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Control biolgico de la fusariosis de crisantemo con trichoderma e ingredientes botnicos1

Pawan Kumar Singh and Vijay Kumar (Autores)


Laboratorio de investigacin microbiano, departamento de botnica, Christ Church College,
Kanpur 208001, U.P. India.
Pawan Jumar Singh y Vijay Kumar (2011) Control biolgico de la fusariosis de crisantemo con
trichoderma e ingredientes botnicos. Revista de tecnologa agrcola. 7(6): 1603-1613.

El agente de control biolgico adecuado e ingredientes botnicos para el control de la fusariosis de


crisantemo fueron investigados. Siete cepas2 de Trichoderma harzianum (Th) nombrados, T1, T2,
T3, T4, T5, T6 y T7 se seleccionaron por su potencial de control biolgico contra la altamente
virulenta Fusarium oxysporum f. sp3 chrysanthemi (Foc) cepa FO-10. Las cepas de Th inhibieron
efectivamente el crecimiento micelial de Foc y la mxima inhibicin fue registrada con T3 (66.0%).
Ocho ingredientes botnicos llamados Mentha arvensis (MA), Tagetus patula (TP), Eucalyptus
sp (ES), Datura stramonium (DS), Calotropis procera (CP), Lantana sp (LS), Ricinus communis
(RC) and Catharanthus roseus (CR) fueron evaluados por su potencial de biocontrol contra Foc
utilizando la tcnica de envenenamiento de alimentos. La inhibicin mxima en el crecimiento
radial de Foc fue registrada en la concentracin de 3,0% con MA (63%) y el mnimo con CR (42%).
Un aumento en el % de inhibicin del crecimiento micelial de Foc se registr con el aumento de la
concentracin de ingredientes botnicos. Cepas de Th, T3, T4 y T5 y botnicos MA, TP y DS fueron
seleccionados por sus rastros de control biolgico en macetas basados en su rendimiento en
condiciones in vitro. Mximo control de enfermedad fue registrado con T3 (92%) y mnimo con T5
(81.0%). Tratamientos del suelo con ingredientes botnicos redujeron el marchitamiento y el
mximo control de la enfermedad fue registrado con MA (70.0%). Seguido por TP (61.0%) y DS
(50.0%). Resultados de la co-aplicacin de botnicos con Th revelan que no hubo un incremento
significativo en el control de la enfermedad y las aplicaciones individuales de cepas de Th fueron
ms efectivas para controlar Foc.
Palabras clave: Fusarium oxysporum f. sp chrysanthemi, Trichoderma harzianum,
IngredientesBotnicos, Biocontrol, Crisantemo, inhibicin, crecimiento.
Introduccin
El Crisantemo es uno de los cultivos de la floricultura comercial ms destacado, que se cultiva para
el corte y venta de flores sueltas (menudeo) en todo el mundo. Las plantas de crisantemo son
1

Fibra, jugo, aceite, pulpa, tejido u otros componentes derivados de las plantas y usados en cosmticos,
suplementos alimenticios, productos de cuidado personal o productos farmacuticos.
2

en microbiologa, una variante fenotpica de una especie o, incluso, de un taxn inferior, usualmente
propagada clonalmente, debido al inters en la conservacin de sus cualidades definitorias. De una
manera ms bsica puede definirse como un conjunto de especies bacterianas que comparten, al
menos, una caracterstica.
3

Una categora taxonmica, especialmente de hongos, por debajo de la de las especies y definidos por las
caractersticas fisiolgicas, especialmente como afectan a la patogenicidad. La abreviatura se utiliza en los
nombres binomiales, entre el nombre de la especie y su clasificacin especial.

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infectadas por diversas enfermedades fngicas, bacterianas y virales. La Fusariosis de crisantemo


causado por Fusarium Oxysporum f. sp chrysanthemi (Foc) es una de las enfermedades ms
destructivas y de amplia difusin causando infeccin y prdida desde el semillero hasta la etapa de
floracin. Foc es difcil de controlar debido a su persistencia en el suelo. Graves prdidas de
cultivos de crisantemo causadas por Foc son reportadas desde varias partes del mundo (Garibaldi
et al., 2009; Minuto et al., 2007; Murkar et al., 1994). Foc tiene una habilidad nica para cambiar
su rango de huspedes y es reportado que junto con Crisantemo tambin afecta Gerbera
jamesonii Argyranthemum frutescens (Margarita de Paris) y Osteospermum sp. Slo pocas
variedades de Crisantemo fueron reportadas resistentes a todas las clases de Foc probadas.
Seleccin y uso de cultivares resistentes de Crisantemo tienen un xito limitado controlando la
enfermedad (Minuto et al., 2007; Garibaldi et al 2009; Minuto and Garibaldi, 2008).
Varios productos qumicos y fungicidas como benomil, Ethazol, metil-tiofanato, bitertanol,
triadimefon, tiabendazol, carboxin. Han sido utilizados para controlar Foc de los cuales metiltiofanato fue reportado por proporcionar mximo control de la enfermedad en (0.21 gramos de
ingrediente activo en la porcin (g.a.i) / litro). Un incremento en las concentraciones de
fungicidas qumicos tiene efectos negativos en la plantas (Strider, 1982). El uso de qumicos y
fungicidas conduce a grave contaminacin ambiental y tambin la poblacin de microbios
beneficiosos se reduce.
Disminucin en la poblacin de Foc con extractos de clavos y pimienta fue reportada por
Bowers y Locke (2000). Las propiedades antifngicas y antimicrobianas de varios extractos de
plantas y aceites esenciales son investigados por muchos trabajadores Aliero et al., 2000;
Boulenouar et al., 2009; Pizana et al., 2010; Ayed et al., 2007; Singh and Singh, 1980; Guddewar
et al., 1999; Hassannein et al., 2008).
La actividad antifngica de botnicos contra cepa local de Foc fue tambin investigada por
nosotros en nuestros estudios anteriores. (Singh and Kumar, 2011). En general, se supone que los
componentes activos que contribuyen a estas propiedades antifngicas de los extractos son fitoqumicos (Okwu, 2004).
Trichoderma sp. tiene una capacidad nica para controlar los patgenos de las plantas mediante el
uso de mecanismos de micro parasitismo, antibiosis, competicin, produccin de siderforos,
induccin de resistencia sistmica, etc. (Chet, 1987; Dennis and Webster 1971, Upadhyay and
Mukhopadhyay,
1986; Howell, 2003).
Capacidad antagnica de diferentes cepas de Trichoderma en diferentes formas especiales de
Fusarium oxysporum est bien documentada (Kerkeni et al, 2007;. Dohroo, 1995; Orole y
Adejumo, 2009; Sivan y Chet, 1989). Una revisin crtica de la literatura revela que muy poco
trabajo fue hecho en el manejo ecolgico de Foc. Se llev a cabo la presente investigacin para
averiguar los mtodos ecolgicos de control de Foc, implementando Th e ingredientes botnicos.
Los intentos se realizaron tambin para averiguar la idoneidad de co-aplicacin de Th con
ingredientes botnicos.
Materiales y mtodos
Aislamiento del antagonista
El presente estudio se llev a cabo durante el ao 2007 al 2010. Muestras rizosfricas de suelo
frescas de Kanpur, India fueron recogidas de viveros y campos en bolsas de polietileno. Las

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muestras se secaron bajo un flujo de aire laminar y diluciones en serie hasta 10-6 fueron
preparadas. Tubos de ensayo con diluciones de suelo se agitaron en el agitador vortex (Marca:
REMI) a 1500 RPM durante 2 minutos y se esparcieron sobre las cajas de petri con la Trichoderma
Media Selectiva4 (TMS). Las colonias de hongos se subcultivaron en PDA y fueron identificados
como las cepas de Th.
Proyeccin del antagonista en contra de Foc
Todas las 7 cepas de Th fueron seleccionadas por su potencial de biocontrol contra la altamente
virulenta cepa de Foc FO-10 (NCFT n-1374), utilizando la tcnica de cultivo dual. Cinco mm de Th y
Foc se cortaron a partir de cultivo de 5 das de edad y se colocaron opuestos entre s en 90 mm
cajas de Petri que contenan medio PDA. Las cajas de Petri inoculadas se incubaron a 25 2 C y la
colonia dimetro de Th y Foc se registraron peridicamente hasta 7 das. Controles de ambos, los
hongos se inocularon por separado en el centro de las placas de Petri. Todos los tratamientos se
tomaron por triplicado y el experimento se llev a cabo dos veces. La frmula utilizada para el
clculo del porcentaje de inhibicin en el cultivo dual de las placas de Petri fue la siguiente: % de inhibicin sobre control =

C = Crecimiento del hongo en el control de las placas de Petri


T = Crecimiento del hongo doble cultivo en las placas de Petri
Proyeccin de los ingredientes botnicos en contra de Foc
Los extractos de plantas de MA, TP, ES, DS, CP, LS, RC y CR se ensayaron para determinar su
potencial anti fngica contra la anterior cepa de Foc FO-10, utilizando la tcnica de alimentos
envenenados (Grover y Moore, 1962). Se utilizaron muestras de hojas de plantas superiores
para la preparacin de extracto. Cincuenta gramos de muestras de hojas fueron tomadas en un
mortero e igual cantidad de agua caliente se aadi a la misma. Despus de la molienda
adecuada, las muestras se filtraron a travs de tela de muselina seguido de vidrio sinterizado (G
5) y se usaron para los estudios adicionales. Concentraciones de 1,0% y 3,0% se prepararon
mediante la adicin de cantidad necesaria de extracto seco a la media agar papa dextrosa.
(Concentration of 1.0% and 3.0% were prepared by adding requisite amount of dried extract to
Potato Dextrose Agar medium.)
Los medios que contienen extractos se vertieron en
cajas Petri (90 mm) y se inocularon en el centro con el disco de micelio (5 mm) por encima de
la cepa de Foc, cortada desde el margen de 5 das de edad del cultivo. Las placas se incubaron a
25 20C y el crecimiento radial se registr peridicamente hasta 10 das.
Ensayos de maceta para el control de la marchitez utilizando botnicos y Th
Las tres mejores cepas de Th (T3, T4, T5) y botnicos (MA, TP, DS) fueron seleccionados para los
ensayos de maceta basados en su eficacia frente a la cepa de Foc F0-10, bajo condiciones in
vitro. Las cepas seleccionadas de Th fueron multiplicadas en masa en salvado de arroz (Rice
Bran RB) de residuos agro-celulsicos. Residuos agro del salvado de arroz fueron humedecidos,
y esterilizados tres veces en el autoclave a 15 por 20 minutos en bolsas de polietileno auto
esterilizables. Suspensin de esporas (ufc 105) de cepas de Th se prepararon en agua estril y
destilada y se inocul en 5 ml / bolsa. Foc se multiplic en un medio de salvado de arena de maz
utilizando el procedimiento anterior. Bolsas inoculadas con cepas de Th y Foc se incubaron a 25
2 C durante 15 das. Cultivos multiplicados en masa fueron secados bajo la sombra, molidos a
polvo y usados como inoculantes del antagonista y el patgeno. Cortes de crisantemo fueron
4

Medio de cultivo que contiene ingredientes que inhiben el crecimiento de contaminantes o


microorganismos distintos de los que se desea.

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preparados de plantas madre saludables usando ollas de barro planas ( 18 pulgadas de dimetro)
conteniendo arena esterilizada.
Suelo de jardn fue esterilizado y puesto
en ollas de barro (12 pulgadas de dimetro) para ensayos
8
de biocontrol. Foc inculo (Cfu 10 ) se aadi a 10 g / kg de suelo8en macetas y mezclado a
fondo. En el tratamiento de primera, se aadi Th inculo (cfu 10 ) a 10g / kg de suelo en
maceta, dos das despus de la adicin del inculo Foc. En el tratamiento el segundo botnico se
aadi a 30 ml / kg (3,0%) de suelo en macetas, dos das despus de la adicin del inculo Foc. En
el tercer tratamiento, se realiz co-aplicacin de botnico cepa de Th a 30 ml y 10 g por kg de
suelo en maceta respectivamente. Macetas de control no fueron inoculados con Th e ingredientes
botnicos y slo contenan Foc.
Las macetas arriba preparadas se plantaron con esquejes enraizados de crisantemo de treinta y
cinco das de edad. Veinticuatro rplicas se mantuvieron durante cada tratamiento y controladas.
Se observaron las plantas para sntomas de marchitamiento y los datos sobre el nmero de
plantas marchitas se registraron. Los ensayos se realizaron por encima de dos temporadas
sucesivas utilizando el mismo material y mtodos.
Anlisis estadstico
Se analizaron los datos de la inhibicin del crecimiento radial y control de enfermedades para
la desviacin estndar seguido con clculo del error estndar. Todos los datos se sometieron a
anlisis de varianza (ANOVA) para averiguar su significado.
Resultados
Efecto de Th controlando Foc bajo condiciones in vitro.
Todas las 7 cepas de Th inhiben eficazmente el crecimiento micelial de Foc en el cultivo doble.
La inhibicin mxima se registr con la cepa T3 (66%) y el mnimo con T2 (50%). Porcentaje de
inhibicin del crecimiento de Foc por cepa de Th en orden decreciente fue T3, T4, T5, T1, T7,
T6, y T2 (Figura 1).

Fig. 1. Porcentaje de inhibicin del crecimiento con diferentes cepas de Th bajo


condiciones in vitro. Los valores representan el porcentaje de inhibicin con
desviacin estndar ().
Efecto de ingredientes botnicos en contra de Foc en la tcnica de envenenamiento de
alimentos
Todos los 8 ingredientes botnicos utilizados contra las cepas de Foc verificaron
efectivamente su crecimiento del micelio en el medio de la placa de Petri. Se observ un
aumento en el porcentaje en la inhibicin del crecimiento de Foc al aumentar la
concentracin de ingredientes botnicos. Para todos los tratamientos mxima inhibicin en
el crecimiento radial fue registrado en la concentracin de 3,0%. La inhibicin del
crecimiento micelial fue mxima con MA (63%) seguido de TP (59%), DS (56%) CP (54%), LS
(51%), ES (48%), RC (44%) y CR (42%). Secuencia similar de eficacia fue registrado en la

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concentracin de 1,0% (Tabla 1).


Tabla 1. Eficacia de los ingredientes botnicos en contra de Foc en concentracin de 1.0% y
3.0%. Los valores representan los medios con desviacin estndar

Ingredientes Botnicos Concentracin %


M.arvensis

1.0
3.0

T.patula

1.0
3.0

Eucalyptus sp

1.0
3.0

D.stramonium

1.0
3.0

C.procera

1.0
3.0

Lantana sp

1.0
3.0

R.communis

1.0

Crecimiento
Radial (mm) de
Foc
Inhibicin al crecimiento (%)
0.33
0.33
0.00
0.00
0.33
0.33
0.58
0.58
0.58
0.58
0.58
0.00
0.58

44.3
30.6
46.0
34.0
54.6
42.6
47.0
36.0
49.0
38.0
53.0
40.0
58.0

46.80
63.20
44.80
59.20
34.40
48.80
43.60
56.80
41.20
54.40
36.40
51.90
30.40

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3.0
C.roseus

1.0
3.0

Control

0.0

0.33
0.00
0.58
0.33

46.3
59.0
48.0
83.3

44.40
29.20
42.40
-

Efecto de Th controlando Foc en macetas


Cepas de Th T3, T4 y T5 fueron seleccionados por los rastros de control biolgico basado en su
rendimiento en los estudios de cultivos duales contra Foc. Entre las 3 cepas el mximo control
de la enfermedad fue registrado con T3 (91,0%) y el mnimo con T5 (81%). Control de
enfermedades proporcionada por cepa T3 fue significativamente ms alta entre todos las cepas
de Trichoderma. Una ligera variacin en el potencial de control de la enfermedad se observ
dentro de las cepas de Th, ya que se registr en doble cultivo (Figura 2).

Fig 2. Efecto en la aplicacin al suelo de cepas de Tichoderma en el control de marchitamiento


por Fusarium de plantas de Crisantemo, causado por cepa de Foc F0-10. Los valores
representan la media con desviacin estndar (). Los datos son el promedio de dos temporadas
Efecto de ingredientes botnicos en el control de Foc en macetas
Tratamientos del suelo con productos botnicos causaron reduccin en la enfermedad del
marchitamiento por Fusarium de plantas de Crisantemo (Figura 3). Mximo control de la
enfermedad fue registrado con MA (70,0%). Seguido de TP (61,0%) y DS (50,0%). Todos los 3
ingredientes botnicos mostraron potencial antifngico y redujeron con xito la eficacia de Foc
para causar enfermedades en plantas de Crisantemo.

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Fig 3. Efecto en la aplicacin al suelo de tres ingredientes botnicos en control de la


enfermedad del marchitamiento por Fusarium de plantas de crisantemo, causada por cepa de
Foc F0-10. Los valores representan la media con desviacin estndar. Los datos son el
promedio de dos temporadas
Efecto de la co aplicacin de Th e ingredientes botnicos en el control de Foc en macetas
Los resultados obtenidos de rastros de co-aplicacin revelaron que no hubo un incremento
significativo en el control de la enfermedad cuando la aplicacin de Th se realiz junto con
ingredientes botnicos. Los resultados fueron similares, ya que fue con ingredientes botnicos
con una ligera reduccin de la marchitez (Figura 4) Control de enfermedades proporcionado
por cepas de Th fue ms alto en comparacin con productos botnicos ya sea solos o en coaplicacin.

Fig 4. Efecto de la aplicacin en el suelo de 3 ingredientes botnicos, cepa T3 de Trichoderma


en control de la enfermedad de marchitez por Fusarium de Cristantemo causado por cepa de
Foc F0-10. Los valores representan la media con desviacin estndar. Los datos son el
promedio de dos temporadas.
Discusin
El potencial de biocontrol de cepas de Th en contra de Foc variaron entre s. Porcentaje de
inhibicin del crecimiento de 50.0 a 66.0 se registr por diferentes cepas de Th. T3 era ms
prometedora contra el patgeno de marchitamiento y registr inhibicin mxima. Resultados
similares fueron las conclusiones de Orole y Adejumo (2009). Ellos informaron inhibicin del
crecimiento radial de especies de Fusarium de 25 a 75% en Trichoderma. Existe una variacin
en el porcentaje de la inhibicin para el aislamiento individual de Trichoderma contra Foc.
Resultados de la tcnica de envenenamiento de alimentos revelaron que los ingredientes
botnicos utilizados tienen la capacidad de reducir el crecimiento de la cepa de Foc FO-10.
Porcentaje de inhibicin de Foc, increment con el aumento de la concentracin de
ingredientes botnicos que sugiere que a alta concentracin es ms adecuado debido a la
presencia de gran cantidad de compuestos antifngicos. El porcentaje de inhibicin mxima se
registr con MA seguido de TP, DS y mnima con CR. Riaz et al. (2008) informaron de 54.0 a
79.0% crecimiento de inhibicin de Fusarium oxysporum f. sp. Gladioli usando el extracto de
Tagetus erecta en concentracin de 2,0 a 8,0% . Tagetus sp. tiene propiedades fungicidas
debido a la presencia de tiofenos en sus tejidos (Gmez-Rodrguez et al., 2003). La actividad
antifngica de ingredientes botnicos (LS, CP, CR, RC etc) ha sido reportada por varios
trabajadores contra Fusarium sp y hongos patgenos de otras plantas (Bansal y Rajesh, 2000;
Begum et al., 2007; Abdulrahman y AlKhail, 2005).
Los resultados obtenidos de los rastros de las macetas revelaron que la eficacia de Foc para
infectar las plantas drsticamente se redujo debido a la aplicacin al suelo de ingredientes
botnicos. Bowers y Locke (2000) informaron de reduccin de la poblacin de Foc en el suelo
por 97,5% cuando el suelo se trat con 10% de extracto acuoso de clavo de olor. Disminucin
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de la poblacin en el suelo del patgeno (Foc), debido al extracto de ingredientes botnicos


puede ser la posible razn de la reduccin de la enfermedad de marchitez. Extractos MA
mostraron mayor actividad anti-hongos y era ms prometedor en el control de Foc. Ghorbany
et al. (2010) informaron del extracto de Mentha sp para causar inhibicin del crecimiento de
Fusarium oxysporum f. sp. cumini, apoya nuestras conclusiones. Sharma y Trivedi (2002)
informaron de la inhibicin del crecimiento (72,0%) de Fusarium oxysporum f. cumini sp con el
extracto de D.stramonium. En general se supone que los componentes activos que contribuyen
a estas propiedades antifngicas de los extractos son fito-qumicos. Los Fitoqumicos
constituyen uno de los grupos ms ampliamente distribuidos de sustancias en el reino vegetal.
Las plantas leosas y hierbas son conocidas por sintetizar y acumular una gran variedad de
fitoqumicos en sus clulas y tejidos. Estos fitoqumicos son compuestos fenlicos de bajo peso
molecular tales como cido hidroxibenzoico, cido hidroxicinmico, acetofenona, flavonoides,
estilbenos y lignanos), as como oligo o formas polimricas tales como hidrolizables y taninos
condensados y ligninas (Cerrar y McArthur, 2002; Okwu y Omodamiro , 2.005).
Los resultados obtenidos de los experimentos de control biolgico revelaron que las cepas de
Th efectivamente controlaron Foc y hubo una reduccin de 81.0 - 91,0% en el marchitamiento
de las plantas de crisantemo. Mximo control de la enfermedad fue registrado con la cepa T3 ,
seguido de T4, y T5. Se observ una correlacin directa en el potencial de biocontrol de cepas
de Th en placas de cultivo dual y en los ensayos de macetas En ambos experimentos los (in
vitro e in vivo) La cepa de Th T3 era ms eficaz en el control del patgeno del marchitamiento.
Coaplicaciones de Th e ingredientes botnicos no se vieron afectados de manera significativa
en la reduccin de la enfermedad de marchitez en comparacin con Th e ingredientes
botnicos por s solos. La razn detrs de esto debe ser el reducido potencial de biocontrol de
Th debido a la naturaleza txica del hongo de los ingredientes botnicos y por lo tanto efectos
de biocontrol de los ingredientes botnicos fueron nicamente observados en co-aplicacin. El
presente experimento indica claramente que la aplicacin de Th con botnicos no es un
mtodo eficaz de biocontrol de Foc. Cepas de Th e ingredientes botnicos dieron el potencial
para controlar Foc. Potencial de botnicos en condiciones in vitro estuvo a la par con las cepas
de Th pero en los ensayos en macetas Th fueron superiores en el control de la enfermedad de
la marchitez causada por Foc. Por lo tanto, la aplicacin de cepas de Th sera un mtodo ms
eficaz de controlar Foc en comparacin con productos botnicos.
Reconocimiento
Los autores estn agradecidos principalmente a Christ Church College, Kampur, UP, india por
facilitar sus instalaciones.
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(Recibido 17 Mayo 2011; aceptado 1 Octubre 2011)

Translated by JJNC