin tiene mucha afinidad
con los cidos grasos presentes en las membranas celulares bacterianas (segn la
tabla realizada por el autor Jozef Sliwiok), y como la E.coli es una bacteria del tipo
Gram negativa, posee una membrana celular externa que est mayormente expuesta
al tinte, dndose as una tincin con mucha ms intensidad.

Sobre la tincin con cristal violeta:

Respecto a la muestra teida con cristal violeta, el error principal cometido
es la falta de esterilizacin de los materiales (o bien de la lmina portaobjetos o del
asa de Klle) tanto previa como posterior a su uso, pues la presencia de bacterias
bacilares que forman una asociacin en cadena (estreptobacilo), las cuales segn
Madigan (2009) no es posible en el gnero.
El cristal violeta permite ver con mucha claridad las bacterias, pues produce
el matiz ms intenso del grupo qumico al cual pertenece (p-rosalinas), siendo, entre
todos los compuestos violeta, considerado el colorante simple ms satisfactorio para
usos generales, debido a su naturaleza fuertemente bsica. (Salle, 1965)
6. CONCLUSIONES

Escherichia coli es una bacteria cuya forma se discute entre la bacilar y la

cocobacilar y no forma agrupaciones notables.
Las tcnicas de tincin simple en muestras fijas nos ayudan a identificar la
morfologa y estructura de las bacterias, as como las agrupaciones que llegan a
formar
Hay que evitar cometer los errores que ocurren para poder visualizar sin problemas
a las bacterias que queremos analizar

7. BIBLIOGRAFA

a. GRANADOS, R; VILLAVERDE, MC. Microbiologa. 1 ed. Espaa,

Madrid, Paraninfo. 523 p.
b. KINGSBURY, D. et al Microbiologa mdica 1989 Editorial LIMUSA
S.A, Mxico, D.F.
c. MADIGAN, Michael et al Brock: Biologa de los Microorganismos 2009.
12ma edicin. Editorial Pearson Educacin. Madrid, Espaa. 1296 pp
d. PRESCOTT, L. M. et al. Microbiologa. 2002 5ta Edicin. Mc Graw-HillInteramericana de Espaa. S.A.C. Espaa. 1240pp.
e. SALLE, A.J. Bacteriologa. 1965. 4ta Edicin. Editorial Gustavo Gil S.A.
Espaa. 845pp.
f. SINGLETON, P. Bacterias en Biologa, Biotecnologa y Medicina. 2004.
5ta Edicin. Editorial Jhon & Son, Ltd. Baffins Lane Chichester, West
Sussex. Inglaterra.515pp.
g. VALENZUELA, R; et al. 2012. Determinacin del perfil de cidos grasos de
bacterias del gnero Vibrio por cromatografa de gases (en lnea). Archivo
PDF.
Consultado
el
9
abr.
2015.
Disponible
en:
http://www.scientiachromatographica.com/files/v4n4/v4n4a03.pdf
h. WISTEICH G.A. & LECHTMAN. M.D. Prcticas de laboratorio de
Microbiologa 1973 2da edicin. Editorial LIMUSA S.A. Mxico, D.F 251
pp