Crecimiento y respuestas bioqumicas de soja a las

asociaciones microbianas dobles y triples

con Bradyrhizobium,Azospirillum y micorrizas arbusculares
Bradyrhizobium (B), Azospirillum (A) y hongos micorrcicos arbusculares (M) son
beneficiosas plantas microorganismos rizosfricas menudo aplicadas como
biofertilizantes. Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar los efectos de la doble
(B + A y B + M) y triples (B + A + M) combinaciones de microbios en el rendimiento de
soja (Glycine max [L.] Merr.), Nodulacin, micorrizacin y la planta de metabolitos
concentraciones, en comparacin con Bradyrhizobium solo, despus de 28 y 56 das de
crecimiento en condiciones controladas. Todas las combinaciones microbianos
aumentaron biomasa de races de soja, pero no disparan biomasa. La biomasa total ms
alto de la soja (+ sesin de root) se observ con la asociacin
doble Azospirillum yBradyrhizobium (B + A). Este tratamiento reduce el nmero total de
ndulos, pero parece aumentar su capacidad de fijar el nitrgeno, como se muestra por su
alta concentracin de almidn durante la creacin. La presencia de micorrizas (B + M)
tuvo un efecto adverso transitorio en profundidad de la nodulacin en comparacin con
Bradyrhizobium solo, lo que podra indicar la competencia entre estos dos simbiontes
durante el establecimiento (da 28). La asociacin triple (B + A + M) el crecimiento de
brotes reducida, as como el nmero de ndulos pequeos. La mayor concentracin del
aminocido prolina cido inducida por el estrs en los ndulos y las hojas en respuesta a
B + A + M indica que las plantas de soja estn bajo estrs cuando en presencia de la
combinacin de tres simbiontes. Durante el establecimiento, la concentracin de
coumestrol en las races de soja fue menor con combinaciones microbianas que
conBradyrhizobium solos, lo que podra indicar una seal de regulacin comn entre soja
y ambos Azospirillum y micorrizas. Nuestros resultados muestran que las interacciones
complejas y la competencia entre los tres microorganismos inducidas crecimiento
diferencial y las respuestas de nodulacin, que pueden estar vinculados a los cambios
metablicos.
Introduccin
Legumbres viven en simbiosis con dos principales microorganismos de la rizosfera
:bacterias de los ndulos de formacin capaces de fi x N2 atmosfrico proporcionar a la
planta con nitrgeno (N ) ( Prvost y Antoun , 2007) , y hongos micorrcicos
arbusculares formando redes de hifas externas que transportan P y el agua a su
anfitrin ( Smith y Read, 2008; Fortin et al ., 2008; Khasa et al., 2009 ) . Numerosos
estudios han
explorado las caractersticas comunes de estas dos simbiosis , que comparten seales
simbiticas planta bioqumica comn ( Vierheilig , 2004 ; Hause y Schaarschmidt , 2009
) . Por ejemplo , fl flavonoides encontrados en la raz exudados de plantas husped son
conocidos como compuestos clave de sealizacin
en una serie de interacciones planta -microorganismo ( Steinkellner et al. , 2007). Los
flavonoides actan tanto como quimioatrayentes para rhizobial bacterias y elicitores de
crecimiento de las hifas del hongo micorriza en establecimiento ( Steinkellner et al. ,
2007 ) Recientes descubrimientos importantes de comn activacin genes simbiticos
(Gherbi et al, 2008;. Hayashi et al., 2010) tienen de fi nitivamente estableci que el

rizobio simbiosis ha evolucionado desde el micorrizas arbusculares ancestral simbiosis

(Parniske, 2008;. Oldroyd et al, 2009). Por otra parte, lareciente descripcin de las
seales simbiticas que estimulan la formacin
micorrizas arbusculares de los
factores MYC, con fi rmado que son anlogos moleculares ancestrales de la lipochitooligosaccharidic Factores NOD de la simbiosis rizobios (Maillet et al., 2011).
Numerosos autores han estudiado la interaccin entre las legumbres, rizobios y
micorrizas arbusculares socios (revisado por Chalket al., 2006). Con la soja cultivada en
macetas, estudios anteriores tienen
informaron tanto antagnica (Bethlenfalvay et al., 1985) y sinrgico
efectos de los dos simbiontes (Bethlenfalvay et al., 1988). Otros microbios rizosfricas,
como la promocin del crecimiento vegetal rizobacterias (PGPR) tambin puede
interactuar con las plantas y mejorar
su crecimiento (Hayat y cols., 2010). Entre ellos, diazotrficas rizobacterias del gnero
Azospirillum son capaces de reducir atmosfrica
N2 en amonaco, y se han
demostrado para promover
crecimiento de la planta. Asociaciones de Rhizobium y las especies de Azospirillumcon
varias legumbres, incluyendo soja, generalmente promover semilla

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germinacin, crecimiento de las plantas, ramificacin de la raz y la nodulacin

(Khanet al., 2010). Adems, las asociaciones microbianas de Azospirillum con
Hongos AM se ha demostrado para mejorar el rendimiento de las leguminosas
(Toro et al., 1996; Saini et al., 2004), as como aquellos de los cultivos de
gramneas como maz (Miyauchi et al., 2008), sorgo (Saini et al., 2004) y la
cebada (Negi et al., 1990). En esta asociacin no simbitica, el papel de la
planta es proporcionar los componentes de sus exudados de las races a estas
bacterias de la rizosfera. Las bacterias pueden luego utilizar estos como fuente
de energa y en contraparte NH3 proporcionar a la planta (Sahara y Nehra,
2011). Adems, Azospirillum puede colonizar superficie de la raz y la raz
inducir cambios morfolgicos que dan la plantar un mejor acceso a los
nutrientes (Okon y Kapulnik, 1986) o promover crecimiento de las plantas a
travs de diversos mecanismos (Dobbelaere et al., 2,003).
Interacciones bioqumicas entre plantas y microorganismos son complejos y la
acumulacin y translocacin de metabolitos entre tallos y races o ndulos son
indicadores de la estado de la simbiosis (Bertrand et al., 2011). En soja en
simbiosis con Bradyrhizobium, fotosintatos son transportados desde las hojas a
los ndulos a travs del floema en forma de sacarosa. En el ndulo, el carbono
(C) a partir de sacarosa se pone a disposicin a los bacteroides para sostener la
fijacin de N2 (Crawford et al., 2000). En respuesta, los bacteroides liberar a la
planta de amonaco que producir a partir de la fijacin de N2. En soja, el
nitrgeno se exporta desde los ndulos a las otras partes de la planta a travs
del xilema bajo la forma de ureidos, que se degradan en las hojas para liberar
amoniaco y luego asimilados por la planta en aminocidos (Crawfordet al.,
2000).

La regulacin ofthis va es complejo e implica la disponibilidad de amonaco a

la inhibicin fijacin de N2 planta y retroalimentacin por la alta concentracin
de compuestos nitrogenados en las hojas (Serraj et al., 1999a, b). Muchos
informes confirman que una parte importante de fotosintatos son trasladadas a
los ndulos y se utilizan all en apoyo de la fijacin de N2, el crecimiento de
ndulos y mantenimiento, y asimilacin de amonaco (Streeter, 1980). Por otra
parte, la fijacin de N2 en los ndulos se inhibe rpidamente bajo condiciones
que reducen Cdisponibilidad (Curioni et al., 1999). La relacin bioqumica
mutualista entre soja y micorrizas no se entiende completamente. Sin
embargo, se sabe que, en retorno a una mayor nutricin mineral por parte de
los hongos, los canales de la planta husped entre 4 y 20% de su fotosinttica
C neta a sus micobiontes a travs de los arbsculos que son los sitios de
intercambio para el fsforo, carbono, agua y otros nutrientes (Lerat et al.,
2003).
En estudios de campo, las relaciones sinrgicas entre Rhizobium, Azospirillum y
/ u hongos micorrcicos arbusculares se ha demostrado para aumentar la
biomasa de la leguminosa y de cultivos no leguminosas (Saini et al., 2004),
incluyendo la soja (Bagyaraj et al, 1979;. Hayat et al, 2010).. Sin embargo, en
experimentos de laboratorio, sinrgico, as como antagnica efectos se han
observado entre los tres rizosfera socios (. Requena et al, 1997; Valdenegro et
al., 2001). A partir de una punto de vista prctico, la microbios beneficiosos de
tres plantas Rhizobium, Azospirillum y hongos micorrcicos arbusculares son
utilizados como bio-inoculantes de todo el mundo (Brockwell y Bottomley,
1995; Lucy et al., 2004; Hamel y Planchette, 2007). Considerando el la
expansin del uso de estos microorganismos en la agricultura y el general
importancia comercial de soja, hay una necesidad de mejor comprender los
efectos interactivos de Bradyrhizobium, Azospirillum y hongos micorrcicos
arbusculares en el crecimiento de la soja y la fisiologa.
Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar los efectos de inoculaciones
dobles y triples con B. japonicum, Azospirillum y hongos micorrcicos en el
rendimiento de soja, nodulacin y la micorrizacin. Para caracterizar mejor
respuesta de soja a estas microorganismos, C y el metabolismo de N fueron
investigados por el evaluacin de hidratos de carbono, aminocidos y
contenidos ureidos en los ndulos y en las hojas. Adems, las mediciones de
los tres flavonoides en las races de soja, daidzena, genistena y coumestrol,
ayudarn a entender la sealizacin de la planta-microbio cuando mltiples
microorganismos estn involucrados.

2. Materiales y mtodos
2.1. La inoculacin microbiana y la planta de las condiciones de crecimiento

Dos microorganismos bacterianos se utilizaron para la inoculacin de soja:

Bradyrhizobium japonicum, cepa 14M2b, aislado de Qubec suelo agrcola bajo
rotaciones de soja-maz (Agricultura y Agroalimentacin de Canad (AAFC)
coleccin de cultivos), y Canadense Azospirillum, DS2 cepa, una nueva especie
aisladas de maz rizosfera en Londres, Ontario (AAFC, Mehnaz et al., 2007).
Lquido inculos bacterianos fueron preparados por cultivo de clulas B.
japonicum en caldo de levadura manitol estndar (YMB) (Vincent, 1970), y A.
canadense clulas en un medio libre de N malato estndar (Mehnaz
yLazarovits, 2006). Las diluciones de bacterias individuales o combinados
inculos se utilizaron para inocular semillas de soja a una velocidad de 106
clulas por semilla (Prvost et al., 2010). Unos doscientos semillas de soja
fueron empapado en 2 ml de inculo bacteriano apropiado durante la noche.
El hongo micorriza arbusculares utilizado fue irregulare Glomus cepa DAOM
197198 (AAFC Ottawa, Canad) obtuvo de Premier Tech, Rivire-du-Loup, QC,
en forma de lquido estril inculo que contiene 400 esporas ml-1. El inculo de
micorrizas se mezcl al sustrato crecimiento de las plantas a la concentracin
de 2 mL L-1 (es decir, 800 esporas L-1) antes de la siembra. Diez semillas de
soja [Glycine max (L.) Merr.] Cv. Korus, uno de los primeros cultivares (2550
unidades de Cultivos Heat) recomendados para el cultivo en el provincia de
Qubec, Canad (CRAAQ, 2003), inoculado previamente segn los tratamientos
bacterianos, se sembraron en 24 cm de profundidad ollas (Treepots TPOT9, 10
cm de dimetro. 24 cm profundidad, Stuewe & Sons Inc., Tangent, OR,
EE.UU.). Las macetas se llenaron previamente con una mezcla de esterilizada
de silice-vermiculita (1: 1 (v / v)) inoculado o no con esporas de Glomus
irregulare. Las plantas se cultivaron bajo condiciones controladas condiciones
ambientales en una cmara de crecimiento (Modelo Conviron PGR15,
Controlled Environments Limited, Winnipeg, Canad) a Temperaturas 22/17 C
da / noche con un h-16 y un fotoperodo densidad de flujo de fotones de 500
mol m-2 s-1. Dos semanas despus de la siembra, plntulas se apret a tres
plantas por maceta. Doscientos solucin mililitros de N-libre de Hoagland a
media concentracin de P fue agregado semanal para cada maceta. Las
plantas se regaron diariamente.

2.2. Tratamientos y diseo experimental

El experimento se estableci como un diseo completamente al azar con
cuatro repeticiones, dos fechas de cosecha (28 y 56 das) y cuatro tratamientos

de inoculacin: B. japonicum (B); B. japonicum + A. canadense (B + A); B.

japonicum + G. irregulare (B + M); B. japonicum + A. canadense + G.
irregulare (B + A + M). Bioqumicos mediciones se realizaron en las plantas de
cuatro macetas para cada microbiana tratamiento, mientras que las
caractersticas de crecimiento y nodulacin fueron medido en las plantas de
otros cuatro macetas. El experimento de este modo incluido un total de 64
macetas: 4 repeticiones 2 (1 pote para el crecimiento y mediciones de
nodulacin + 1 potfor anlisis bioqumicos) 4 tratamientos microbianos 2
fechas de cosecha.
2.3. La biomasa vegetal, nodulacin, Azospirillum y micorrizas evaluacin
En las dos fechas de cosecha, races y brotes de cuatro macetas para cada
tratamiento se separaron y las races se lavaron suavemente bajo una
corriente de agua fra para eliminar el sustrato. Ndulos fueron separados de
las races a mano. Se midieron tres parmetros para evaluar las caractersticas
de nodulacin: (1) el nmero de ndulos; (2) ndulos de tamao; y (3) la
profundidad de la raz de la nodulacin (Prvost et al., 2010). Los ndulos
fueron separados en dos clases de acuerdo a su tamao

pequeo: <5 mm y grandes:> 5 mm). Profundidad nodulacin se determin mediante

la medicin de la distancia entre la corona y la ndulos ms bajas del sistema radicular
(Prvost et al., 2010). Shoots,
races y ndulos se secaron durante 48 horas a 70 C para la determinacin de peso
seco (DW). Dos muestras, una de la parte superior y uno desde la parte inferior del
sistema de races, fueron llevados a evaluar la
presencia de Azospirillum y la colonizacin por el hongo AM. Fueron detectados y
cuantificados clulas Azospirillum en la superficie de la raz mediante una tcnica
adaptada de Pacovsk et al. (1985). Brevemente, fragmento de races withoutnodules
eran shakenfor 20-30 minin50 ml solucin salina tampn de fosfato de estril (PBS).
Suspensiones diluidas de 01.10 a 10.04 se sembraron en el medio-N suplementado con
cicloheximida. Se contaron las colonias despus de 3 das de incubacin a 30 C.
Coloracin especfica de las estructuras fngicas internas micorrizas (hifas, arbsculos
y esporas) se realiz utilizando azul tripn por
un procedimiento adaptado de Phillips y Hayman (1970), utilizando sucesiva baos que
permiten que las races se hacen permeables al colorante. Estructuras fngicas se
midieron mediante una lnea de rejilla mtodo de interseccin derivado de Tennant
(1975) que est adaptado para la cuantificacin de las estructuras fngicas intraradical
y del corredor de baja densidad hifas (Juge et al., 2009).
2.4. Extracciones de tejido para anlisis bioqumicos
Hojas, ndulos y races se tomaron muestras de cuatro macetas para cada tratamiento.
Cada tejido se agruparon de las tres plantas que crecen en una misma olla y se mezcla
a fondo para obtener una muestra homognea. Aproximadamente 1 g de peso fresco
(PF) de hojas, 0,5 g de peso fresco de ndulos,
y 0,5 g de peso fresco de las races se tomaron muestras y se liofiliz durante 72 horas
usando una zona franca a granel Bandeja Secadora (modelo 7806020, Labconco,

Kansas City, MO, EE.UU.) y un 12-L liofilizador (modelo 7754040, Labconco). Liofilizado
muestras se molieron a un polvo fino usando un mezclador
Molino (MM 301, Retsch GmbH & Co. KG, Haan, Alemania) y se almacena a
temperatura ambiente bajo condiciones secas. La extraccin de las hojas y los ndulos
para la cuantificacin
de hidratos de carbono, aminocidos y ureidos se realiz utilizando metanol:
cloroformo: agua (12: 5: 3, v / v / v) en una relacin 1: 6 (w / v) relacin de tejido /
extractante, se calienta 30 min a 65 C para detener la actividad enzimtica. Tubos se
centrifugaron a continuacin durante 10 min a 1500 g
y se recogi el sobrenadante. Para la separacin de fases, 0,25 ml de agua se aadi a
una submuestra-1 ml de sobrenadante, los tubos se sacudido y se centrifugaron
durante 3 min a 21.000 x g y la fase acuosa
Se recogi la fase. Una submuestra de 1 ml se evapor a sequedad en un evaporador
rotatorio, solubilizado en agua y se mantiene congelado a -80 C. Los residuos no
solubles que quedan despus de la extraccin se lavaron dos veces con 10 ml de
metanol y se utiliza para la determinacin de almidn en
hojas y ndulos. Para el anlisis de flavonoides, aproximadamente 0,1 g de muestras
de races fue extrado en 5 ml de metanol al 90% en un bao ultrasnico durante 15
min a 60 C. Las muestras fueron centrifugadas durante 15 min a Se recogieron 3.000
g y 1 ml del sobrenadante y se mantuvieron a-80 C.
2.5 . el anlisis de carbohidratos
Mono-, di-, tri- y tetrasacridos se separaron y cuantificaron por cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC ) . los sistema de anlisis fue controlado por software AGUAS
Empower ( AGUAS , Milford, MA , EE.UU. ) y estaba compuesto de un Modelo 515
bomba, un inyector automtico modelo 717plus y refraccin Modelo 2410 detector de
ndice ( AGUAS ) . Los azcares se separaron en un Bio- Rad
Columna HPX- 87P eluy isocrticamente a 85 C a una velocidad de flujo de 0.5 mL
min - 1 con H2O . Cantidad de identidad y el azcar de los picos sedeterminado por
comparacin con los estndares , como se describe en Bertrand et al. (2011 ) .
Azcares solubles totales son la suma de rafinosa , sacarosa,
glucosa, fructosa y pinitol . El almidn se cuantific como equivalentes de glucosa con
el phydroxybenzoic mtodo de hidrazida de cido de Blakeney y cordero ( 1980 )
despus de la gelatinizacin en 100 C y la digestin durante 90 min con
amiloglucosidasa (Sigma A7255 , Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO ) . Cantidades de
almidn se determinaron por espectrofotometra referencia a una curva estndar de
glucosa
2.6 . Anlisis de aminocidos
Veintin aminocidos se separaron y se cuantific usando Waters ACQUITY Ultra
Performant Cromatografa Lquida ( UPLC ) sistema analtico controlado por el software
Empower II (aguas , Milford, MA , EE.UU. ) . Los aminocidos se derivatizaron usando
AccQ
Tag reactivo Ultra ( carbamato de 6 - aminoquinolil -N- hidroxisuccinimidilo ) .
Los aminocidos se separaron en un Ultra Tag AccQ columna ( 2,1 mm 100 mm ) y se
detect con Waters ACQUITY Detector UV sintonizable a 260 nm bajo las condiciones
cromatogrficas se describe en Cohen ( 2007 ) . Identidad Peak y aminocidos cantidad
se determin por comparacin con una mezcla estndar que contiene los 21
aminocidos. Las concentraciones de aminocidos totales y de los aminocidos que
respondieron de manera significativa a los tratamientos se presentan en la Seccin 3
2.7 . anlisis ureidos
El sistema de HPLC para el anlisis de los ureidos consisti en una Modelo 510 de la
bomba, un inyector automtico modelo 717plus y un modelo 2487 Detector UV fijado

en una absorbancia de 200 nm ( AGUAS , Milford, MA , EE.UU). La alantona y cido

alantoideo se separaron en una columna YMC -Pack
ODS -AM ( 150 mm x 6 mm ID) de columna se eluy isocrticamente a 30 C con 10
mM de cido actico a una velocidad de flujo de 1 ml min- 1 . identidad pico de
alantona y cido alantoideo , y su cantidad se determinaron por comparacin con los
estndares . Ureidos totales son la suma de alantona y cidos alantoideo .
2.8. Anlisis de flavonoides
Daidzena, genistena y coumestrol y sus conjugados eran separado y cuantificado
usando Waters ACQUITY UPLC analtica controlada por el software Empower II (AGUAS,
Milford sistema, MA, EE.UU.). Los flavonoides fueron separados en un UPLC BEH Acquity
Columna C8 (2,1 mm 100 mm, 1,7 m) y detectado con Waters ACQUITY detector PDA
fijado en 240 nm. Las condiciones cromatogrficas fueron los siguientes: temperatura
de la columna, velocidad de flujo 35 C, 0.5 mL min-1, fase mvil A, cido frmico al
0,2% en agua, mvil fase B: metanol. El gradiente fue de 25% de B durante 0,4
minutos, 25 a 40%
B para 1,1 min (curva 6), mantenga durante 1,5 minutos, 40 a 50% de B durante 1,0
minutos (curva 2), 50 a 25% de B durante 0,01 min (curva 1), mantenga durante 2,5
minutos, para un recorrido total de 6,5 min. La identidad y la cantidad de daidzena,
genistena Peak y
coumestrol se determinaron por comparacin con los estndares.
Peaks las identidades de sus respectivos conjugados (glucsidos, glucsidos malonil
y glucsidos acetilo) se determinaron mediante la deteccin TQ (Detector Acquity TQ,
AGUAS) utilizando el mtodo descrito en el SIR
Gleldhill (2007). Flavonoides totales
son la suma de daidzena, coumestrol,
genistena y sus respectivos conjugados.
2.9 . El anlisis estadstico
Todos los datos recogidos fueron analizados por ANOVA, incluyendo los dos fechas de
cosecha y los cuatro tratamientos microbianos como factores fijos, y usando el
procedimiento de modelo lineal general (GLM ) del
Paquete de software SAS . La normalidad se puso a prueba mediante el univariante
procedimiento ( SAS Institute , Cary , Carolina del Norte , EE.UU. , 1999-2001) . Una
transformacin logartmicade los datos se utiliz , cuando sea necesario , para
satisfacer ANOVA

Pagina 4
3. Resultados
3.1. Biomasa area y radicular

Establecimiento de las plantas fue lento y slo alrededor de 1 g DW de rodaje

biomasa y 0,5 g DW de biomasa de races por maceta despus de 28 das de
de crecimiento (Fig. 1A y B). Despus de 56 das de crecimiento, el mayor
lanzamiento biomasa se observaron slo con Bradyrhizobium (B) y con B
asociado con Azospirillum (B + A). Biomasa rodaje fue significativa cativamente
menor con el B + A + Mthan de triple asociacin con B o B + A (Fig. 1A).
Biomasa de raz se increment significativamente por todos microbiana
combinaciones, en comparacin con solo Bradyrhizobium (P <0,05, Suppl.
Mesa 1). Biomasa de raz se increment en un 77% con B + A, por 35% con B +
M y en un 48% con B + A + M. La biomasa de races ms alto se midi con B +
A (Fig. 1B).
3.2. Nodulacin de soja
Durante el establecimiento (da 28), nodulacin fue menos profunda en el
presencia de hongos micorrcicos arbusculares (B + M y B + A + M) (P <0,01,
Suppl. Tabla 1, Fig. 2A). Este efecto fue sin embargo transitoria y la profundidad
de la raz de la nodulacin fue similar para todos los tratamientos final del
experimento (da 56). Diferencias significativas en el nmero y el tamao de
los ndulos se observaron en 56 das en respuesta a la diferentes
combinaciones de microorganismos. Tratamientos B + A + M y B + M tuvieron
significativamente menos ndulos de Bradyrhizobium solos (Fig. 2B).
Distribucin de tamao de los ndulos era diferente para el B + A + M
tratamiento que tena significativamente ms grandes ndulos que la otros tres
tratamientos y menos pequeos ndulos que B y B + M (Fig. 2C y D).
3.3. establecimiento Azospirillum
Nmeros de Azospirillum en las races no difirieron significativamente entre B +
y B + A + B Tratamientos en ambas fechas de muestreo (datos no mostrada).
El da 28, la densidad de poblacin media de Azospirillum fue de 3 104
clulas g-1 de raz mientras que aument a una media de 3 108 bacterias g1 de la raz en el da 56.
3.4. Micorrizacin de las races de soja
Como era de esperar, no la colonizacin intraradical se observ en el da 28.
Slo unos pocos apresorios eran visibles en varios lugares en la raz superficie,
que acredite el inicio temprano de la colonizacin de micorrizas (resultados no
mostrados). En el da 56, en respuesta al tratamiento B + M, hongo
ectomicorrzico estaba bien establecido las dos partes (superior e inferior) de
los sistemas de races, en las hifas intraradical, arbsculos y las vesculas eran
claramente visibles. La presencia de Azospirillum en el B + A + M tratamiento
redujo significativamente la micorrizacin en las races ms profundas en
comparacin con B + M (Fig. 3). En respuesta a la B + A + M de tratamiento, el
porcentaje de micorrizacin fue mayor en los 12 cm superiores (25% de las

races micorrizadas) en comparacin con el parte ms profunda del sistema

radicular (5% de las races micorrizadas).
3.5. Los hidratos de carbono en los ndulos
La concentracin de azcares solubles (suma de rafinosa, sacarosa, glucosa,
pinitol y fructosa) aumentaron significativamente en los ndulos entre el da 28
y da 56 (P <0,001, Suppl. Tabla 1, Fig. 4A1) y sacarosa fue el principal azcar
soluble en ndulos, que representa a ms del 75% de azcares solubles
(promedio de 15,3 mg g-1 DW, los datos no mostrado). Al final del experimento
(da 56), la concentracin de azcares solubles difirieron significativamente
entre B + M y B + A + M los tratamientos con la ms alta concentracin
medida en el segundo tratamiento.
La concentracin de pinitol disminuy significativamente en los ndulos de
alrededor de 5 mg g-1 en el da 28 a 3 mg g-1 en el da 56 (P <0,001, Suppl.
Tabla 1), donde fue similar para todos los tratamientos (Fig. 4B1). Se observ
una importante disminucin significativa de la concentracin de almidn en los
ndulos entre el da 28 y el da 56 para todos los tratamientos (P <0,001,
Suppl. Tabla 1, Fig. 4C1). Cabe sealar que durante el establecimiento (da 28),
la concentracin de almidn fue mucho mayor en respuesta a la tratamientos
con Azospirillum, B + y B + A + M (P <0,001, Supl. Mesa 1). El da 56, los
niveles de almidn fueron bajos (20 mg g-1) y similar para todos los
tratamientos.
3.6. Los hidratos de carbono en las hojas
La concentracin de azcares solubles totales en las hojas casi se duplic entre
el da 28 y da 56 (P <0,001, Suppl. Tabla 1). En el final del experimento un
nivel significativamente ms alto de azcares solubles se observ en respuesta
a la B + A + M de tratamiento (Fig. 4A2). Los concentraciones de pinitol
aumentaron en las hojas entre el da 28 y 56 de manera similar para todos los
tratamientos (Fig. 4B2), mientras que la concentracin de almidn disminuido
durante el mismo perodo (Fig. 4C2). El da 56, el ms bajo concentracin de
almidn en las hojas se obtuvo en respuesta a la B + tratamiento M y difera
significativamente de Bradyrhizobiumsolo, que tena la concentracin ms alta.
Pag 5
3.7. Concentraciones de aminocidos en los ndulos
Total concentracin de aminocidos en los ndulos incrementado
significativamentesigni desde el da 28 al 56 (P <0,001, Suppl. Tabla 1, Fig.
5A1). Esta aumento se debi principalmente a la asparagina, uno de los ms
abundantes cido amino en los ndulos, que la concentracin aument de
manera similar para todos los tratamientos, de 10 mol g-1 DW en el da 28 a 40

mol g-1 DW en el da 56 (datos no mostrados). El da 56, la concentracin de

amino cidos fue significativamente mayor en los ndulos en respuesta a la B
+ A tratamiento en comparacin con el B y los tratamientos B + M. El
glutamato es el segundo aminocido ms abundante en los ndulos y su
concentracin fue significativamente menor en presencia de los tratamientos
que contienen Azospirillum (B + A y B + A + M) durante establecimiento (P
<0,01, Suppl. Tabla 1) (Fig. 5B1). La glutamina era menos abundante y su
concentracin disminuy en los ndulos entre da 28 y da 56 para todos los
tratamientos microbianos (Fig. 5C1). Durante establecimiento (da 28), la
concentracin de glutamina fue significativamente mayor en respuesta a la B +
A co-inoculacin que para el otro tratamientos.Las concentraciones de cido
gamma-aminobutrico (GABA)difiere significativamente entre tratamientos en
el da 28, durante el establecimiento(P <0,01, Suppl. Tabla 1) y, como se
observ paraglutamato, GABA concentracin fue menor en respuesta a los
dostratamientos que contienen Azospirillum, B + y B + A + M (Fig. 6A1).
Por otro lado, la concentracin de prolina difiri entretratamientos slo al final
del experimento (da 56). A esotiempo, la concentracin de prolina fue
significativamente mayor en respuestaa B + A + M que a B + M y tratamientos
B (Fig. 6B1)
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3.8. Las concentraciones de aminocidos en hojas
Las concentraciones de aminocidos en las hojas eran ms de 10 veces mayor
que en ndulos. Total de nivel de aminocidos en las hojas casi duplicado del
da 28 al da 56 (P <0,001, Suppl. Tabla 1, Fig. 5A2). Al final del experimento, se
observ diferencias significativas en las concentraciones de aminocidos
totales: el nivel ms alto fue obtenido con B + M y el ms bajo con B y B + A +
M tratamientos, que eran similares. Concentracin de glutamato difiri entre
tratamientos slo en el da 28 con la mayor concentracin medidos en B + A +
M, que diferan significativamente de B + tratados A- plantas (Fig. 5B2). La
concentracin de glutamina aument significativamente entre el da 28 y da
56 para todos los tratamientos (Fig. 5C2). GABA fue el principal aminocido en
hojas y su concentracin duplicado entre el da 28 y el da 56 para todas las
combinaciones de microbios, con un mayor nivel significativo para el
tratamiento B + M en da 56 (Fig. 6A2). La concentracin de prolina tambin
aument con el tiempo en hojas, y al final del experimento, la concentracin de
prolina era significativamente mayor en respuesta a B + A + M que en
respuesta a B y B + M, como se observ en los ndulos (Fig. 6B2).
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3.9. Ureidos concentraciones en ndulos y en hojas

En ndulos, la concentracin de ureidos totales (cido alantoideo y alantona)

aument significativamente a partir del da 28 al da 56 (P <0,001,Suppl. Tabla
1, Fig. 7A). En las hojas, concentracin total ureidos fue muy baja durante
establecimiento y fue similar para todos los tratamientos (Fig. 7B). La
concentracin de ureidos aumentado ms de 10 veces entre das 28 y da 56.
Al final del experimento, la concentracin total de ureidos en las hojas fue
significativamente mayor en respuesta a la B + M tratamiento que para B y B
+ A + M, mientras que la concentracin era intermedia en respuesta a B + A.
3.10. Concentraciones de flavonoides en las races
Las concentraciones de flavonoides totales (daidzena, genistena, coumestrol y
sus principales conjugados) disminuyeron significativamente para todos los
tratamientos microbianos entre las dos fechas de cosecha (P <0,001, Suppl.
Tabla 1, Fig. 8A). Las concentraciones de totales flavonoides fueron
significativamente inferiores en respuesta a la B + A + M tratamiento el da 28
y para el B + Un tratamiento en el da 56 en comparacin a B solo. La
concentracin de la daidzena disminuy de manera similar para alltreatments
de aproximadamente 6 a 3 mg g-1 DW entre 28 das y 56 (Fig. 8B). Durante el
establecimiento (da 28), la concentracin de coumestrol fue significativamente
mayor en respuesta al tratamiento B que para cualquier combinacin de
microorganismos (P <0.05, Supl. Tabla 1). La concentracin de coumestrol
difera significativamente entre B + A + M y B + A al final del experimento (Fig.
8C).

4. Discusin
Bradyrhizobium, Azospirillum y micorrizas arbusculares son microorganismos
beneficiosos rhizosperic de plantas que tienen el potencial para mejorar la
produccin de biomasa. En este estudio bajo condiciones controladas
condiciones, hemos querido evaluar el efecto sinrgico de estos
microorganismos sobre el crecimiento de soja y la fisiologa. Todas las
combinaciones de microorganismos aumento de la biomasa de la raz de soja
como en comparacin con Bradyrhizobium solo. La biomasa rodaje fue sin
embargo no aumentado en respuesta a mltiples inoculaciones y estaba an
menor cuando la soja se inocul con los tres microorganismos juntos. Para
comprender mejor las complejas interacciones entre la planta y los
microorganismos, se evalu la nodulacin parmetros, as como la
concentracin de metabolitos relacionados a C y el metabolismo de N en hojas
y ndulos. Hemos observado, para todos los tratamientos, un aumento en la
concentracin azcares solubles en ndulos de durante el curso del tiempo
experimento que es consistente con un mayor importacin de fotosintatos para
apoyar la fijacin de N2. Adems, la gran disminucin dos de los hidratos de

carbono de almacenamiento, almidn y pinitol, durante el mismo perodo

muestra que estas dos fuentes de energa son utilizados por el ndulos para
apoyar su crecimiento y mantenimiento, as como para fijacin de nitrogeno.
Como resultado, el tallo y la raz biomasas y la nmero de ndulos aument
notablemente entre estas dos fechas. Adems, la concentracin de ureidos
aument en hojas durante ese perodo. Ureidos son los productos finales de la
fijacin de N2 exportado de ndulos de soja a los brotes que se cataboliza y
utilizado como fuente de N (Crawford et al., 2000). Sus acumulaciones,
concomitante con las de los aminocidos en las hojas son adicionales
indicadores de simbiosis eficientes y translocacin metabolito entre las plantas
y microorganismos. El crecimiento de la soja, la nodulacin y el metabolismo
difiere sin embargo de acuerdo con los microorganismos involucrados en la
asociacin. En las siguientes secciones, discutiremos por separado el efecto en
la soja de las diferentes combinaciones de microorganismos en comparacin
con Bradyrhizobium solo.
4.1. Efectos de Azospirillum (B + A)
La biomasa ms alta (shoot + raz) se observ en respuesta a la asociacin de
Azospirillum y Bradyrhizobium (B + A). Esta resultado est de acuerdo con la
estimulacin del crecimiento observado en general de leguminosas por
compaeros de inoculaciones de Azospirillum y Rhizobium (Volpin y Kapulnik,
1994). La microbiana B + Un tratamiento inducida el ms alto rendimiento de
races en comparacin con todos los otros tratamientos. Esta efecto de
Azospirillum est bien documentada en las legumbres (Volpin y Kapulnik, 1994)
y en la soja, donde estimulaciones de longitud de la raz, del crecimiento de las
races laterales y de los pelos radicales se han reportado (Molla et al., 2001).
Por otro lado, en presencia de Azospirillum, nodulacin se redujo como se
muestra por un menor nmero de ndulos en respuesta tanto a B + A y B + A
+ M tratamientos en comparacin con Bradyrhizobiuum solo. Esto est en
contradiccin con la observacin de Molla et al. (2001), de un aumento en el
nmero de ndulos en presencia de Azospirillum. La discrepancia entre estos
resultados podran deberse a la cepa Azospirillum que se utiliz en nuestro
experimento (A. canadense) ya que un estudio previo con soja inoculadas con
Azospirillum y otras especies mostraron PGPR que los efectos de la coinoculacin sobre la nodulacin dependan cepa (Chebotar et al., 2001).
Azospirillum embargo favoreci micorrizacin raz, particularmente en la parte
superior del sistema de raz. Durante establecimiento, los niveles ms bajos de
azcares solubles y el ms alto Se observaron niveles de almidn y pinitol en
ndulos de soja inoculado con tanto Bradyrhizobium y Azospirillum. Estas
resultados podran interpretarse como un efecto positivo de esta especfica
asociacin microbiana en el metabolismo de ndulo (Walsh et al., 1987)
4.2. Efectos de hongos micorrcicos (B + M)

La doble combinacin de Bradyrhizobium japonicum (B) y Glomus irregulare

(M) en el presente estudio no mejor soja disparar el rendimiento en
comparacin a B solo. Sin embargo, el rendimiento de raices fue aumentado, lo
que confirma el efecto de la mejora de la raz arbusculares micorrizas observ
en varias plantas hospederas (Hodge et al., 2009). En nuestro experimento, la
presencia de un hongo micorriza tuvo un impacto adverso en profundidad de
nodulacin despus del primer mes del experimento que podra indicar una
competencia por las races entre las micorrizas y Bradyrhizobium durante el
establecimiento; los sitios de races ocupados por uno de los simbiontes
habiendo ms disponible para la segunda. Estudios recientes demostraron que
en la alfalfa, una simbiosis establecida puede ejercer una inhibicin sistmica
de la segundo uno (Catford et al., 2003). Esta inhibicin podra explicarse por el
origen comn y caractersticas fisiolgicas entre arbuscularmycorrhizal y
simbiosis rizobios desde bothmicroorganisms responder a la misma seal de la
planta y desde que la planta podra tener sealizacin alterada cuando se
establece uno de los simbiontes, por tanto, reduciendo el establecimiento
Ofthe segundo. Este efecto inhibidor era sin embargo transitorios ya que al
final del experimento tanto profundidad de nodulacin y el nmero de ndulos
fueron similares para Bradyrhizobium solo y B + M, mostrando que bajo
nuestro experimental condiciones, el hongo micorrzica no perjudican soja
nodulacin en el largo plazo. La presencia Ofthe hongos micorrcicos parece
tener un impacto N en el metabolismo en los ndulos en el que se observ
altos niveles de GABA y glutamato de su precursor durante el establecimiento.
Esta mayor concentracin de compuestos de N en los ndulos apoyar la
hiptesis de que los suplementos de hongos micorrcicos arbusculares rizobios
con p, sosteniendo as bacteriana fijacin de N2 (Bethlenfalvay, 1992; Sprent y
James, 2007). Adems, Sulieman y Schulze2010) demostraron que el GABA
alimentacin en la savia del xilema aumentos N2- la fijacin de la actividad en
los ndulos de Medicago truncatula. Concluyeron que este aminocido no
proteico podra estar implicada en la regulacin al alza actividad ndulo como
un constituyente del ciclo del cido amino en ndulos de leguminosas
(Sulieman, 2011). GABA tambin se ha demostrado que mediar en las
interacciones entre plantas y microorganismos y a acumular en respuesta al
estrs bitico (Roberts, 2007) y la alta concentracin de GABA en los ndulos
de soja en respuesta a B + M podra estar relacionado con su papel como una
molcula de sealizacin. Al final del experimento, se observ una mayor
concentracin de compuestos N (aminocidos y ureidos) en hojas de soja en
respuesta a B + M en comparacin con los otros tratamientos. Esto indica que
hojas se convirtieron en un lavabo ms fuerte de compuestos N producidos por
los ndulos durante el transcurso de tiempo del experimento. La acumulacin
de Sin embargo los compuestos de N en las hojas pueden causar la inhibicin
de retroalimentacin de fijacin de N2 en los ndulos (Rey y Purcell, 2005;
Bertrand et al., 2011). El nivel ms bajo de almidn en las hojas de las plantas
inoculadas con B + M en el da 56 podra significar que el hongo utiliza el

transloca planta reserva hidratos de carbono para construir su propia biomasa

y consume ms C por su respiracin de mantenimiento que por su beneficiosa
efectuar en la planta, lo que priva en parte, la planta de la directa ventaja de
crecimiento de la doble simbiosis (Kaschuk et al., 2009). Al comparar la
asociacin de Bradyrhizobium con cualquiera Azospirillum u hongos
micorrcicos, nuestros resultados indican que Azospirillum indujo menos
competencia para la nodulacin y ms positiva efectos sobre el metabolismo
de la planta, a travs de la acumulacin de reservas de hidratos de carbono en
ndulos (Walsh et al., 1987), que la hongos micorrcicos.
4.3. Efectos de la combinacin microbiana triple (B + A + M)
La inoculacin con los tres microorganismos juntos tena unaimpacto adverso
sobre la biomasa rodaje de la soja. La asociacin de triple reducido la
profundidad de las races de la nodulacin durante el establecimiento y
reducido el nmero de ndulos en el final del experimento el cual podra indicar
una competicin cuando los tres microorganismos son presente. Esta hiptesis
se ve apoyada por la observacin de un micorrizacin menos profunda del
sistema radicular cuando Azospirillum era presente. Es bien conocido que las
races de micorrizas tienen el potencial de afectar y ser afectado por
microorganismos de vida libre durante la iniciacin y formacin de micorrizas
(Johansson et al., 2004). Sin embargo, es notable que la presencia de
micorrizas no inhibi la poblacin Azospirillum para los que la densidad celular
fue similar tanto para B + A y B + A + M. La combinacin triple tambin
modificado la distribucin de tamao del ndulo aumentando el nmero de
grandes ndulos mientras que disminuye el nmero de ndulos pequeos. Esta
incremento en el nmero de ndulos grandes podra ser beneficioso para N2
fijacin desde grandes ndulos de soja se han notificado a ser ms eficientes
que los pequeos (King y Purcell, 2001;. Prvost y otros, 2010). Es sin embargo
no se traducen en la biomasa de soja mayor en nuestro experimento. Esto
podra ser explicado por un uso ineficiente de azcares desde azcares
solubles fueron ms abundantes en los ndulos y hojas de soja inoculados con
la asociacin triple. El ms bajo
biomasa rodaje tambin podra estar
relacionado con el hecho de que las plantas eran subraya en presencia de los
tres simbiontes. Se ha observado una alta concentracin de prolina en ambos
ndulos y deja atthe final Ofthe experimento en respuesta a este tratamiento.
Proline ha demostrado a acumularse en las plantas en respuesta a una amplia
gama de bitico y estreses abiticos y para actuar como un soluto compatible
al tiempo que la capacidad para estabilizar la estructura celular y de
desintoxicar los radicales libres (Hare y Cress, 1997)
4.4. Sealizacin microbio Planta
Flavonoides raz son las seales moleculares que intervienen en la general,
proceso entre la planta y microorganismos reconocer. Como fue reportado por

Antunes et al. (2006) se observ que la daidzena, genistena y coumestrol son

compuestos de seal clave asociados con la establecimiento de simbiosis con
soja, con daidzena siendo el mas abundante. En nuestro estudio, el nivel de
flavonoides totales disminuy durante el transcurso de tiempo del experimento
en respuesta a todo microorganismo tratamientos. Esto podra ser una
indicacin de que la planta tena reconocido todos los microorganismos como
socios benficos. En uno de los primeros estudio con soja micorrizas, Morandi
et al. (1984) observado ligeras acumulaciones de daidzena y coumestrol en
las races de soja. Llegaron a la conclusin que la ligera acumulacin de estos
flavonoides, Adems de ser beneficioso para los hongos micorrcicos, aumenta
planta resistencia a los ataques patgenos posteriores al permitir a las plantas
para producir rpidamente grandes cantidades de flavonoides que son txicos
tanto a las bacterias y nematodos. Desde flavonoides raz disminuyeron entre
el da 28 y da 56, se podra concluir que ninguno de los microorganismos
utilizados en nuestro experimento fueron reconocidos por la planta como
patgeno. Durante el establecimiento, la concentracin de coumestrol fue
menor para todas las combinaciones mltiples microbianos como en
comparacin con Bradyrhizobium solo. Antunes et al. (2006) observaron un
nivel similar inferior de coumestrol en la soja cuando ambos B. japonicum y
Glomus clarum estuvieron presentes en comparacin con cada uno
microorganismo solo y lleg a la conclusin de que este flavonoide podra ser
una molcula reguladora para el establecimiento de ambos en simbiosis de
soja. Cumestrol se ha demostrado para estimular crecimiento de las hifas (Xie
et al., 1995), as como para inducir genes NOD en Bradyrhizobium Kosslak et
al., 1987) .Inour experimento observeda ms bajo similar nivel de coumestrol
en presencia de Azospirillum lo que sugiere que la tres asociaciones mltiples,
B + A, B + M y B + A + M podra ser regulada por las mismas seales de
flavonoides en la soja. Para nuestro conocimiento, una menor concentracin de
coumestrol en las races de soja en presencia de Azospirillum nunca se ha
reportado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Carole Gauvin-Trudel, Sandra Delaney, Jose Bourassa y el
Dr. M.-O. Duceppe por su excelente asistencia tcnica. Esta estudio fue
apoyado por el proyecto hay 830 de los suelos y la AAFC Cultivos Centro de
Investigacin y Desarrollo, Quebec. El apoyo financiero del Centro SVE (cluster
estratgico de la "Fonds de recherche sur la nature et les tecnologas "(FQRNT)
del Gobierno de Qubec)a A. Bertrand, D. Prvost y F.-P. Chalifour es
agradecida reconocido. Dedicamos este artculo en la memoria de nuestro
amigo y su colega el Dr. Horst Vierheilig (1960 hasta 2011).