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La expresin recombinante, purificacin y caracterizacin biofsica del

transmembrana y la membrana proximal dominios de VIH-1 gp41
Resumen: La subunidad transmembrana (gp41) del glicoprotena de la
envoltura del VIH-1 asociados no covalente con la subunidad de superficie
(gp120) y juntos juegan un papel esencial en la mucosa viral la transmisin y la
infeccin de las clulas diana. La membrana regin proximal (MPR) de gp41 es
altamente conservado y contiene eptopos de anticuerpos ampliamente
neutralizantes. El transmembrana (TM) dominio de gp41 no slo ancla la
glicoprotena envolvente compleja en la membrana viral, pero tambin afecta
dinmicamente las interacciones del MPR con la membrana. Aunque de alta
resolucin Estructuras de rayos X de algunos segmentos de la TPM se
resolvieron en el pasado, que representan la post- formas de fusin. La
informacin estructural en el dominio TM de gp41 es escasa y en baja
resolucin. Aqu se describe el diseo, expresin y purificacin de un
constructo de protena que incluye MPR y el dominio transmembrana de gp41
(MPR-TM TEV-6His ), Que reacciona con el ampliamente neutralizantes
anticuerpos 2F5 y 4E10 y por lo tanto pueden representar una conformacin
inmunolgicamente relevante imitando un prehairpin intermedio de gp41. El
nivel de expresin de MPR-TM TEV-6His se mejor
Abreviaturas: Ab, de anticuerpos; bDDM, nb-dodecil-D-maltsido; CD, dicrosmo
circular; CHR, C-terminal regin de repeticin heptad de gp41; CTB, la
subunidad B de la toxina del clera; CTD, dominio de cola citoplsmica de
gp41; CV, volumen de la columna; DLS, disper- luz dinmica En g; FP, pptido
de fusin de gp41; FPPR: pptido de fusin de gp41 regin proximal; GalCer,
ceramida galactosil-; VIH-1, humana Virus de la Inmunodeficiencia Tipo 1; IPTG,
isopropil BD-1-tiogalactopiransido; mAb, anticuerpo monoclonal; MPER,
membrana regin externa proximal de gp41; MPR, la regin de gp41
correspondiente a la MPER y parte de la CDH; NHR, N-terminal regin de
repeticin heptad de gp41; RMSD, desviacin cuadrada raz media; SEC,
cromatografa de exclusin; SMS, complementario Seccin de Material; SPR,
resonancia de plasmn superficial; TEV, virus del grabado del tabaco; TM,
dominio transmembrana de gp41.
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Introduccin La glicoprotena envolvente de la inmunodeficiencia humana Tipo
de virus de deficiencia 1 (VIH-1) juega un papel esencial en la fijacin del virus
y la fusin con las clulas diana 1 y es tambin un objetivo principal para el
diseo de vacunas. 2 Es un com- complejo consistente en dos subu- asociado
de forma no covalente liendres que se escinden de la poliprotena precursora
para formar la superficie (gp120) y la transmembrana subunidad (gp41). 3 El
anclaje de transmembrana, gp41, consiste en un ectodominio (residuos 512 a
683, Fig. 1), un dominio transmembrana (residuos 684 a 705), y una dominio
citoplsmico (residuos 706 a 856). 3,4 Biofsicos cal y estudios estructurales

delinean ms clara caractersticas estructurales y funcionales dentro de la

ectodo- principal de gp41 (Fig. 1), incluido el N-terminal y Regiones de
repeticin heptad C-terminal (NHR y CHR) 3,5,6 que estn flanqueadas por el
pptido de fusin (FP) y la regin proximal pptido de fusin (FPPR) en un lado,
y la membrana externa proximal regin (MPER) en el otro lado. La infeccin de
clulas diana por VIH-1 se inicia cuando gp120 se une a su receptor primario
CD4 y sin ncleo Ceptor, por lo general CCR5 o CXCR4. 7,8 El nismo exacta
nismo que conduce a la entrada del virus todava no se conoce. LA modelo
actual propone que despus de la unin de gp120 a sus receptores, la
subunidad gp41 est expuesto, desencadenando cambios secuenciales
drsticos en su conformacin macin que culmin en la fusin entre el enveviral Lope y la membrana plasmtica de la clula diana. 9-11 De acuerdo con
este modelo, NHR y CHR de gp41 son parcialmente protegido por gp120, y
cambiar a un conformacin extendida despus de la retirada de este ltimo a
permitir la insercin de la FP en bro de la clula diana brana. 12-14 Despus de
la fusin de la viral yuxtapuesta y las membranas celulares, ncleo de gp41
recupera la 6- helicoidal conformacin paquete de complejo post-fusin. 15
Adems de su papel bien reconocido en la infeccin por de CD4 objetivo 1
clulas, gp41 es instrumental durante primeros pasos en diversos procesos que
conducen a la mucosa la transmisin del virus. 16-19 El virus utiliza SeV rutas
va- cruzar superficies epiteliales incluyendo cap- tura por las clulas
dendrticas de Langerhans y que prevalecen en epitelios pluriestratificado y
transcitosis que es par- ticularmente importante en epitelios simples. 20 Un
jugador clave en el proceso de transcitosis es un regin de la gp41
correspondiente a los residuos 649- 683, que incluye el MPER y parte de la CHR
y se har referencia en la presente memoria en correspondencia con Matoba et
al. 21 como "MPR". Transcitosis es ini- ado cuando el MPR se une al
glicoesfingolpido galactosil ceramida (GalCer) y el co-receptor CCR5. 18,22,23
GalCer se enriquece en el bro apical membrana de las clulas epiteliales 24 y
est implicado en la establecimiento de las balsas de lpidos, 25,26 que se
proponen para actuar como plataformas para el VIH-1 entrada, 27 transcitosis,
22 ensamblaje del virin, y en ciernes. 28 La regin mnima de la gp41 que se
puede unir GalCer es el MPR. Esta regin, junto con el dominio transmembrana
adyacente, es el ms altamente elemento conservado de la protena de la
envoltura. 3,22,29,30 El TPM es el objetivo de IgA secretora que pueden ser
que se encuentra en las secreciones mucosas de altamente expuesta,
persistente individuos tently seronegativos y puede constituir uno de los pocos
correlatos potenciales de proteccin contra el VIH-1 infeccin. 31-36 Estos
anticuerpos de la mucosa s (Abs), se mostr a poseer respuestas anti-VIH
incluyendo la neutralizacin y el bloqueo de transcyto- sis. 31,33
Significativamente, los eptopos dentro de la MPER son reconocido por tres de
los pocos ampliamente neu- tralizing monoclonal Abs (mAbs) caracteriza por lo
tanto lejos. Entre ellos se encuentran 2F5, 37 4E10, 38 y mas Recientemente
10E8. 39 Estos anticuerpos monoclonales tambin tienen otros antiActividades de VIH-1 que incluyen transcitosis-bloqueo 40 y Citotoxicidad
mediada por Fc 41 y nos llevaron a dar plena proteccin frente a la exposicin
de la mucosa cuando deliv- Ered por va intravenosa. 42-44 Estos atributos

hacen que la MPR un objetivo especialmente interesante para el desarrollo cin

de una vacuna profilctica contra el VIH-1. 19,45-49 En consecuencia, la
elucidacin de la estructura de la MPR es de inters e importancia, ya que le
dar instrucciones el diseo de vacunas de la mucosa contra el VIH-1. Liu et al.
Figura 1. Diagrama esquemtico de VIH-1 gp41. FP (Residuos 512-527): pptido
de fusin; FPPR (residuos 528-539): la fusin pptido regin proximal; NHR
(residuos 540-590): N-terminal regin de repeticin heptad; SS: un enlace
disulfuro; CHR (Residuos Regin de repeticin heptad C-terminal;: 628 a 661)
MPER (residuos 662-683): regin externa proximal de membrana; MPR (Resi
cuotas 649-683): regin proximal de membrana; TM (residuos 684-705):
dominio transmembrana; CTD (residuos 706-856): dominio citoplsmico. 2F5,
4E10, y 10E8 son eptopos para tres mAbs ampliamente neutralizantes. 1608
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han informado de que una parte de los MPER (residuos 662-683) forma una
espiral de la bobina de tres cadenas paralelas estabilizado mediante la adicin
de una isoleucina C-terminal motivo de cremallera. 12 Sin embargo, es difcil
determinar si las formas MPER la bobina en espiral de tres cadenas por s
mismo o si esto MPER es forzado en esta conformacin macin por su apego a
los tres haces de hlices con la cremallera de isoleucina, que forma un clsico
espiral de la bobina. 50 En lugar de utilizar un motivo artificial para estabilizar
MPR, queremos estudiar la estructura de MPR junto con su transmembrana
nativa dominio, que, de manera similar a la MPR, es altamente conservada. 3
Los estudios sobre la funcin de la transmembrana dominio del VIH-1 gp41 son
limitadas. El transmembrana dominio de membrana del VIH-1 gp41 juega un
papel importante en el anclaje del complejo de glicoprotena de envoltura en la
membrana viral y tambin es crucial para su biolgica funcin de cal en la
entrada de la fusin y virus. 51-54 Mao et al. recientemente obtenido una 6-A
de la membrana estructura obligado por VIH-1 glicoprotena trimer en su
Estado no escindido utilizando crio-microscopa electrnica (EM), que inclua el
dominio de transmembrana de gp41. 55 Su baja resolucin modelo estructural
pro- planteado que el dominio transmembrana de gp41 podran formar una
bobina en espiral zurdo de tres a-helicoidal, con un ngulo de cruce de
alrededor de 35 . Este es el nico estructural informacin de el transmembrana
dominio de gp41 inform hasta el momento. La estructura de MPR-TM en una
resolucin ms alta todava es necesario para la diseo basado en la estructura
de una vacuna contra el VIH-1. Hay dos cuellos de botella en la protena de
membrana determinacin de la estructura: de alto rendimiento de la
membrana pro- la produccin de protena y cristalizacin. hay dos razones
principales que explican la dificultad de pro- ducing grandes cantidades de
membrana plegada correctamente protenas en bacterias. La mayora pro
membrana eucariota protenas se insertan en la membrana en un proceso de
que combina la traduccin, orientacin, plegado y modificaciones posttraduccionales. A pesar de cierta simi- ridades y elementos homlogos, la

membrana dirigidas a las vas en las bacterias son lo suficientemente

diferentes para requerir la ingeniera de los genes eucariotas para optimimizar su expresin y acumulacin. En adicin, el rea de superficie de la
membrana limitada en Escherichia coli no slo puede limitar la cantidad total
de properly- protenas recombinantes plegadas hechas en este sistema, pero
tambin puede tener consecuencias citotxicos por com- reducir
competitivamente la produccin de acogida vitales bro protenas brana o por la
membrana afectando negativamente fisiologa. 56 Mistic es un Bacillus subtilis
integrales protena de membrana que se pliega de forma autnoma en el
membrana. Acta como una seal de focalizacin y puede ser utilizado para la
sobre-expresin de otras protenas de membrana en sus conformaciones
nativas. 56 En nuestro estudio, desarrollado una estrategia de expresin y
purificacin de MPR-TM TEV-6His fusionado al extremo C-terminal de Mistic.
Resonancia de plasmn superficial (SPR) mediciones y experimentos de ELISA
se llevaron a cabo para poner a prueba si el eptopo en el purificada MPR-TM
TEV-6His fue expuesto y podra ser reconocido por el ampliamente
neutralizantes mAb 2F5 y 4E10. El purificada MPR-TM TEV-6His Tambin se
biofsico caracterizado por exclusin de tamao cromatografa (SEC), MALDITOF MS, espec- CD espectroscopia y la dispersin de luz dinmica (DLS).
Resultados y discusin Clonacin y expresin de MPR-TM 649 hasta 705 La
membrana regin proximal (MPR) del VIH-1 gp41 es importante para el diseo
de un vacu- mucosa cine contra el VIH-1. El transmembrana (TM) dominio del
VIH-1 gp41 juega un papel esencial en anclar el complejo sobre en la bro viral
brana y tambin es crucial para su funcin biolgica en la entrada de la fusin
y virus. 51 a 53 Expresin bacteriana de estos dos dominios hidrfobos de VIH1 tiene demostrado ser difciles y experimentos anteriores en nuestros
laboratorios que hacen uso de la P8CBD expresiones sin vectorial 57 traducido
en pobreza extrema acumulacin cin adecuadamente orientada MPR-TM
(Gong, Kessans, Fromme y Mor, indito). En nuestro estudio, la porcin del VIH1 Env gen que codifica para MPR- TM se clon en el vector de expresin
pMIS2.1mv para obtener pMistic-MPR-TM TEV-6His [Higo. 2 (A)]. Este vector
dirige la expresin estrictamente regulados sin de una fusin de traduccin Cterminal entre el
Figura 2. A: Construccin del vector de expresin para pMistic-MPR-TM TEV6His . Ver texto e informacin de apoyo para detalles. B: Esquema del MisticMPR-TM TEV-6His fusin protena. C: Secuencia de aminocidos de Mistic-MPRTM TEV-6His . Prpura: His; Verde: Mistic; rojo: MPR-TM; subrayada lderes
KWA: el eptopo ncleo mAb 2F5; NWFDI subrayado: la 4E10 eptopo mAb
ncleo; sitios de reconocimiento de TEV: azul. Nota que la escisin se produjo
entre Q y G residuos de la Secuencia de reconocimiento de TEV ENLYFQG. Gong
et al. PROTENA CIENCIAS VOL 23: 1607 a 1618 1609
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B. subtilis protena integral de membrana y Mistic MPR-TM TEV-6His en E. coli
[Fig. 2 (B, C)]. Mistic era demostrado previamente para mejorar como
traslacional fusin socio de los niveles de expresin y la acumulacin de varias

protenas de la membrana en su conformacional nativo ciones. 56 Para permitir

la eliminacin de la fusin Mistic socio antes de los futuros experimentos de
cristalizacin, virus del grabado de dos tabaco (TEV) el reconocimiento de la
proteasa sitios 58 fueron introducidos por los cebadores de PCR. Uno TEV El
sitio de reconocimiento de proteasa se introdujo en el extremo N- terminal de
MPR-TM 649 hasta 705 y el otro era situado en el C-terminal [Fig. 2 (B, C)]. La
recombinacin nant plsmido pMistic-MPR-TM TEV-6His fue trans- formado en E.
coli C41 (DE3) las clulas para la expresin. La purificacin del MPR-TM
TEV26His Despus las clulas se lisaron mediante microfluidizacin, el de
Divisin dad de la protena de fusin Mistic-MPR-TM TEV-6His era encontrado en
la fraccin de membrana, y una purificacin protocolo fue desarrollado para
permitir la purificacin eficiente sin comprometer la integridad estructural de la
protena (Fig. 3). Tras una amplia proyeccin de variabilidad detergentes OU
(datos no presentados), bDDM al 1% era utilizado para extraer la protena de
fusin de la membrana. El extracto bDDM fue sometido a TALON metales
cromatografa de afinidad para separar etiquetado-His Mistic- MPR-TM TEV-6His
de otras protenas. 59,60 El segundo fraccin de elucin contena la mayor
parte de Su-etiquetados protenas, que mostr un patrn complejo de bandas
sobre SDS-PAGE fraccionamiento (Fig. 4). La parte superior banda (marcada
con flechas azules) correspondi a la protena de fusin Mistic-MPR-TM TEV-6His
, Con un molecu- lar masa de 31 kDa, en buena concordancia con su caltamao esperado culado. Cuatro bandas de contaminantes fueron visible. La
segunda banda de la parte superior de la plata manchado SDS-PAGE en la
Figura 4 corresponde a una Su-etiquetados fragmento de Mistic y MPR-TM TEV6His como podra ser detectado en las inmunotransferencias por el MPR- mAb
2F5 especfica (Fig. 4). En contraste, los tres ms baja bandas, claramente
visible en los geles teidos con plata, hizo no reaccionar con el 2F5 Ab (Fig. 4) y
podra ser His- fragmentos etiquetados de Mistic sin TPM o no relacionada E.
coli protenas. Hemos observado que la degradacin era una problema comn
para las construcciones de fusin Mistic (datos no mostrado). El siguiente paso
en nuestro esquema de purificacin (Fig. 3) fue la escisin especfica de la
protena de fusin guiente guido por cromatografa de intercambio aninico
para separar calificar el MPR-TM TEV-6His protenas de su Mistic pareja de
fusin. Los eluatos de la columna TALON eran dializada para eliminar el
imidazol y la concentracin inica condiciones del tampn se ajustaron para
garantizar eficiente la escisin por la proteasa TEV. Esperbamos que el
totalmente protena MPR-TM procesadas para tener un molecular peso de 7,8
kDa, si tanto el N-terminal y C- se escindieron sitios de reconocimiento de TEV
terminales. Cmo- nunca, amplia la digestin por la proteasa TEV produjo un
banda de protena (indicado por las flechas rojas en la Fig. 4) con una masa
molecular aparente mayor que 10 kDa que reaccin cruzada con el mAb 2F5
MPR-especfico. Por otra parte, someter los productos de escisin a una second etapa de purificacin TALON demostr que este > 10 kDa protena de
escisin retuvo una His- funcional etiqueta que permiti su eficiente unin a la
columna y requiere alta concentracin de imidazol (250 mM) para la elucin
(datos no mostrados). Nuestros resultados por lo tanto son compatibles con la
falta de TEV escisin edad en su sitio C-terminal de la protena. El final Por lo

tanto, el producto consiste en el MPR-TM con su C-terminal-Su etiqueta todava

unido (llamado en adelante "MPR-TM TEV-6His "). La masa molecular esperada
de este polipptido fue 11,9 kDa. La falta de escisin en el sitio de
reconocimiento TEV C-terminal podra ser Figura 3. MPR-TM TEV-6His esquema
de purificacin.
Figura 4. Purificacin de Mistic-MPR-TM TEV-6His por el metal cromatografa de
afinidad y su escisin por la proteasa TEV. Las fracciones fueron resueltas por
SDS-PAGE y se visualizaron por sil- tincin ver (izquierda) o
inmunotransferencia con el mAb 2F5 (derecha). Flechas azules: Mistic-MPR-TM
TEV-6His . Flechas rojas: escindidos MPR-TM TEV-6His. 1610
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explicado por su proximidad al dominio TM, que es probable que sea
totalmente incrustado en la micela detergente, por consiguiente, las cabezas
de azcar hidrfilas de la bDDM molculas pueden oscurecer el sitio de corte
de TEV o de lo contrario puede impedir proteoltica de la enzima actividad.
Retencin de la C-terminal de Sus-tags en la MPR-TM TEV-6His protena
interfiri con nuestra originales planificar para separarlo de los dems
productos de escisin que contiene la protena Mistic por el segundo TALON
metal afinidad etapa de cromatografa. En su lugar, volvi a cromatografa de
exclusin por tamao (SEC) y experimentado con dos tipos de columnas a la
SEC, Superdex 75 10/300 GL y Superdex 200 10/300 GL, para separar MPR-TM
TEV-6His de 8His Mistic 6His y otros productos de degradacin, pero MPR-TM
TEV- 6His no poda ser purificado por cualquiera de los dos colaboracin UMNS
(datos no mostrados). Finalmente, Mono Q de intercambio aninico
chromatogra- phy se utiliz para purificar adicionalmente el MPR-TM TEV-6His
protena. Las condiciones ptimas para Mono Q anin cromatografa de
intercambio fueron elegidos en base a varias pruebas a pequea escala
anteriores. MPR-TM TEV-6His eluy como el pico de elucin principal [A9 en la
figura. 5 (A)] mientras 8His Mistic 6His y otras protenas de degradacin
estaban en el flujo a travs [A1 en la Fig. 5 (A)] y una pico de hombro [A 10 y
A11 en la Fig. 5 (A)] de la pico principal de elucin. La elucin de protenas fue
moni- reada a 280 nm y las fracciones se analizaron por SDS-PAGE [Fig. 5 (B)].
La banda marcada por el rojo puntas de flecha corresponde a MPR-TM TEV-6His
mientras la banda sealada por puntas de flecha verde pondiente ponde a la
escindido 8His Mistic 6His . Fraccin A9 era sobrecargado por lo que era muy
difcil determinar si la banda era fuerte MPR-TM TEV-6His nica o la mezcla de
8His Mistic 6His y MPR-TM TEV-6His . Fraccin la A9 se diluy 10 veces y volvi
a analizar por SDS-PAGE [Fig. 5 (C)]. El resultado se muestra en la figura 5 (C)
confirma que la fraccin A9 slo contiene MPR- TM TEV-6His . Las
preparaciones de protenas correspondientes a la fraccin A9 se utilizaron para
el anlisis futuro. La presencia de la cola C-terminal no escindido que contiene
el sitio de reconocimiento de TEV C-terminal, una attR2 sitio y un 6His etiqueta
[Fig. 2 (C)] puede elevar el preocupacin de que podra afectar el futuro

cristalizacin de MPR-TM TEV-6His . Sin embargo, esto parece poco probable, ya

el banco de datos de protenas (PDB) contiene varios ejem- pios de estructuras
de alta resolucin contengan una dominio de la protena artificial que incluye
un 1,55 Un cristal estructura del dominio de la tiorredoxina humana protena
tiorredoxina como 2 (PDB: 2WZ9). Purificada MPR-TM TEV26His se pliega y
estable Dicrosmo circular (CD) espectroscopa se utiliz para estimar el
contenido estructural secundaria de MPR- TM TEV-6His . El CD espectros de
MPR-TM TEV-6His dis- desempeado una banda positiva a 195 nm y dos
negativos bandas tivos a 208 nm y 222 nm (Fig. 6), que es caracterstica de las
protenas a-helicoidales. 61 Anlisis de los datos con CONTINLL en el paquete
de software CDPro 62 producido una estimacin de 52,2% a hlices, 6,3% b
sbanas, 14.9% vueltas, y 26,5% bobinas al azar y la desviacin cuadrada raz
media (RMSD) valor fue 0.055. Estimacin con CONTINLL fue similar a la
prediccin de estructura secundaria con el servidor APSSP2, 63 que predijeron
59.6% hlices. El 2-A estructura cristalina de la gp41 528 a 683 indicado que el
MPR (residuos 649-683) podra formar un a- hlice. 13 Como se inform por
Mao et al., 55 el 6-A crio-ME
Figura 5. La separacin de Mistic-MPR-TM TEV-6His escote productos por
cromatografa de intercambio aninico Mono Q. (LA) El cromatograma (b) las
fracciones fueron resueltas por SDS-PAGE y se visualizaron por tincin con
plata. Puntas de flechas rojas: MPR- TM TEV-6His ; puntas de flecha verde: 8His
Mistic 6His . (C) SDS-PAGE anlisis de 10 veces la fraccin diluida A9 (DA9). L,
escalera
. Figura 6. espectrometra de CD purificada demostr que MPR- TM TEV-6His era
un-helicoidal. Con una banda positiva a 195 nm y dos bandas negativas en 208
nm y 222 nm, el CD espectros de la protena eran las tpicas de protenas ahelicoidales. Gong et al. PROTENA CIENCIAS VOL 23: 1607 a 1618 1611
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estructura de la escindida del VIH-1 sobre de glucoprotena tein trmero sugiere
que la transmembrana dominio (residuos 684-705) de gp41 puede ser un ahlice como se asume generalmente (pero ver Steckbeck et al. para una visin
diferente 64 ). Tenga en cuenta que la Env estructura propuesto por Mao et al.
55 difiere de otras estructuras recientes basados en cristalogrfica y estudios
de EM, y algunos aspectos de ese modelo siendo controvertido. 14,65,66 En
particular, el orga- nizacin de los elementos de la estructura secundaria de la
gp41 ectodominio de la estructura propuesta por Mao et al. 55 es
dramticamente diferente de la de los seis a-hlice manojos visto en forma
posterior a la fusin. Especficamente, de acuerdo a Mao et al., 55 la NHR y
CHR dominios se dividen en ocho cortos a-hlices en golpeando la oposicin a
los seis paquete helicoidal. En cualquier evento, los espectros de CD indican
que MPR-TM TEV-6His se pliega despus de la purificacin. Utilizamos
dispersin dinmica de luz (DLS) para fur- Ther demuestran que E. MPR- coli
purificado derivado de TM TEV-6His de forma estable y est plegada como
monodisperso estos son los factores crticos que afectan a la cristalizacin. 67
DLS es una tcnica que es muy sensible para la deteccin de agregados.

Nuestro anlisis demuestra DLS trado que purificada MPR-TM TEV-6His fue
monodis- perse, con polidispersidad de la protena-detergente estimado
complejo ser slo 12,3% (Fig. 7 y la Cena portar Informacin Tabla 1). Por otra
parte, tenemos DLS usados para monitorear la estabilidad de MPR- purificada
TM TEV-6His protena a 4 C en el tiempo. Nuestro resultado muestra que MPRTM TEV-6His permanece monodispersa durante al menos 10 das en 4 C (Fig. 7
insercin, apoyo Informacin Fig. 1). Los resultados indican que DLS MPR-TM
TEV-6His es un candidato monodispersa y estable fecha para la cristalizacin.
Masa molecular del MPR-TM TEV26His Y es Estado oligomrica Se utiliz MALDITOF MS para determinar la exacta masa molecular de MPR-TM TEV-6His y la
resultante espectro ing revel un pico de protena de 11,8746 4 Da (Fig. 8).
Este acept muy bien con el terico peso molecular cal del MPR-TM TEV-6His ,
que era prev que sea 11.872 Da basado en la secuencia (Fig. 2) y el anlisis
SDS-PAGE (Fig. 4). los pico de hombro a 12.138 Da podra ser asignado a la
complejo de MPR-TM TEV-6His y la matriz de sinapnico cido cuyo peso
molecular era 224 Da. Los resultados confirman la MS predicho molecular masa
del MPR-TM TEV-6His . Las protenas son dena- rado por MALDI usando cido
sinapnico y qu no proporcionar informacin acerca de la informacin
oligomrica cin. Era, por lo tanto, de inters para comprobar el oligo- Estado
merizacin de la protena purificada. Nuestros DLS resultados mostraron que el
radio de Stokes de la complejo protena-detergente era 4,68 nm, que correctarespondido a una masa molecular de 124 kDa (SUP- portar Informacin Tabla
1). Esto indica que MPR-TM TEV-6His polipptidos forman una composicin ms
grande plex que consta de varias subunidades monomricas. Sin embargo, el
estado oligomrico del complejo es di- cil de determinar, tal como existe en la
forma de una complejo de protena-detergente. Hemos utilizado SEC analtica
para verificar la cali- estructura ternaria de purificado MPR-TM TEV-6His y para
proporcionar una estimacin adicional en cuanto a su molecular masa y su
estado oligomrica en su con detergente estado solubilizado (Fig. 9). El
cromatograma SEC puesto de manifiesto un solo pico simtrico que eluy a
13,70 ml [Fig. 9 (A)]. El peso molecular de este pico fue de 123 kDa, estimado a
partir de la stand- curva ard [Fig. 9 (B)]. Este tamao corresponde a la MPR-TM
TEV-6His oligmero incrustado en un bDDM micela y era muy similar al peso
molecular la estimacin obtenida por DLS (124 kDa, Apoyando Informacin
Tabla 1 y Fig. 7).
Figura 7. DLS demostraron que purificada MPR-TM TEV-6His fue altamente
monodisperso. Muestra contena MPR-TM TEV-6His (0,22 mg / ml) en 100 m M
de NaF, 20 m M NaH 2 Correos 4 , PH 7,5, 0,02% bDDM. Insertar: el purificada
MPR-TM TEV-6His se almacen en 4 C y medido por DLS en los das 1, 2, 3, 4, 7,
y 10, respectivamente. La polidispersidad se mantuvo por debajo del 25% (por
favor consulte la informacin de apoyo Tabla 2 y Apoyo macin macin Figura 1
para ms detalles), que indic que purificada MPR-TM TEV-6His se
monodispersas durante al menos 10 das en 4 C.
Figura 8. MALDI-TOF espectros de MPR-TM TEV-6His estaban en perfecto
acuerdo con la masa molecular calculada de la protena a 11.872 Da. 1612

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La excelente correspondencia de los DLS y Datos de la SEC apoyaron nuestro
objetivo de utilizar la informacin macin para evaluar la estructura
oligomrica de MPR- TM TEV-6His .El Peso molecular medio de "vaco" micelas
bDDM medidos por DLS fue de 68 kDa (datos no mostrada). Sin embargo, la
cscara de detergente en un complejo de protena-detergente es a menudo
mayor que la micela vaco porque el detergente debe cubrir todo la superficie
hidrfoba de la protena. Por Consiguiente, la estimacin del estado oligomrico
de la protena dentro de la micela es complicado. Es probable que la presencia
de protenas incrustadas podra cambiar la tamao esperado de la micela.
Otras estimaciones publi- cado en el pasado indic que el detergente a la
protena valores de relacin van desde 2.4 a 3,5 (g / g). 68,69 Un trmero
incrustado en micelas bDDM por lo tanto podra mostrar una masa molecular
aparente en el intervalo de 121 hasta 160 kDa. En cualquier caso, los valores
para un dmero (81-107 kDa) sera menor que el valor observado. Mientras la
composicin definitiva de la subunidad MPR- TM TEV-6His es difcil de resolver
en esta etapa, es evidente que la protena es oligomrica, una importante
atributo de estructura-funcin de la gp41 nativa molcula. Purificada MPR-TM
TEV26His es reconocida por el ampliamente neutralizantes mAb 2F5 y 4E10 Un
atributo estructura-funcin importante de gp41 es su capacidad para unirse a
ampliamente neutralizantes mAbs. Ello era, por tanto, de gran importancia
para poner a prueba si el versin deconstruida de la subunidad transmembrana
de la protena de la envoltura podra ser reconocido por el ampliamente
neutralizantes mAb 2F5 y 4E10. El 2F5 y 4E10 mAbs interactan con una muy
conservadas secuencia de MPER. Esta parte es "oculto" dentro de un hlice
paquete apretado en la mayora de los modelos estructurales reportado MPER.
12,13 Slo una estructura cuenta ha resuelto que contiene un NHR acortada
(HR1) regin, que dej MPER accesible a 2F5 Abs. 14 Nosotros ELISA usado
para determinar si el 2F5 Ab fue capaz de unirse a purificada MPR-TM TEV-6His
en su desnaturalizado estado (Fig. 10). Los resultados [Fig 10 (A), las filas C y
D] indican claramente que la TPM-TM TEV-6His protena est hecho reconocido
por los Abs 2F5. Como era de esperar, una control positivo que consiste en una
protena de fusin de la clera subunidad B de la toxina con MPR tambin
reaccion con los Abs 2F5 [CTB-MPR, Fig. 10 (A), filas E y F]. CTB-MPR ya ha
sido demostrado para reaccionar con 2F5 Abs 48 y fue capaz de provocar Abs
que podra bloquear la progresin del VIH transcitosis a travs de la modelos
epitelios apretados. 48 En CTB-MPR, la pentame- naturaleza ric de CTB se cree
que obstaculizan MPR de asumiendo el trimrica conformacin posterior a la
fusin que no permite el acceso del anticuerpo a la 2F5- sitio de unin. 70
Afirmar los resultados de ELISA y cuantitativa tivamente evaluar la afinidad de
MPR-TM TEV-6His al de dos ampliamente neutralizantes Abs 2F5 y 4E10, que
empleadas mediciones SPR [fig. 10 (B, C) y Tabla I]. Los resultados demuestran
una afinidad muy elevada (nanomolar y gama subnanomolar) del MPR en el
contexto de su dominio transmembrana [MPR- TM TEV-6His , Higo. 10 (B)] y

como una protena de fusin con CTB [Fig. 10 (C)], en buen acuerdo con
nuestra ante- resultados publicados ormente relativas CTB-MPR. 47 los
calculado constante de disociacin (K D ) De 2F5 desde MPR-TM TEV-6His y
CTB-MPR fue de 2,2 6 0,2 nM y 0,8 60,2 nM, respectivamente. La disocalculada ciacin constante (K D ) De 4E10 de MPR-TM TEV-6His y CTB-MPR era
2,1 60,0 nM y 0,5 nM 6 0.2, respectivamente. Como control negativo, hemos
probado CTB por s mismo, que no mostraron apreciable unin a ya sea 2F5 o
4E10 (datos no mostrados). Los resultados de ELISA y SPR indicaron que la 2F5
y 4E10 eptopos en MPR-TM TEV-6His fueron expuesta y accesible para un
fuerte 2F5 y 4E10 Unin. Estos resultados estn en excelente acuerdo con los
experimentos de otros grupos destinados a
Figura 9. Estimacin de la masa molecular del nativa purificada MPR-TM TEV6His . R: SEC de MPR-TM TEV-6His revel una sola pico simtrico eluy a 13,7
ml correspondiente a 123 kDa basado en la curva estndar. B: La curva
estndar de Super- dex 200 10/300 GL columna usando las siguientes protenas
estndar: aprotinina (6,5 kDa), RNasa A (13,7 kDa), anhidrasa carbnica (29
kDa), ovoalbmina (43 kDa), conalbmina (75 kDa), aldolasa (158 kDa) y la
ferritina (440 kDa). Kav es el coeficiente de particin, que se puede calcular de
la siguiente manera: (volumen de elucin - volumen vaco) / (volumen total volumen vaco). Gong et al. PROTENA CIENCIAS VOL 23: 1607 a 1618 1,613
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recreando una fusin temprana intermedia en la que la eptopos de 2F5 y 4E10
estn expuestos a permitir inter- acciones con los dos mAbs neutralizantes (por
ejemplo, ver Refs. 71-75). Por ejemplo, Frey et al. 75 creado una prehairpin que
consiste intermedia de una trimerizacin etiqueta fusionado a la MPER, y para
el NHR intercala entre un CHR duplicado. La NHR era rato de tualmente
impedido enmascarar el MPER, por lo tanto permitiendo a sus interacciones con
2F5. Ms recientemente, Lutje Hulsik et al. 74 han utilizado una concentracin
an ms simple struct que contena el dominio TM de la gp41, la MPER y de la
Comisin de Derechos Humanos para demostrar semejante alta afinidades con
varios mAbs neutralizantes. Nuestra con- struct no contiene artificial
trimerizacin parcial de fusin ners, y contiene slo el medio C-terminal de la
CDH. En contraste, tanto Frey et al. y Lutje-Hulsik et al., 74,75 as como otros,
demostrado que gp41 en su conformacin prefusin (presente en los viriones,
por ejemplo, ver Ref. 76) no puede interactuar con 2F5 o 4E10 antes de las
interacciones de Env con la recepcin CD4 tor. 76,77 Del mismo modo, una
conformacin previa despus de la fusin 2F5 y 4E10 incluye vinculante. 74,75
Por ejemplo, Liu et al. 12 inform una estructura hlice paquete apretado para
MPER. En su estudio, MPER de gp41 se fusion a una motivo de cremallera de
isoleucina trimrica C-terminal y formado una bobina en espiral de tres
cadenas paralelas. Los eptopos 2F5 fueron enterrados dentro de la interfaz
entre el MPER hlices y no podan ser reconocidos por 2F5. 12 Nuestros
resultados proporcionan evidencia experimental adicional de la importancia del
dominio transmembrana de gp41 a preservar la firma inmunolgica del bro
regin proximal brana de gp41, 54 probablemente imitando un prehairpin

intermedio. Tambin demuestra la tiene que quitar las regiones de repeticin

heptad. En resumen, se describe aqu el diseo, expresin y purificacin de una
construccin de protena que incluye MPR y el dominio transmembrana de
gp41 (MPR-TM TEV-6His ), Que reacciona con el ampliamente neutralizantes
Abs 2F5 y 4E10 y por lo tanto puede representar una conformacin
inmunolgicamente relevante macin imitando un prehairpin intermedio de
gp41. La cantidad y calidad de MPR- purificada TM TEV-6His inform aqu que la
protena adecuada para los experimentos de cristalizacin y estudios de RMN
como un requisito previo para estudios estructurales, lo que puede orientar el
diseo basado en la estructura de las vacunas contra la VIH-1 en el futuro.
Materiales y METODOS Clonacin, cepas bacterianas, y el crecimiento
condiciones El MPR-TM 649 hasta 705 constructo se basado en una
deconstruccin truido VIH-1 gp41 (dgp41) gen (GenBank adhesin nmero sin
JX534518), 78 una quimera que comprende el gp41 MPR deriva de la cepa MN
B-clado (Nmero de acceso GenBank AF075722) y el dominio transmembrana y
la regin cola citoplasmtica del C 1084i clado aislado (GenBank adhesin
nmero AY805330). Una descripcin ms detallada posible se encuentra en la
lnea Material complementario seccin cin (SMS). Brevemente, virus del
grabado del tabaco de dos (TEV) se aadieron sitios de reconocimiento de la
proteasa para flanquear al secuencia de codificacin de MPR-TM 649 hasta 705
y el constructo
Figura 10. purificada nativa MPR-TM TEV-6His se puede unir a 2F5 y 4E10
anticuerpos monoclonales. A: La imagen de la placa de ELISA desarrollado. Fila
A: los pocillos de control sin recubrimiento. Filas BD: pocillos recubiertos con
diluido en serie MPR-TM TEV-6His . Filas E, F y H: pozos recubierto con diluido
en serie-CTB-MPR. Fila G: pozos cubiertos con diluido en serie-CTB. Todas las
filas excepto B y H fueron sobre- establecido con el mAb 2F5. (B, C) anlisis de
SPR. Asociacin / display rastros sociacin de MPR-TM TEV-6His (B) y CTB-MPR
(C) ya sea con 2F5 o 4E10 mAbs. Las huellas son promedio de cuatro
mediciones independientes y las constantes de disociacin (K D ) Se enumeran
en los insertos (media 6 SD). 1614 PROTEINSCIENCE.ORG Proximal a la
membrana Spanning Dominios de VIH-1 gp41
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se introdujo en un pCR8 puerta de enlace de entrada vector / GW / TOPO
(Invitrogen). El constructo fue entonces fusionado a la protena de B. subtilis
por recombinacin Mistic cin en el destino vector de puerta de enlace pMistic
(DNASU: pMIS2.1mv), que fue una especie de regalo del doctor Marcos Vega,
Salk Institute. Para la expresin, la plsmido recombinante pMistic-MPR-TM 649
hasta 705 era transformado en E. coli C41 (DE3). Cultivo de clulas condiciones
de crecimiento y induccin protena recombinante cin se describen en el SMS.
La purificacin del MPR-TM TEV26His El protocolo de purificacin se describe en
detalle en el SMS y ser solamente esboz aqu. Las clulas recogidas se
lisaron con un microfluidizador (Microfluidics). Protenas solubles en agua se
separaron de bro protenas branas (y otro material insoluble en agua) por
centrifugacin y se desech. El Mistic-MPR- TM TEV-6His protena de fusin se

extrajo mediante resucitacin pendiente el sedimento en tampn de extraccin

enfriado con hielo (PBS, 1% bDDM y cctel inhibidor de la proteasa) y incubacin con agitacin suave durante 3 horas a 4 C. Siguiendo la centrifugacin,
el sobrenadante se recogi y se la protena se purific por afinidad de metal
TALON cromatografa (Clontech Laboratories, vea SMS detalles). El eluido se
dializa (2000 Da de corte tubo de dilisis, Sigma) durante la noche a 4 C contra
NaCl 20 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5. Despus de la dilisis, Tris-HCl pH 8,0, se
aadieron EDTA y DTT a la protena dializada (concentraciones finales: 50 mM,
0,5 mM, y 1 mM, respectivamente). La preparacin de protenas racin se
digiri proteolticamente con TEV prote- ase (Invitrogen, proteasa: relacin de
sustrato de 20 U / 182 lg, 2 h a temperatura ambiente), resultando en> 95% la
escisin de Mistic-MPR-TM TEV-6His . El escindido MPR-TM TEV-6His preparacin
de protenas cin se purific adicionalmente por intercambio de aniones cromatografa utilizando una AKTApurifier 10 (GE Healthcare) y una columna Mono
Q 5/50 GL (ver SMS para ms detalles). Las fracciones que contenan troceados
MPR-TM TEV-6His fueron agrupados juntos por ms bioqumicos y biofsicos
anlisis de cal. Cromatografa de exclusin por tamao El purificada MPR-TM
TEV-6His preparativos fueron caracterizado por SEC usando una AKTApurifier
10 (GE Salud) y un Superdex 200 10/300 GL columna (24 ml de volumen de
lecho, GE Healthcare). El CD fase mvil compatible con la espectroscopia fue
de 100 mM NaF, 20 mM NaH 2 Correos 4 , PH 7,5, 0,02% bDDM como predescrito viamente 47 y como se detalla en el SMS. Determinacin de protenas,
SDS-PAGE, immunoblot- ting, y ELISA La determinacin de protenas en
preparacin crudo y enriquecido raciones se llev a cabo por el Lowry
modificado ensayo. 79 La concentracin de protena de las preparaciones puras
de MPR-TM TEV-6His se determin midiendo LA 280 (e 5 32 290 cm 21 M 21 ,
Obtenida usando Pptido Propiedad Calculadora en h ttp:
//www.basic.northwest- ern.edu/biotools/proteincalc.html).Las protenas fueron
separadas por SDS-PAGE 80 y fueron sometidos a tincin con plata 81 o para
immunoblot- ting (ver SMS para ms detalles). 78 Los autores agradecen a la
NIH AIDS Research and Reference Reactivo Pro- gram (Divisiones de SIDA,
NIAID, NIH) para la donacin del mAb 2F5 (nmero de catlogo 1475) y 4E10
(nmero de catlogo 10091). Quimioluminiscencia fue detectado mediante el C
Imaging Sys- BioSpectrum 500 tem (Ultra-Violet Products Ltd). ELISA fue performada esencialmente como se describe anteriormente 47 y como se detalla
en el SMS. MALDI-TOF MS, espectroscopia de CD y DLS Se utiliz MALDI-TOF MS
(Applied Biosystems) para medir con precisin el peso molecular de la puricado MPR-TM TEV-6His protena como se detalla en el SMS. A
espectropolarmetro JASCO J-CD 710 era utilizado para medir los espectros de
CD de muestreo purificada ple y el procedimiento, se detalla en el SMS, era
esencialmente segn Greenfield. 61 Anlisis de los datos se ha realizado
mediante el programa CONTINLL en Paquete de software CDPro comparando la
medida datos con la opcin Ajuste de referencia 10, que incluy 13 protenas
de la membrana junto con 43 protenas solubles. 62 DynaPro NANOSTAR
M3300 de Wyatt Tecno- ga se utiliz para llevar a cabo mediciones DLS en el
mismo tampn utilizado para la espectroscopia de CD (ver el SMS para
detalles). Resonancia de plasmn superficial (SPR) Todos los experimentos se

realizaron en un K X 5 Superficie Plasmon resonancia Imaging System (SPRI)

(Plex- era). El procedimiento KX5 SPRI fue anteriormente descrito 82 y se
detalla en el SMS. Preparacin de los chips personalizados SPRI se describe en
el SMS. Nosotros chips de oro utilizado recubiertas con Pro- unido
covalentemente protena A / G que permite la inmovilizacin de la Abs prueba
a travs de su regin Fc, asegurando sin impedimentos
Tabla I. Asociacin y disociacin constantes de velocidad derivados del anlisis
SPR Ligando inmovilizado Analito que fluye k la , Sra 21 k d , S 21 K D , M 2F5
MPR-TM 4,7 6 0,3 E4 9,9 6 0,1 E-5 2,2 6 0,2 E-9 4E10 MPR-TM 2,3 6 0,1 E4 5,0 6
0,4 E-5 2,1 6 0,0 E-9 2F5 CTB-MPR 5,5 6 0,7 E4 4,2 6 1,0 E-5 0,8 6 0,2 E-9 4E10
CTB-MPR 4,7 6 0,3 E4 2,5 6 1,3 E-5 0,5 6 0,2 E-9 Gong et al. PROTENA
CIENCIAS VOL 23: 1607 a 1618 1615
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interacciones con antgenos. Para evitar inespecfica adsorcin, el chip se
bloque con BSA (5 mg / ml) antes de su posterior anlisis. El tampn de
desarrollo y tampn de dilucin del analito fue 1xPBS que contiene 0,02%
bDDM. En carreras secuenciales, CTB (lo negativo control) a 850 nm, CTB-TPM
en 600 nM y MPR- TM TEV-6His a 840 nM fueron pasado sobre el ligando
superficie a una velocidad de flujo de 1 LL / s, con un 300-s asociacin cin y
un s 600 disociacin. El chip fue regeneracin ado entre ejecuciones con H 3
Correos 4 (1: 200 de 85% w / w) durante 100 s, seguido de repintado con el
anti deseada cuerpo. Inyecciones idnticas ms de protenas en blanco A / G
superficies se restaron de los datos de cintica anlisis. SPRI datos que constan
de imgenes de vdeo en 1-s resolucin se analizaron con el Mdulo de Anlisis
de Datos software de Plexera. La curva de unin era analgica lisaron y
equipado con 1: 1 modelo de interaccin con Software 2 Scrubber (Biologic
Software