FACULTAD DE MEDICINA
Presenta:
Asesor:
ndice
ndice ............................................................................................................................................... i
Abreviaturas ................................................................................................................................. iii
1. Introduccin ............................................................................................................................... 1
1.1 Generalidades ......................................................................................................................... 1
1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas....................................................... 2
1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas.La vacuola ltica y el retculo
endoplsmico................................................................................................................... 3
1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico....................................... 5
1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales................................................. 8
1.2 Antecedentes ........................................................................................................................ 13
1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. ........................................................................ 13
1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. ..................... 15
1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico .................................................. 28
2. Objetivos del proyecto............................................................................................................. 32
2.1 Hiptesis............................................................................................................................... 32
2.2 Objetivos .............................................................................................................................. 32
3. Metodologa.............................................................................................................................. 34
3.1 Preparaciones ....................................................................................................................... 34
3.1.1 Objeto de estudio. .......................................................................................................... 34
3.1.2 Obtencin de vacuolas. Soluciones de trabajo............................................................... 34
3.1.3 Obtencin de fraccin microsomal enriquecida de RE ................................................. 36
3.1.4 Obtencin de liposomas gigantes. Tcnica de deshidratacin-rehidratacin. ............... 36
3.2 Registros electrofisiolgicos ................................................................................................ 37
Patch Clamp............................................................................................................................ 37
3.2.1 Generalidades................................................................................................................. 37
3.2.2 Fabricacin de micropipetas .......................................................................................... 38
3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa,
parche aislado. .............................................................................................................. 38
3.2.4 Medicin del potencial a travs de la membrana vacuolar............................................ 38
3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin de relacin
corriente-voltaje del canal unitario................................................................................ 40
i
ii
Abreviaturas
iii
1. Introduccin
1.1 Generalidades
A diferencia de otros seres vivos, las plantas no tienen la capacidad de escoger el entorno
en el que ocurre su crecimiento y desarrollo. Por esta razn, los organismos vegetales requieren
de mecanismos especficos, destinados a asegurar el funcionamiento normal de sus clulas en el
rango de condiciones que se puedan presentar en su medio ambiente. Entre los factores con
mayor variabilidad para las plantas se encuentra el suministro mineral procedente del suelo. En
base a las concentraciones de nutrientes disponibles en el suelo y las necesidades de las plantas,
stos pueden encontrarse en deficiencia o en exceso, obligando a las plantas a poner en
funcionamiento los mecanismos correspondientes para el mantenimiento de la homeostasis inica
celular. El mecanismo que tiene la mayor distribucin en el reino vegetal es el almacenamiento o
acumulacin, utilizado por las plantas tanto para la prevencin de deficiencias, como para la
eliminacin de excesos de nutrientes en el citoplasma y el aislamiento de metabolitos y
substancias txicas.
El calcio es uno de los elementos esenciales para la vida, que, sin embargo, se encuentra en su
mayor parte almacenado en organelas especiales o en el exterior de la clula el apoplasto, y se
encuentra en mnimas y rigurosamente mantenidas concentraciones (alrededor de 100-200 nM en
condiciones de reposo) en el citoplasma. Su alto grado de compartimentacin es una necesidad
para evitar su precipitacin en el citoplasma con el fosfato inorgnico (Sanders y col., 1999), y la
competencia por los sitios de unin con el Mg2+ citoslico (Marschner, 1995). La gran diferencia
de concentraciones entre el citoplasma, por una parte, y el apoplasto y los compartimentos
intracelulares, por la otra, probablemente son la razn del uso de las seales de Ca2+ como
vnculo entre los estmulos extracelulares y las respuestas intracelulares1. Actualmente, esta ruta
de sealizacin se encuentra en tal grado de desarrollo que permite con tan solo un evento la
elevacin del calcio citoplsmico generar respuestas opuestas, como, por ejemplo, el cierre o
1
Maathuis F. Ligand-gated ion channels. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing,
CRC Press, 2004, p. 199.
1
1993; White, 2001), en los cuales principalmente ocurre su movimiento, siguiendo el flujo de
agua causado por la transpiracin (Epstein y Bloom, 2005). Por otra parte, en las races de cebolla
(Allium cepa) existen evidencias de que el transporte de calcio a la xilema puede ocurrir a travs
del simplasto (Cholewa y Peterson, 2004). Se considera que en esta ruta los iones de calcio entran
al simplasto a travs de canales permeables a calcio de la membrana plasmtica, siendo
bombeados despus a los tejidos de conduccin por las Ca2+-ATPasas y los intercambiadores
H+/Ca2+ (White y Broadley, 2003) los transportadores de Ca2+ ms importantes de las clulas
vegetales.
En las clulas vegetales la vacuola central o ltica es el mayor depsito (ms del 80% del
volumen de la clula) de calcio intracelular. A pesar de esto, existe solo un reporte ampliamente
conocido de la actividad del Ca2+ en vacuolas de las plantas superiores Riccia fluitans (en
rizoides) y Zea mays (en races) 2.3 y 1.5 mM, respectivamente (Felle, 1988).
Sorprendentemente, estos datos insuficientes han sido puestos en base de la opinin de un alto
nivel de calcio libre, existente en las vacuolas, y son utilizados en modelos de transporte a travs
de la membrana vacuolar, aunque estudios de tan solo calcio total demuestran una localizacin
asimtrica de este catin en las hojas con patrones distintos para diferentes tejidos (Fricke y col.,
1995; aparte Karley y col., 2000). Incluso as, ha sido mostrado que la concentracin de calcio
en los tejidos se encuentra en funcin del calcio presente en el suelo (Dietz y col., 1992) y
depende de la estacin del ao, sufriendo cambios en vacuolas de tejidos dedicadas al
almacenamiento en poca de invierno (Stelzer y col., 1990, 1993) y manipulndose de diferentes
3
formas en hojas deciduas e invernales (en Larix decidua es acumulado en vacuolas del
endodermo y desechado durante el deshoje; en la planta de hojas perenes Picea abies el Ca2+ es
almacenado hasta la primavera en las vacuolas y en el apoplasto del mesfilo; Gierth y col.,
1998; Stelzer y col., 1990).
Se considera, que la mayor parte del Ca2+ vacuolar se encuentra ligado por aniones orgnicos
(oxalato, citrato, isocitrato, malato) formando, en muchos casos, complejos de baja solubilidad
precipitados en forma de cristales (principalmente de oxalato de calcio). Las funciones
primarias de estos complejos son la regulacin de alta capacidad del calcio vacuolar (tanto
almacenamiento de Ca2+, como la precipitacin de sus excedentes en una forma osmtica- y
fisiolgicamente inerte), la defensa contra herbvoros, as como la detoxificacin de Al3+ y
metales pesados (ver Franceschi y Nakata, 2005 para una revisin reciente). En las plantas
conocidas como precipitadoras de oxalato (a las que pertenece el betabel (White y Broadley,
2003) el objeto de estudio del presente trabajo) en los tejidos en crecimiento se encuentran
clulas especializadas idioblastos que precipitan en sus vacuolas en forma de oxalato el
calcio del apoplasto impidiendo as que ste interfiera con el crecimiento de las clulas
inmaduras, que, debido a su pobre vacuolacin, tienen una capacidad reducida para secuestrar el
calcio (Franceschi y Nakata, 2005). Es interesante, que los idioblastos poseen una densa red de
retculo endoplsmico, cuya principal tarea, por lo visto, es el rpido secuestro del calcio entrante
al citoplasma y su transportacin a la vacuola central para su precipitacin (Kostman y col., 2003;
Franceschi y Nakata, 2005). Estos datos pueden revelar las funciones de los dos mayores
depsitos de calcio celulares: el retculo endoplsmico (como secuestrador de Ca2+) y la vacuola
central (como su almacn), en el mantenimiento de la homeostasis de calcio en la clula vegetal,
discutidos ms adelante (ver. p.1.1.3)
presencia de calreticulina protena de gran capacidad para secuestrar el calcio con baja
afinidad, la funcin de la cual es mantener un alto nivel de Ca2+ en el lumen del RE (Persson y
col., 2001; Wyatt y col., 2002).
pirofosfatasa (PPiasa) y las bombas de protones (H+-ATPasas), mientras que las Ca2+-ATPasas
para este fin utilizan la energa del ATP.
La actividad de los intercambiadores H+/Ca2+ ha sido demostrada en vesculas de tonoplasto
de diferentes especies, por lo que se estima su amplia distribucin en el reino vegetal (Schumaker
y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Blackford y col., 1990; Chanson, 1991; Hirschi y col.,
1996; Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La primer isoforma definida de estos transportadores fue la
CAX1, localizada en vacuolas de Arabidopsis thaliana (Hirschi y col., 1996). El CAX1
intercambia H+ vacuolar por Ca2+ citoslico en razn de 3 por 1 y, en comparacin con las Ca2+ATPasas, con poca afinidad al calcio Km 10-13 M caracterstica general de los
intercambiadores Ca2+/H+ (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Hirschi y col., 1996;
Hirschi, 2001); no obstante, en comparacin con las Ca2+-ATPasas, la capacidad de transporte de
estas enzimas es ms alta (Hirschi, 2001) Vmax = 25 nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi
y col., 1999). De los miembros de la familia CAX investigados (que incluye 12 isoformas en el
genoma de Arabidopsis (Sanders y col., 2002) de las cuales han sido caracterizadas cuatro), solo
el CAX1 y el CAX2 (con menor afinidad) poseen la capacidad confirmada de transportar Ca2+
(Hirschi y col., 1996). Los otros miembros de esta familia (incluyendo el CAX2), al parecer,
confieren a las plantas tolerancia a otros metales potencialmente txicos (Mn2+, Cd2+, Zn2+)
mediante su aislamiento del citoplasma, y sus capacidades de transporte de Ca2+ se desconocen
(Sanders y col., 2002). Aparte de la vacuola, existen evidencias de la presencia de los CAX en la
membrana citoplasmtica (Kasai y col., 1990).
Al igual que los CAX, las Ca2+-ATPasas aslan el Ca2+ del citoplasma, transportndolo adentro
de organelos-depsitos de Ca2+ o hacia el apoplasto, pero con una mayor afinidad Km 1-10 M
(Evans y Williams, 1998) y menor capacidad de transporte (White y Broadley, 2003) Vmax = 6
nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).
Las Ca2+-ATPasas de las clulas vegetales pertenecen a la superfamilia de las P-ATPasas y
estn representadas por dos familias (Geisler y col., 2000a; Axelsen y Palmgrem, 2001): IIA (4
miembros identificados en el genoma de A. thaliana; nombrados, respectivamente, ECA1-4) y
IIB (reguladas por calmodulina o protein-kinasas dependientes de Ca2+ (CDPKs), 10 miembros
identificados en A. thaliana AtACA1, 2, 4 y 7-13, respectivamente). La localizacin interna de
las Ca2+-ATPasas tipo IIA incluyen el RE y el aparato Golgi (AtECA1, en A. thaliana; Liang y
6
mayor afinidad (Km 1-10 M) al Ca2+ (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). En otras palabras
despus de la elevacin del Ca2+ citoslico, los CAX cumplen la funcin de la rpida
disminucin de ste a niveles en los cuales el Ca2+ es menos txico y las Ca2+-ATPasas se
encargan de la subsecuente disminucin de la concentracin de Ca2+ citoslico y de su
manutencin en un rango estrecho en condiciones de reposo.
Esta hiptesis es sostenida por las observaciones hechas en Saccharomyces cerevisiae
utilizadas como modelo de procesos de transporte en plantas, en las cuales los intercambiadores
H+/Ca2+, pero no las Ca2+-ATPasas, participan en la eliminacin de las seales de calcio despus
de la aplicacin de un choque hipertnico (Denis y Cyert, 2002). No, obstante, el mutante de
Arabidopsis det3 que posee una baja actividad de H+-ATPasa vacuolar y, probablemente, de
intercambio H+/Ca2+, presenta una relativamente alta concentracin de Ca2+ citoplsmico (Allen y
col., 2000) y las plantas tratadas con bafilomicina inhibidor de H+-ATPasas tipo V
presentan una mayor elevacin de Ca2+ citoslico en respuesta a choques hiperosmticos
(Takahashi y col., 1997).
Perturbacin de [Ca2+]cit
Oscilaciones de alta [Ca2+]cit
apical
Liberador de Ca2+
al citosol
Referencias selectas
Apoplasto e
interno
Apoplasto e
interno (IP3
dependiente)
Polarizacin celular
despus de fertilizacin
Divisin celular
Elevacin de [Ca2+]cit
Bush, 1995
2+
Apoptosis
Luz roja
Elevacin de [Ca2+]cit
Apoplasto
Luz azul
Apoplasto
Ritmos circadianos
Oscilaciones circadianas de
[Ca2+]cit
Cierre de clulas de
guarda (ABA,
esfingosina-1-fosfato)
1. Elevacin de [Ca2+]cit en la
periferia celular
2. Elevacin de [Ca2+]cit alrededor
de la vacuola
3. Oscilaciones de [Ca2+]cit
1. Apoplasto
2.Vacuola
3. Apoplasto e
interno
CO2
Apoplasto
Apoplasto
2+
Incremento de Ca2+ en el Oscilaciones de [Ca ]cit en
clulas de guarda
apoplasto
Respuestas a auxinas
Elevacin de K+ en el
xilema
Elevacin de [Ca2+]cit
De Boer, 1999
Exocitosis
Elevacin de [Ca2+]cit
Apoplasto
Elongacin de pelos
radiculares
Apoplasto
Inhibicin de la ciclsis
citoplsmica
Elevacin de [Ca2+]cit
Nodulacin
Senescencia
Radiacin UV
Apoplasto
Estrs trmico
Apoplasto e
interno (IP3-
dependiente)
Estrs de fro
1. Apoplasto
Enfriamiento gradual
Bifsica
1. Picos cortos de elevacin de
[Ca2+]cit (segundos)
2. Elevacin lenta de [Ca2+]cit
1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno (IP3-
dependiente)
Estrs oxidativo
(paraquat, superxidos,
H2O2, ozono)
1. Apoplasto
2.Apoplasto e
interno (IP3dependiente)
Anoxia
Bifsica
1. Picos cortos (duracin
minutos)
2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit
(horas)
1. Apoplasto
2. Interno,
incluyendo
mitocondrias
Sequa / Estrs
hiperosmtico
(mannitol)
Bifsica
Apoplasto y
1. Picos cortos (duracin de
vacuola
minutos)
2+
2. Elevacin sostenida de [Ca ]cit
(horas)
Bifsica
Apoplasto y
Ondas de elevacin de [Ca2+]cit en vacuola (IP3tejidos
dependiente)
1. Picos cortos (de minutos de
duracin)
2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit
(horas)
3. Disminucin de [Ca2+]cit (das)
Estrs hipoosmtico
Bifsica
1. Pequea elevacin de [Ca2+]cit
2. Gran elevacin de [Ca2+]cit
1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno
Estimulacin mecnica
(movimiento, roce,
viento)
Interno
Estrs de Al
elevacin de [Ca2+]cit
Patgenos (elicitors)
Bifsica
1. Picos lentos de elevacin de
[Ca2+]cit (duracin de minutos)
2. Elevacin sostenida de
[Ca2+]cit (horas)
3. Oscilaciones de [Ca2+]cit (la
magnitud relativa de las
diferentes fases dependen del
patgeno)
1. Apoplasto
2. Apoplasto e
interno (IP3dependiente)
10
11
ABA,
Seales polarizantes endgenas,
Choque osmtico,
Fro,
Sequa
Polarizacin,
Choque hipoosmtico
RE
Vacuola
0.1-200 mM Ca
Fro,
Sequa
1-3 mM Ca2+
2+
o
Cloroplast a
2+
2+
las
C
Citop
0.1-10 mM C
m
0.1-10
Luz / Oscuridad
1.2 Antecedentes
Estudios en clulas completas: (i) tanto IP3, como cADPR causan el cierre de la estoma en las
clulas de guarda (Blatt y col., 1990; Leckie y col., 1998); (ii) el tratamiento con ABA induce,
por una parte el aumento del nivel de cADPR (Wu y col., 1998), por otra una onda de
Ca2+ en el citosol, que inicia la liberacin de calcio de depsitos intracelulares, inhibida por
rianodina (Grabov y Blatt, 1999); (iii) el bloqueo de la fosfolipasa C (PLC, enzima-productora
de IP3) elimina los efectos de ABA oscilaciones de [Ca2+]cit y el cierre de las clulas de
guarda (Staxen y col., 1999); (iv) choques hiperosmticos (NaCl, en raz de Arabidopsis)
producen IP3 y la simultnea movilizacin del Ca2+ intracelular (DeWald y col., 2001).
Estudios en preparaciones de membranas: (i) IP3 causa la liberacin de Ca2+ en vesculas de
membrana vacuolar (de avena Avena Shumaker y col., 1987; y Beta Allen y col., 1995).
Un estudio ms detallado (Muir y Sanders, 1997) en coliflor (Brassica) mostr la asociacin
de este efecto del IP3 principalmente con la fraccin de membrana plasmtica, y en menor
grado con la fraccin enriquecida de RE y la de membranas vacuolares; (ii) cADPR induce
la liberacin de Ca2+ en vesculas de RE (pero no en membranas plasmticas) de Brassica
(Navazio y col., 2001); (iii) al igual que IP3, cADPR induce la liberacin de Ca2+ en vesculas
de membrana vacuolar de Beta (Allen y col., 1995).
Aparte, se ha reportado la participacin de ligandos en la mediacin de respuestas a diversos
estmulos: IP3 media la respuesta a los estreses salino e hiperosmtico (Drobak y Watkins, 2000;
DeWald y col., 2001) y gravitropismo (Perera y col., 1999) y cADPR participa en la activacin
de genes de defensa (Durner y col., 1998) y en la transduccin de la seal generada por ABA
(Wu y col., 1997; McAinsh y Htherington, 1998). No obstante, a pesar de estos encuentros, los
canales-responsables de la liberacin de Ca2+ todava no han sido caracterizados.
Alexandre y col. (1990) reportaron la existencia de canales activados especficamente por IP3
en vacuolas de raz de betabel. Este fue el nico trabajo en clulas vegetales, en el que fueron
registrados canales unitarios activados por ligandos, no obstante, estos registros no pudieron ser
reproducidos posteriormente en varios trabajos (Chasan y Schroeder, 1992; Gelli y Blumwald,
1993). Allen y Sanders (1994a, 1995) mostraron la generacin de corrientes a travs de la
membrana vacuolar de Beta con la aplicacin de IP3 y cADPR. No obstante, en ambos casos la
corriente registrada constituy una pequea fraccin sobre la corriente de fuga no especfica y
probablemente es un artefacto causado por el intercambio de solucin. Adems, a diferencia de
los canales activados por ligandos de clulas animales, las corrientes generadas por IP3 y cADPR
14
en estos trabajos fueron independientes del nivel de Ca2+ citoslico hasta concentraciones
milimolares, en contraste con el reporte de Leckie y col (1998) de un Km de ~100 nM para la
inhibicin por Ca2+ citoslico de corrientes vacuolares originadas por cADPR en clulas de
guarda. No obstante, este valor de Km para calcio coincide con el Km de inhibicin del canal
vacuolar rpido (Fast Vacuolar channel FV), las corrientes del cual no fueron eliminadas en
este estudio. Otra de las evidencias en contra de los estudios realizados para la determinacin de
canales activados por ligandos en clulas vegetales es la alta concentracin de rojo de rutenio
100 M con la que fue inhibida la corriente inducida por cADPR (la concentracin utilizada
es 100 veces mayor a la empleada para el bloqueo del receptor de ryanodina en las clulas
animales).
De esta manera, de todos los canales permeables a Ca2+ reportados, la existencia y la
permeabilidad a Ca2+ hasta el momento solamente han sido establecidas para el canal SV uno
de los objetos de estudio del presente trabajo.
15
y condiciones inicas muy diferentes que dificultan enormemente el anlisis comparativo de los
datos obtenidos.
La adopcin de la convencin sobre mediciones electrofisiolgicas en endomembranas (Bertl
y col, 1992) sirvi como primer paso para la estandarizacin de la tcnica de obtencin de
registros, particularmente, de las corrientes vacuolares. Por esta convencin, el potencial Vm a
travs de las endomembranas es registrado respecto al potencial del citoplasma y calculado para
la vacuola como Vm = Vcytosol Vvacuola. En este caso, las corrientes positivas o salientes
representan el flujo de cationes fuera del citosol (entrantes a la vacuola). Siguiendo esta
convencin, el canal SV actualmente es caracterizado como canal-rectificador saliente.
Referencia
Trebacz y Schnknecht., 2000
Carpaneto y col., 1997
Amodeo y col., 1994
Paganetto y col., 2001
Wherret y col., 2005
Bethke y Jones, 1994; Pottosin y col., 1997
Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu
y col., 2004
Reifarth y col., 1994
Maathuis y Prins, 1990
Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995
Hedrich y Neher, 1987; Pottosin y col., 2004; 2005
Scholz-Starke y col., 2004
Pantoja y col., 1989
Gambale y col., 1993; Carpaneto, 2003
Colombo y col., 1994; Peiter y col., 2005
16
Referencia
Hedrich y col., 1986
Gambale y col., 1993; Pottosin y Schnknecht, 2007
Pottosin y col., 1997
Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich,
1995
Bethke y Jones., 1994
Colombo y col., 1988; Weiser y col., 1990
Vacuola
+
1 2 34 5
+
6
EF
7 8 9 10 11
12
EF
Citosol
vacuola
20
citosol
19
los cationes divalentes en su moviemiento a travs del poro se comportan como bloqueadores
permeables (Pottosin y col., 2004).
Las filas de selectividad determinadas para los canales SV de diferentes especies de plantas,
son mostradas en la Tabla 4.
TABLA 4. Selectividad y permeabilidad del canal SV (fuente: elaboracin propia).
Especie
Allium cepa
Beta vulgaris, Vicia faba
Fila
+
Referencias
+
2+
2+
Dauca carota
Permeabilidad relativa :
K+ NH +4 > Rb+ > Cs+ >> TMA+ TEA+
Conductancia :
K+ > Rb+ > Cs+ > NH +4 >> TMA+ TEA+
Conductancia
En diferentes objetos la conductancia del canal SV vara entre 26 y 280 pS en condiciones
de 100 mM KCl simtrico y potenciales entre 20 y 80 mV, con actividad media del canal
(Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995). La mayor conductancia en estas condiciones la presentan los
canales SV de las clulas de guarda 280 pS (Vicia faba, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y
210 pS (Allium cepa, Amodeo y col., 1994). La conductancia mas baja corresponde al canal SV
de vacuolas de reserva de aleurona 26 pS (Bethke y Jones, 1994). La conductancia del canal
unitario SV depende principalmente de la concentracin de K+, con los parmetros de Km ~ 100
mM y Gmax ~ 280 pS determinados para vacuolas de betabel (Gambale y col., 1996; Pottosin et
al., 2001).
El incremento de la concentracin libre de cationes divalentes en el lado vacuolar afecta la
conductancia del canal SV. En presencia de 100 mM KCl y pH 7.5 simtricos y 2 mM Ca2+ del
lado citoplsmico, el aumento de calcio o magnesio vacuolar libre de nanomoles a 10 mM causa
la reduccin dependiente de voltaje de la corriente del canal unitario, siendo esta reduccin
mayor a potenciales ms negativos (Pottosin y col., 2004): a 200 mV la corriente relativa del
canal unitario para condiciones de 10 mM de Ca2+ o Mg2+ vacuolar, respectivamente, constituye
solamente el 21 y 28% de la corriente en control, mientras que a potenciales positivos (+200 mV)
no hay diferencia en las corrientes del control y con la aplicacin vacuolar de uno de los cationes
divalentes; a 0 mV (potenciales fisiolgicos) la corriente relativa representa el 35 o 50% (Ca2+,
Mg2+, respectivamente) de la corriente en el control. Los potenciales negativos (citoslicos)
20
favorecen la aproximacin de Ca2+ y Mg2+ al sitio de unin dentro del poro. A la vez, estos
ltimos impiden el flujo libre de cationes monovalentes.
Bloqueadores
En la Tabla 5. se muestran algunos de los bloqueadores del canal SV, con las respectivas
caractersticas del bloqueo. Interesantemente, el canal SV es bloqueado por concentraciones
submicromolares de rojo de rutenio agente qumico empleado como bloqueador del receptor
de ryanodina (RR) e inhibidor de la liberacin de calcio inducida por calcio en clulas animales,
lo que pudiera sugerir cierta similitud de los papeles que juegan el RR y el SV en los respectivos
organismos.
TABLA 5. Bloqueadores y caractersticas del bloqueo del canal SV (fuente: elaboracin
propia).
Bloqueadores
Caractersticas del bloqueo
Referencias
Fisiolgicos
Ca , Mg2+ vacuolar y
citoslico
2+
Poliaminas citoslicas
Zn2+
No fisiolgicos
DIDS, SITS
A-9-C
Charibdotoxina
Tubocurarina
Quinacrina
Rojo de rutenio
TEA+
Tris+
Neomicina
Kd = 1 M
Kd = 25 M
Kd = 20 nM
Kd = 60 M
Kd = 15 M
<0.1 M causa: 1) cierre prolongado del canal (independiente
de voltaje, irreversible), 2) bloqueo vibratorio flickering
Pottosin y col., 1999
en el estado abierto del canal (dependiente de voltaje e
irreversible). 3-5 M suprimen casi completamente la
actividad del canal SV
Kd = 1.2 mM (0 mV)
Kd = 60 mM (0 mV)
Moduladores
Hasta hoy en da no se conocen exactamente todos los reguladores de la actividad del canal
SV, as como los sitios de unin a travs de los cuales es realizada esta regulacin del canal.
Varios estudios han mostrado un repertorio muy amplio de agentes-moduladores del canal SV
(Tabla 6.), aunque en todos los casos no es posible asegurar si los efectos notados sobre la
21
Voltaje
Modulacin
Referencias
Calmodulina
pH
Fosforilacin
Protenas 14-3-3
Metales pesados
Al3+
Neomicina
Na+
(especficamente)
22
actividad del canal son el resultado de la accin directa sobre l, o sobre protenas-reguladoras
adicionales, cooexpresadas junto con en el canal SV en la membrana vacuolar.
La regulacin del canal SV es efectuada por los lados tanto vacuolar como citoslico y puede
consistir igualmente en la disminucin de la probabilidad de apertura del canal, como en su
aumento (Tabla 6.). Entre todos los agentes que regulan la actividad del canal SV, los cationes
monovalentes (K+, Na+) y los divalentes (especialmente Ca2+, Mg2+), son, probablemente, los
factores conocidos ms importantes que modulan la actividad del canal SV en condiciones
fisiolgicas.
K+ y Na+, a pesar de ser cationes monovalentes, regulan al canal SV de maneras diferentes. La
modulacin causada por K+ (Tabla 6.) es de carcter inespecfico y es efectuada a travs del
cambio del potencial de superficie del tonoplasto, que se encuentra en funcin de la fuerza inica
del contenido vacuolar. La sustitucin de K+ en este caso por una concentracin equivalente de
otros cationes orgnicos impermeables devuelve el mismo resultado la disminucin de la
sensibilidad al voltaje aplicado con el aumento de la fuerza inica de la solucin vacuolar
(Pottosin y col., 2005). El efecto de Na+ vacuolar, en contraste, al parecer es de carcter
especfico, ya que no es reproducido por el reemplazamiento de un concentracin equivalente de
K+ (Tabla 6., Ivashikina y Hedrich., 2005), y puede, segn los autores, jugar un papel importante
en el mantenimiento de la homeostasis inica durante el estrs salino.
Los efectos de Ca2+ y Mg2+ en ambos lados del tonoplasto sobre la actividad del canal SV son
similares (Tabla 6.), aunque el SV presenta una afinidad superior al Ca2+ que al Mg2+: para
evocar los efectos del primero es necesario aplicar una concentracin mucho mayor (en rdenes
de magnitud) de Mg2+. El aumento de la concentracin libre de Ca2+ o Mg2+ en el lado citoslico
causa el desplazamiento de la curva de activacin del canal SV a potenciales ms negativos. El
canal SV es activado ya por concentraciones micromolares de Ca2+ citoslico (Bethke y Jones,
1994; Reifarth y col., 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich., 1995; Allen y col., 1996), aunque los
valores del desplazamiento de la dependencia de voltaje difieren en los trabajos mencionados,
principalmente por la presencia de Mg2+ en las soluciones de trabajo. Para originar una activacin
similar a la causada por micromoles de Ca2+, son necesarias concentraciones milimolares de Mg2+
(Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), aunque en Hordeum el canal SV no era activado ni en
la aplicacin de 50 mM Mg2+ citoslico + EGTA agente quelante de Ca2+ (Pottosin y col.,
1997). No obstante, el Mg2+ citoslico fue propuesto como sensibilizador del canal SV al Ca2+
que pudiera jugar cierto papel en la regulacin del canal SV durante la elevacin fisiolgica del
23
Ca2+ citoplsmico (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001) mediante la sensibilizacin del canal
SV a las bajas concentraciones de Ca2+ presentes en el citoplasma.
A diferencia de sus efectos en el lado citoslico, el aumento de la concentraciones de
Ca2+/Mg2+ en el lado vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal SV mediante el
desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (Pottosin y col., 1997;
Ward y Schroeder, 1994; Pei y col., 1999; Pottosin y col., 2004). En un estudio detallado de la
modulacin del SV por cationes divalentes, Pottosin y col. (2004) determinaron que la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en funcin del Ca2+ vacuolar
aplicado es bifsica y no se describe con la simple ecuacin de Boltzmann. A potenciales ms
negativos la dependencia de voltaje es muy abrupta, pero esta funcin disminuye drsticamente
su pendiente a potenciales ms positivos. Por esta razn, segn los autores, el esquema cintico
mnimo que describe la transicin del canal SV entre los estados cerrado y abierto debe contener
3 estados:
C2 C1 O.
Cada uno de los procesos de transicin C2C1 y C1O es descrito por la ecuacin de
Boltzmann y es caracterizado por sus potenciales de punto medio (midpoint potentials, V2 y V1),
en los cuales la ocupacin de los respectivos estados se encuentra en equilibrio, y por sus cargas
de compuerta (gating charges; z2 y z1), que definen la pendiente de la transicin dependiente de
voltaje entre los respectivos estados. La probabilidad de apertura del canal, de esta forma, es
determinada con la ecuacin
Po =
1
F
F
1 + exp(- z1 (V - V1 )
) (1 + exp(- z2 (V - V2 )
))
RT
RT
parte del modelo matemtico, elaborado por Pottosin y col. (2004) que describe las transiciones
del canal y permite describir de una manera muy exacta la dependencia de voltaje de la
probabilidad de apertura del canal en presencia de diferentes niveles de calcio vacuolar. En
concordancia con el modelo, la transicin al estado abierto del canal (C1O) es la menos
dependiente de voltaje (z1 = 0.7), mientras que la precedente (C2C1) es caracterizada por una
mayor dependencia de voltaje (z2 = 2.9). Aparte, fue determinado, que ambos equilibrios V1
(C1O) y V2 (C2C1) son afectados por el incremento de la concentracin de calcio vacuolar,
aunque de distinta manera: en condiciones de bajo calcio vacuolar V2 es menor que V1 y
24
predomina la transicin C1O. El aumento del calcio vacuolar causa el desplazamiento del
equilibrio hacia el estado C1 y el umbral de activacin del canal se recorre a potenciales ms
positivos. Un aumento mayor de la concentracin del calcio vacuolar trae como consecuencia el
desplazamiento del equilibrio hacia el estado C2 de la transicin C2C1. En otras palabras, el
incremento del calcio vacuolar suprime efectivamente la actividad del canal: un aumento del
calcio vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura del canal a
potenciales ms positivos (a nivel 1% de canales abiertos desde 80 a +70 mV). A potenciales
fisiolgicos (alrededor de 0 mV) en presencia de 2 mM de Ca2+ simtricos la probabilidad de
apertura del canal SV es menos de 0.01% o menos de un canal por vacuola, incluso en
condiciones que favorecen la activacin del canal (2 mM Ca2+ citoplsmico) (Pottosin y col.,
2004). La modulacin causada por Mg2+ vacuolar es similar a la originada por Ca2+, aunque su
efecto es ms modesto: un incremento del Mg2+ vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento
de la dependencia de voltaje de solo unos 70 mV (desde 80 hasta 10 mV) a 1% de canales
abiertos.
El modelo propuesto por Pottosin y col. (2004) indica la existencia de una unin cooperativa
de varios cationes divalentes para la regulacin de la apertura del canal SV, especifica la etapa
limitante (C1O) de la activacin del canal y predice correctamente la dependencia de los
tiempos medios de activacin y desactivacin del canal en funcin de la concentracin vacuolar
de los cationes divalentes. No obstante, este modelo describe la regulacin de la compuerta
(gating) del canal SV en condiciones lejanas de las fisiolgicas pH vacuolar neutro
(probablemente, presentado solo en vacuolas aleurnicas de almacenamiento, pero no en
vacuolas lticas, utilizadas en los experimentos de ese trabajo) y alto Ca2+ citoslico (2 mM),
empleado para activar las corrientes del canal SV. Por lo tanto, no es posible estimar la
probabilidad de apertura del canal en condiciones fisiolgicas y determinar si la elevacin del
calcio citoslico es suficiente para la activacin del canal SV.
rpidamente recibi amplia aceptacin sin revisin previa (Allen y col., 1996; Barkla y Pantoja,
1996; Ward y col., 1995). Segn Ward y Schroeder (1994) la liberacin de calcio, mediada por el
canal SV, requiere un incremento inicial del calcio citoslico, inducido por un estmulo (por
ejemplo, por la fitohormona ABA). La subsecuente activacin de canales de potasio dependientes
de Ca2+ (VK) pudiera causar un desplazamiento del potencial a travs de la membrana vacuolar a
valores ms positivos. Finalmente, el aumento del calcio citoslico y el potencial positivo de la
membrana puede causar la apertura de los canales SV, permeables a calcio, dando paso, de esta
forma, a la liberacin de calcio de la vacuola (Ward y col., 1995; 1994).
Pottosin y col. (1997) argumentaron que en condiciones fisiolgicas, caracterizadas por un
nivel bajo de calcio citoslico y alto dentro de la vacuola, as como por potenciales negativos
a travs de la membrana vacuolar, la probabilidad de apertura del canal SV es muy baja. Para
aumentar la probabilidad de la apertura del SV en presencia del alto calcio vacuolar, como fue
mencionado ms arriba, se requiere Ca2+ citoslico en el rango de micromoles, as como
potenciales positivos de varias decenas de milivoltios. Sin embargo, estas condiciones reducen la
fuerza motriz de la liberacin del calcio de las vacuolas de mesfilo de cebada (Pottosin y col.,
1997). Aplicando concentraciones de calcio en el rango 13-2000 M en el lado citoplsmico en
presencia de 50 M o 2 mM en el lado vacuolar, este grupo de colaboradores determin que la
probabilidad de la apertura del canal depende en un mayor grado del gradiente de calcio aplicado
a travs de la membrana vacuolar, que de la concentracin del calcio citoslico sola. En
condiciones de nula fuerza motiva neta para calcio (Ca = V ECa = 0), la probabilidad de
apertura del canal SV es de 0.35% o, aproximadamente, 10 canales abiertos por una vacuola
tpica de 20 m de dimetro. Para las condiciones que favorecen la liberacin de calcio de la
vacuola (Ca < 0) esta probabilidad es menor todava asumiendo una actividad de calcio
vacuolar 1000 veces mayor que en el citoplasma (ECa = +87 mV) y un pequeo potencial de
membrana, estos autores calcularon una actividad promedia mucho menor de 1 canal abierto por
vacuola (Po = 0.0025%), y solo en condiciones que favorecen la acumulacin de calcio dentro de
la vacuola esta probabilidad de apertura aumentaba considerablemente (Pottosin y col., 1997).
Esta observacin les permiti a los autores sealar la dificultad de la participacin del canal SV
en la liberacin de calcio inducida por calcio.
Este resultado, a su vez, fue criticado por Bewell y col. (1999), argumentando que en
presencia de milimoles de Mg2+ citoslico, como sensibilizador, el umbral de activacin del
canal SV puede recorrerse a potenciales ms negativos obtenindose as las condiciones para la
26
liberacin de calcio a potenciales fisiolgicos. Este mecanismo fue respaldado por Carpaneto y
col. (2001). En condiciones de 10 mM de Mg2+y nanomoles de Ca2+ en el citoplasma, y 2 mM y 1
mM, respectivamente, de Mg2+ y Ca2+ vacuolar condiciones que favorecen la salida de calcio
de las vacuolas, fue obtenida la actividad del canal SV, aunque solamente a partir de +100
mV. El aumento del calcio citoslico recorre el umbral de activacin del canal y el potencial de
reversin de calcio ECa a potenciales ms negativos. Pero a 100 M de calcio citoslico el
potencial de reversin ECa es ms negativo que el potencial del umbral de activacin del canal SV
y en estas condiciones el calcio a travs de los canales SV puede fluir solamente desde el citosol
adentro de la vacuola. Adicionalmente, estos autores remarcan que la concentracin citoplsmica
utilizada (10 mM), puede corresponder solamente al Mg total en las clulas vegetales y es lejana
de la concentracin libre de magnesio citoslico, aunque ya su cambio en el rango fisiolgico
(0.1-1 mM; Bruggemann y col., 1999) puede causar el desplazamiento del potencial de
membrana unos 20 mV hacia potenciales ms negativos. No obstante, el umbral de activacin del
canal SV sigue situado considerablemente lejos del potencial vacuolar en condiciones
fisiolgicas. Por esta razn, la presencia de activadores adicionales es requerida para la liberacin
de calcio (Carpaneto y col., 2001).
Trabajos ms recientes se han centrado en la bsqueda de agentes que pudieran actuar como
activadores adicionales del canal SV y que le permitieran participar en la liberacin de Ca2+
inducida por Ca2+. Como tales posibles factores fueron determinados los agentes reductores
particularmente DTT, la forma reducida de glutationa (GSH) y el cido ascrbico (Tabla 6.;
Carpaneto y col., 1999; Scholz-Starke y col., 2004; 2005) y recientemente el antibitico
neomicina. Este ltimo agente mostr la mayor potencia de modulacin positiva del canal SV,
desplazando el umbral de activacin a potenciales negativos (Scholz-Starke y col., 2006). No
obstante, probablemente estos resultados muestran ms que nada la posibilidad de una activacin
adicional del canal SV en condiciones fisiolgicas por algn agente, no precisamente neomicina,
que pueda determinar la especificad de la liberacin de Ca2+ desde la vacuola como respuesta a
diferentes estmulos (ver. Tabla. 1).
parte,
lneas de Arabidopsis con knock-out por el gen tpc (tpc1-2 SALK_125658, tpc1-1
Allen G.J., Sanders D. Vacuolar Ion Channels in Higher Plants. En: Roger A. Leigh, Dale Sanders (Eds.) The Plant
Vacuole. Advances in Botanical Research incorporating Advances in Plant Pathology. V. 25. Acdemic Press, 1997,
p. 227.
28
Lepidium sativum (LCC1, de Lepidium Calcium Channel; Klsener y col., 1999), estudiados
ambos con la tcnica de bicapas lipdicas.
El canal BCC1 presenta actividad en rfagas y posee al menos dos estados abiertos (Klsener
y col., 1995; 1997), mientras que el LCC1 tiene solamente un estado abierto, caracterizado por su
tiempo medio de 2.8 ms (Klsener y col., 1999). En la Tabla.7 se hace una comparacin de estos
dos canales reportados.
Aunque los estudios presentes fueron realizados en bicapas lipdicas y la orientacin absoluta
de los canales no se puede determinar, las caractersticas registradas permiten solo una
orientacin compatible con las condiciones fisiolgicas, esta es permitiendo la salida de Ca2+
del RE al citoplasma (Klsener y col., 1995, 1997, 1999). El canal BCC1 fue propuesto para la
participacin en la transduccin de las seales en los rganos mecanoreceptivos de Bryonia,
TABLA 7. Caracterstica de los canales catinicos del RE reportados en plantas superiores
Parmetro
Conductancia
Selectividad
Bloqueadores
Cu2+ EC50 5 M
La3+ EC50 5 M
Gd3+ EC50 10 M
Eritrosina-B EC50 1 M
29
Regulacin
Voltaje
pH
Otros
formando junto con la Ca2+-ATPasa del RE un oscilador de Ca2+ que permite la identificacin
espacio-temporal del estmulo (Klsener y col., 1995).
Por otra parte, la inhibicin del canal LCC1 (as como el BCC1) por el inhibidor de Ca2+ATPasa eritrosina-B en bajas concentraciones pudiera ser indicacin de que estos canales pueden
aparecer como resultado del desacoplamiento de la Ca2+-ATPasa, cuyos dominios
transmembranales, como se ha mostrado en el caso de protenas de retculo sarcoplsmico,
pueden actuar como canales permeables a Ca2+ (de Meis y col., 1996). Este desacople, segn
Klsener y col. (1999), puede fcilmente ocurrir durante el procedimiento de extraccin de la
membrana, por lo que estudios ms minuciosos son requeridos.
Aparte, en varios estudios fue reportada la liberacin de Ca2+ de vesculas de RE, causada por
ligandos cADPR, NAADP (Navazio y col., 2000; 2001). Martinec y col (2000) reportaron en
este compartimiento la presencia de sitios de unin a IP3. Sin embargo, en ninguno de estos
trabajos fueron determinados o caracterizados los canales sensibles a ligandos responsables de la
liberacin de calcio.
En la Fig.3 son resumidos los mecanismos de transporte y liberacin de Ca2+ conocidos hasta
hoy en las membranas intracelulares, especficamente del tonoplasto y el retculo
endoplsmico, de las clulas vegetales.
30
ADP+Pi
H+-ATPasa
ATP
PPi
RE
2+
1-3 mM
2+
CAX
0.1-200 mM Ca2+
ACA
ECA
BCC1
LCC1
Vacuola
Ca
ADP+Pi
Ca
pH 4..6.5
H+-PPasa
ACA
ATP
SV
ATP
ADP+Pi
ADP+Pi
Ca
Citoplasma
2+
0.1-20 mM Ca
2+
2+
2+
ATPasas: ACA - ATPasas con mecanismo de autoihibicin y regulacin por calmodulina, ECA - ATPasas
tipo RE; H+-ATPasa, H+-PPasa - respectivamente, bomba de protones y pirofosfatasa vacuolares que
generan el gradiente de H+, necesario para el funcionamiento de los CAX.
Transportadores: CAX - intercambiadores H+/Ca2+.
Canales: SV - canal vacuolar lento, el nico establecido firmemente hasta el momento en la membrana
vacuolar con permeabilidad al Ca2+; BCC1, LCC1 - canales determinados en vesculas del retculo
endoplsmico.
2.1 Hiptesis
La actividad del Ca2+ en vacuolas vegetales vara. En el rango micromoles-1 mM es posible
realizar el monitoreo de la actividad de Ca2+ en la vacuola, utilizando como reportero intrnseco
el canal SV el canal vacuolar con mayor distribucin y con sensibilidad al Ca2+ vacuolar en el
rango sealado.
El canal SV es el nico canal con permeabilidad a Ca2+ establecida, presente en el mayor
depsito intracelular de Ca2+ la vacuola central. Por lo tanto, el canal SV pudiera participar en
la sealizacin por Ca2+, particularmente en la liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC).
En la membrana del segundo mayor depsito intracelular de Ca2+ el retculo
endoplsmico, se encuentran canales permeables a Ca2+. Es probable, que algunos de estos
canales sean activados por ligandos (IP3) y participen en la liberacin de calcio desde este
compartimiento.
2.2 Objetivos
Generales:
Determinar la concentracin de Ca2+ vacuolar libre en vacuolas de clulas vegetales y las
rutas de movilizacin de Ca2+ intracelular desde los principales depsitos internos de Ca2+ la
vacuola y el retculo endoplsmico.
Especficos:
1. Elaborar una tcnica no invasora de la medicin del calcio vacuolar libre, basada en el efecto
modulador del Ca2+ sobre el canal SV. Utilizando sta, determinar el nivel de calcio vacuolar
libre en vacuolas de betabel. Comparar los datos obtenidos con datos de tcnicas alternativas
de medicin de Ca2+.
32
33
3. Metodologa
3.1 Preparaciones
3.1.1 Objeto de estudio.
En el presente trabajo fueron estudiados canales permeables a Ca2+ de membranas
intracelulares de la raz napiforme de betabel (Beta vulgaris L.; Chenopodiacea), especficamente
de la vacuola y el retculo endoplsmico.
Solucin de bao
Solucin de pipeta
KCl 100 mM
KCl 100 Mm
2+
Ca 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0 mM*
Ca2+ 2 mM
MES 10 mM
HEPES 10 mM
Sorbitol
Sorbitol
pH 6.4
pH 7.5
2+
* las soluciones con 0 y 0.05 mM de Ca fueron preparadas utilizando bferes para calcio (Tabla I en el
Apndice).
34
Vacuola
Citosol
KCl 100 mM
KCl 100 mM
Ca2+ 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 10.0
Ca2+ 2 mM
mM*
MES 10 mM
HEPES 10 mM
sorbitol
sorbitol
pH 5.5 / 6.4
pH 7.5
2+
* - las soluciones con 0, 0,01 y 0,05 mM de Ca fueron preparadas utilizando bferes para calcio, como es mostrado
en la Tabla II del Apndice.
TABLA 10. Soluciones para determinar el efecto de Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV.
Vacuola
Citosol
KCl 187 mM
KCl 125 mM
KCl 125 mM
KCl 100 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 2 mM
2+
2+
2+
Ca 0, 0.5 mM*
HEPES 10 mM
Ca 0, 0.5 mM*
Ca 0, 0.5 mM*
MES 10 mM
MES 10 mM
MES 10 mM
Sorbitol
Sorbitol
sorbitol
sorbitol
pH 7.5
pH 5.5
pH 5.5
pH 5.5
* - las soluciones con 0 mM de Ca2+ fueron preparadas utilizando los valores de la Tabla II del Apndice.
TABLA 11. Soluciones para determinar el efecto conjunto de H+, Na+, Ca2+, Mg2+ sobre la actividad del SV.
Vacuola
Citosol
KCl 125 mM
KCl 100 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 2 mM
2+
HEPES 10 mM
Ca 0, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 mM *
2+
sorbitol
Mg 8 mM
MES 10 mM
pH 7.5
sorbitol
pH 5.5
* - las soluciones con bajo Ca2+ fueron preparadas utilizando bferes para calcio, como es mostrado en la Tabla III
del Apndice.
TABLA 12. Soluciones de modelacin del entorno inico fisiolgico del canal SV (0.5-1.5 mM Mg2+ citoslico).
Vacuola
KCl 125 mM
NaCl 62 mM
Ca2+ 0,25 mM
Mg2+ 8 mM
MES 10 mM
sorbitol
pH 5.5
Citosol
100 nM Ca2+
KCl 100 mM
Mg2+ 0.5, 1.5 mM
Ca2+ 100 nM
HEPES 10 mM
Sorbitol
pH 7.5
20 M Ca2+
KCl 100 mM
Mg2+ 0.5, 1.5 mM
Ca2+ 20 M
HEPES 10 mM
sorbitol
pH 7.5
35
Las osmolaridad de las soluciones de trabajo fue ajustada con sorbitol a la osmolaridad del
jugo celular, determinada con un osmmetro crioscpico Osmomat 030 (Gonotec).
36
2. Centrifugacin a 100,000 g por 1 hora (igualmente modificado a 50,000 g por 1.5 horas) a
4C. Obtencin del pellet (pastilla) de membrana de retculo endoplsmico.
3. Resuspensin en 5 l de MOPS (10 mM, pH 7.4), 10 l de etilenglycol (5%).
4. los 15 l resultantes fueron colocados en la cmara experimental para la deshidratacin
(4-6 horas a 4C con o sin silicagel).
5. Hidratacin de la preparacin mediante la agregacin de 20 l KCl (100 mM) durante la
noche a 4C o exponiendo la preparacin 2-3 horas a temperatura ambiente.
6. Una vez observadas la liposomas, fue cuidadosamente aadida la solucin de bao
(inicialmente KCl (100 mM), sorbitol; reemplazada despus por soluciones de otra
composicin, segn el experimento).
37
Attached
Inside-out
Whole-vacuole
Outside-out
Fig.4 Esquema de la obtencin de las diferentes configuraciones, utilizadas en la
tcnica de patch-clamp (fuente: elaboracin propia).
La obtencin de cualquier configuracin empieza por la obtencin de un sello de alta resistencia
(>1GOm) en la configuracin attached. Con base en esta se pueden obtener dos configuraciones:
mediante la ruptura de la unin entre la micropipeta y la membrana se obtiene la configuracin
inside-out, la ruptura de la membrana directamente debajo de la pipeta origina la configuracin
vacuola entera - anlogo de whole-cell. A su vez, la ruptura de la unin de la micropipeta a la
vacuola causa el aislamiento de un fragmento de membrana en la configuracin outside-out.
3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin
de relacin corriente-voltaje del canal unitario.
Las corrientes de los canales SV eran evocadas por pulsos rectangulares. Para los registros
en configuracin outside (vacuolar)-out, el potencial de mantenimiento fue establecido en +60
mV. El protocolo de voltaje era iniciado por un prepulso de +100 mV para la desactivacin de los
posibles canales abiertos. Los pulsos de voltaje fueron aplicados desde 100 mV con un paso de
20 mV hasta llegar a 160 180 mV. El protocolo lo finalizaba otro pulso a +100 mV para
poder observar las colas de desactivacin de los canales. La duracin del pulso era escogido de
tal manera, que las corrientes activadas alcanzaran un nivel estacionario, esto generalmente
ocurra entre 3-5 segundos, en dependencia del calcio vacuolar aplicado.
Los registros en las configuraciones inside-out y attached fueron realizados con el mismo
protocolo, excepto que todos los signos de voltajes cambiaban al opuesto.
La obtencin de curvas I-V de los canales unitarios fue realizada con la tcnica descrita por
Dobrovinskaya y col. (1999). Para obtener la relacin corriente-voltaje de un canal unitario,
manualmente se escoga un voltaje de mantenimiento en el cual se encontraba abierto no ms de
un canal SV al mismo tiempo. Sobre este potencial de mantenimiento fueron aplicados pulsos de
voltaje en forma de rampa muy rpida (con duracin de 15 ms) que recorra durante este corto
tiempo el voltaje de 200 mV hasta +200 mV. En ausencia de canales abiertos, este pulso nos da
la corriente de fuga, mientras que la aplicacin de la rampa durante el estado abierto del canal nos
regresa la suma de la corriente-fuga y la corriente del canal unitario abierto. Restando de esta
ltima la corriente-fuga obtuvimos la corriente que pasa por un canal unitario en dependencia del
voltaje aplicado, es decir, la relacin corriente-voltaje.
por el valor de la corriente del canal unitario (obtenida con la tcnica de rampas) en el valor de
voltaje correspondiente. Los datos normalizados (Fig. 5A) (NP/NPmax, donde NPmax es el mayor
nmero promedio de canales abiertos obtenido) de diferentes parches, de esta manera, pudieron
ser comparados y representan la probabilidad de apertura Po/Pomax del canal SV a cierto potencial.
41
1
NP / NPmax
0.01
V / mV
V1
V1% / mV
V2
V3
Potenciales de 1%
de canales abiertos
V1%
en registros attached
V3
Curva de calibracin
obtenida en parches aislados
B
V2
V1
2+
lg [Ca ]vac / mM
[Ca2+]vac en dependencia
2+
de [Ca ]bao
2+
lg [Ca ]vac / mM
Equilibrio de [Ca2+]vac, determinado
por la ecuacin de Nernsto
[Ca2+]vac vera
2+
lg [Ca ]bao / mM
Fig.5 Pasos ejecutados para la comparacin de registros en diferentes parches, la
2+
calibracin del efecto de Ca sobre el canal SV y para la estimacin de la
actividad del calcio vacuolar (fuente: elaboracin propia).
A. Determinacin del voltaje de 1% de canales abiertos, a partir de datos obtenidos y los fit, realizados
con el modelo matemtico (Pottosin et al., 2004); B. Obtencin del nivel de Ca2+ vacuolar con la
influencia del nivel de Ca2+ aplicado en el bao; C. Obtencin de la verdadera actividad de Ca2+,
comparando los datos obtenidos en B, con la actividad-lmite para calcio, obtenida con la ecuacin de
Nernst y el potencial a travs de la membrana. Detalles - en el texto.
potencial a travs de la membrana que es registrado al fin del experimento con el parche attached
va ruptura de la membrana y medicin en condiciones de fijacin de corriente (I=0).
Colocando en una dependencia nivel Ca2+ vacuolar del nivel de Ca2+ en el bao los datos del
Ca2+ vacuolar obtenidos y los datos de la actividad-lmite calculados podemos compararlos.
Suponemos, que el nivel de Ca2+ vacuolar vero es aquel que se encuentre en el cruce de las
curvas, de lmite y obtenida de la curva de calibracin (Fig. 5C), ya que este cruce representa la
condicin de equilibrio de flujos de Ca2+ entre la vacuola y el bao, cuando la diferencia en el
potencial electroqumico para Ca2+ es nulo.
Microelectrodos ionoselectivos
3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la tcnica
tradicional de electrodos ionoselectivos.
La tcnica estndar de microelectrodos ionoselectivos incluye el uso de microelectrodos de
doble barril: uno para la determinacin del potencial a travs de la membrana, y un segundo
para la medicin del potencial del electrodo con la resina ionoselectiva. La substraccin del
potencial consecuentemente permite calcular la actividad corregida del ion registrado.
Desafortunadamente, esta tcnica no se encontraba disponible, por lo que fue necesario el uso de
43
dV
J = cuzFg
dx
44
donde, J flujo neto del ion, c concentracin del ion, u movilidad del ion, F constante
de Faraday, y asumimendo que el potencial electroqumico d, es regitrado por el electrodo como
d = zFgdV , donde g el factor de subestimacin del valor d por la caracterstica interna del
electrodo dV. El factor dx depende de la geometra de la superficie del objeto y para el caso de un
objeto esfrico (la vacuola) de radio r, se define como
1
1
dx = r 2
.
r + x r + x + dx
(Newman, 2001).
Los electrodos para la tcnica fueron elaborados en varios pasos que constituyeron su
estiracin, secado, el recubrimiento con silicona, el rellenado con la solucin apropiada y el
rellenado de la punta del electrodo con el intercambiador ionico lquido (liquid ion exchanger
LIX; cocktail 21048, Fluka, para Ca2+). Despus de esto, los electrodos fueron calibrados
utilizand soluciones-estndares con concentraciones de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM. El objeto de
estudio lo constituyeron vacuolas de betabel, aisladas como fue mencionado anteriormente.
45
m
Citosol
Vacuola
dx
x
4.1 Introduccin.
La aplicacin de una fila de concentraciones de Ca2+ para el estudio de la calibracin del
canal SV revel algunos datos similares a los presentados en varios trabajos anteriores. No
obstante, a diferencia de estos ltimos, el estudio del efecto de las altas y bajas concentraciones
de iones individuales tanto en el lado vacuolar, como en lado citoslico, mostr algunas
diferencias que impidieron el cumplimiento de unos de los objetivos del presente proyecto la
estimacin del calcio vacuolar libre, utilizando el canal SV de vacuolas de raz de betabel como
reportero interno de la actividad de Ca2+. Sin embargo, el mismo principio pudo ser exitosamente
aplicado con la tcnica MIFE de medicin de flujos y originalmente no diseada para la medicin
de concentraciones inicas intramembranales.
4.2 Resultados.
4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar.
El valor de la osmolaridad del jugo celular fue medido durante los meses de las cuatro
estaciones del ao y se encontraba entre 212 y 680 mOs, con un valor promedio de 498 96 mOs
(n=59) (Fig. 7). De todas las races, para el trabajo fueron escogidas las que presentaban una
mayor osmolaridad del jugo celular, ya que se asuma que stas tenan un mayor potencial
metablico para la expresin de protenas y, particularmente del canal vacuolar lento SV. Esta
asuncin coincide con cierta correlacin notada entre la amplitud de las corrientes macroscpicas
del canal SV en los parches y la osmolaridad determinada del contenido vacuolar, disminuyendo
ambos al iniciar la poca de lluvia. El pH del jugo celular tambin present variaciones entre 6.4
0.2 en abril 2004 (n = 9, entre 6.16 y 6.73) y 6.0 0.3 en febrero 2005 (n = 4, con valores entre
5.85 y 6.31). Estos valores fueron utilizados a continuacin para la preparacin de las soluciones
vacuolares.
47
750
500
250
10
12
mes
49
0Ca
0.05Ca
250 pA
0.5 s
0.5 s
0.1Ca
0.2Ca
0.5 s
1s
0.5Ca
1.0Ca
1s
B
-200
1s
10
I / pA
-200
-100
100
10
I / pA
-100
100
200
V / mV
V / mV
-10
-10
-20
-20
1Ca
0Ca
200
-30
aplicadas en los experimentos en configuracin attached. A su vez, este potencial fue corregido
por el valor del potencial de unin lquida, originado por la presencia dentro de la vacuola de
grandes aniones orgnicos, y que constituy cerca de +8 mV. La dependencia del potencial a
travs de la membrana vacuolar es mostrada en la (Fig.9). Finalmente, fueron determinados los
potenciales de 1% de canales activos (V1%), resumidos en la Tabla 13.
TABLA 13. Potencial de 1% de canales SV abiertos en parches en configuracin attached en
dependencia de la concentracin de Ca2+ aplicada en el bao.
Concentracin de Ca2+ en el bao, mM
V1%, mV
14.4
0.05
2.1
0.1
11.3
0.2
3.9
0.5
14.9
1.0
+5.3
2+
51
10
V / mV
-5
-10
0.0001
0.01
lg[Ca2+]bao / mM
utilizada para la medicin del Ca2+ vacuolar. No obstante, el mismo principio3 pudo ser aplicado
con la tcnica MIFE (Fig.10A), donde, sin embargo, no eran las corrientes del canal SV el evento
monitoreado, sino el flujo de Ca2+ a travs de la membrana vacuolar, posiblemente causado por la
actividad del canal SV. Como es mostrado en la Fig. 10B, el flujo registrado fue sensible al Zn2+
(100 M) bloqueador inespecfico del canal SV (Hedrich y Kurkdjian, 1988). El flujo
remanente registrado en la aplicacin de Zn2+ pudiera corresponder a otros canales permeables
para Ca2+, hasta ahora desconocidos. Adicionalmente, esta modificacin de la tcnica MIFE
(originalmente diseada para la medicin de flujos), aplicada en condiciones de ~5 M Ca2+
citoplsmico (por la contaminacin), permiti estimar la corriente del canal SV, acarreada por
Ca2+ (alrededor de 1 pA para una vacuola tpica de 50 m de dimetro), asumiendo que este
ltimo cruza el tonoplasto solamente a travs del canal SV (Fig.10A).
TABLA 14. Concentraciones de los cationes fisiolgicos ms relevantes en vacuolas de betabel
(Beta vulgaris L.).
Ion
Tcnica de medicin
125.4 3.7 mM
Microelectrodos K+-selectivos
Na+
62 mM
Fotometra de flama
Mg2+
8.3 0.7 mM
Ca2+
0.196 0.179 mM
0.21 mM
El efecto del cambio de las concentraciones inicas vacuolares fue estudiado por separado y
en conjunto, para determinar sus efectos sobre la actividad final del canal SV.
4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activacin del canal SV.
El efecto del pH sobre la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal
SV fue determinado en condiciones de 100 mM KCl simtrico, 2 mM Ca2+ y pH 7.5 en el lado
citoplsmico y aplicando en el lado vacuolar una serie de concentraciones de Ca2+ (0-10 mM) en
un fondo de pH 6.4 y pH 5.5. Las corrientes generadas en estas condiciones se muestran en la
Fig. 11. La dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura obtenida fue satisfactoriamente
descrita por el modelo propuesto por Pottosin y col. (2004; Fig.13A) con valores de cargas de
3
Aplicacin de una fila de concentraciones de Ca2+ en el bao y determinacin, mediante interpolacin, del punto de
equlibrio, donde el flujo neto de Ca2+ a travs del tonoplasto debe ser nulo. Despus, utilizando la ecuacin de Nernst
determinacin del calcio vacuolar libre, teniendo en cuenta el potencial a travs del tonoplasto. Ver p.3.2.9 de
Metodologa, para ms detalles.
53
2
2+
Reversin de flujo de Ca
a travs de la membrana vacuolar
0
2+
Flujo de Ca , correspondiente
2+
a condiciones de 5 mM Ca citoslico
-2
-4
100
Flujo de Ca / nmol m s
-2
-0.5
2+
[Ca2+] / mM
-1
10
-1.0
-1.5
testigo
+1.5 mM Mg
2+
+0.1 mM Zn
2+
A. Aplicando en el bao soluciones con diferentes valores de [Ca ], fue obtenida la inversin del flujo de
Ca2+ a travs de la membrana vacuolar en la concentracin alrededor de 0.2mM, estimada como cercana
a la concentracin de Ca2+ dentro de la vacuola debido al pequeo potencial a travs del tonoplasto. Es
notable la activacin consecutiva del flujo de Ca2+ con el aumento de la concentracin de [Ca2+]cit hasta
0.05mM que, probablemente, representa la activacin del canal SV. En este caso, el valor del flujo a travs
del tonoplasto en condiciones de 0 Ca2+ en el bao, representa el flujo neto de Ca2+ a travs del canal SV
en condiciones de 5 mM de Ca2+, por la contaminacin del agua de las soluciones y la imposibilidad de
utilizar agente quelantes. B. Evidencias de que el flujo registrado es originado por el canal SV. La
2+
2+
aplicacin de 1.5 mM Mg en el citosol aumenta el flujo de Ca registrado en comparacin con el testigo
(probablemente, mediante la coactivacin del canal; ver texto). Al mismo tiempo, la aplicacin de 0.1 mM
2+
de Zn (bloqueador inespecfico del SV) causa la inhibicin del flujo por ms del 50%. El flujo restante
probablemente pertenece a los canales SV no bloqueados y/u otros canales, permeables a Ca2+, no
identificados hasta ahora.
Los valores del flujo son el promedio de 6-8 mediciones en vacuolas individuales.
2+
1s
pH 6.4
250pA
pH 5.5
500 pA
0Ca
0.01Ca
500 pA
0.1Ca
1.0Ca
10.0Ca
compuertas (z1=0.6 y z2=2.9), similares a las reportadas en ese trabajo (z1=0.7 y z2=2.9; Pottosin
y col., 2004), por lo tanto, el esquema general de las transiciones del canal del estado cerrado al
estado abierto no es afectado por la disminucin del pH vacuolar. La acidificacin del lado
vacuolar a pH 6.4 y 5.5 no tuvo efecto sobre la amplitud de las corrientes de los canales unitarios
(Fig.12). En contraste, la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal mostr
un comportamiento particular con la disminucin del pH vacuolar (Fig.13A,B) en comparacin
con datos reportados anteriormente para un rango similar de Ca2+ vacuolar, pero en condiciones
de pH 7.5 (Pottosin y col., 2004). En presencia de bajas (0 mM) concentraciones de Ca2+, la
disminucin del pH desde 7.5 (referencia) hasta 5.5, no tuvo efecto notable sobre el potencial del
umbral de activacin del canal y sobre la dependencia de voltaje de su probabilidad de apertura
(Fig.13). Sin embargo, en el rango de concentraciones de 0.05-1.0 mM de Ca2+ stos mostraron
una consecutiva desensibilizacin al nivel de Ca2+ con la disminucin del pH, revelndose a pH
5.5 como una meseta en la dependencia del potencial V1% en funcin del Ca2+ aplicado en el lado
vacuolar (Fig.13B), con un potencial V1% promedio de 14.7 4.4 mV (valores entre 19.5 y
13.5 mV para un cambio de concentracin de Ca2+ en el rango 0.05-1 mM; comparar con el
desplazamiento del potencial V1% desde 63.2 hasta 21.0 en el cambio de concentracin de Ca2+
vacuolar de 0.01 a 0.05 mM.).
4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activacin del canal SV en
condiciones de pH fisiolgico.
En nuestro trabajo, las vacuolas de betabel presentaron una concentracin de Na+
aproximadamente igual a la mitad de sta para K+ (ver Tabla 14, p.4.2.3). La regulacin del canal
SV por este ltimo cation, reportada previamente en el trabajo de Ivashikina y Hedrich (2005; ver
tambin p.1.2.2.5), y del Ca2+ vacuolar fue investigada en detalles en nuestro estudio. En
presencia de 0 Ca2+ vacuolar y en el fondo fisiolgico de K+ (125 mM), la aplicacin de Na+ en
concentraciones cercanas a las fisiolgicas (62 mM), caus un desplazamiento del potencial V1%
desde 61 mV hasta 48 mV (Fig.14A). Este efecto de disminucin de la probabilidad de
apertura del canal SV es evocado por Na+ de manera especfica, ya que la sustitucin de Na+ por
una concentracin equivalente de K+ no result en un desplazamiento del umbral de igual
magnitud (Fig.14A). A diferencia de esto, la probabilidad de apertura del canal en presencia en el
lado vacuolar de 62 mM Na+ y 0.5 mM Ca2+ en el fondo de 125 mM K+, es mayor, en
comparacin con la aplicacin de la misma concentracin de calcio pero en el fondo de una
56
pH 6.4
-200
10
I / pA
-100
100
10Ca
200
-10
-20
2.0Ca
1.0Ca
-30
0.5Ca
0.2Ca
0.01Ca
0.05Ca
0Ca
-40
pH 5.5
-200
10
I / pA
-100
100
10Ca
200
-10
-20
2.0Ca
1.0Ca
0.5Ca
0.2Ca
0.05Ca
0Ca
0.01Ca
-30
-40
Fig.12 Efecto del pH vacuolar sobre la relacin corriente-voltaje del canal SV unitario.
Las curvas corriente-voltaje fueron obtenidas con la aplicacin de rampas de voltaje de +200 a -200 mV
de 15 ms de duracin, en condiciones iguales a las de la Fig.10.
Aparentemente, el pH vacuolar aplicado no tuvo efecto sobre las corrientes del canal unitario, por lo que
los efectos del pH se deben al cambio en la probabilidad de apertura del canal y no involucran el bloqueo
de ste. Cada curva representa el promedio de n>20 registros.
A
NPo / NPomax
0 Ca
0.01 Ca
0.05 Ca
0.5 Ca
2 Ca
10 Ca
0.01
0.0001
-50
50
100
150
V / mV
B
60
pH 7.5
V1% / mV
pH 6.4
30
pH 5.5
0
-30
-60
-7
10 10
-5
0.01
0.1
Ca
2+
10
/ mM
A
NPo / NPomax
0 Ca
0.01
125 K
187 K
125 K + 62 Na
0.0001
-100
-50
50
100
150
V / mV
B
NPo / NPomax
0.5 Ca
0.01
125 K
187 K
125 K + 62 Na
0.0001
-100
-50
50
100
150
V / mV
60
A
NPo / NPomax
0 Ca
0.01 Ca
0.05 Ca
0.1 Ca
0.2 Ca
0.5 Ca
1 Ca
2 Ca
0.01
0.0001
-100
-50
50
100
150
V / mV
V1% / mV
60
30
pH 5.5
pH 5.5 +125 K
+62 Na +8 Mg
attacheds
0
-30
-60
0.01
0.1
10
Ca2+ / mM
2+
2+
Ver tambin Hawkesford M.J., Miller A.J. Ion-coupled transport of inorganic solutes. En: Blatt M.R. (Ed.)
Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 106.
62
1s
250pA
A
160
140
Ca 0.1 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+
120
100
80
60
O/Out
B
160
140
Ca 20 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+
120
100
80
60
1s
250pA
160
140
120
Ca 0.1 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+
100
80
60
O/Out
B
160
Ca 20 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+
140
120
100
80
60
Fig.17 Registros de corrientes del canal SV en parches aislados en condiciones que modelan
su entorno fisiolgico vacuolar y citoplsmico. II.
Los registros fueron obtenidos en un parche aislado en condiciones que modelan las fisiolgicas: la solucin
vacuolar contena (en mM): 125 K+, 62 Na+, 8 Mg2+, 0.25 Ca2+ y pH 5.5, determinadas como se menciona en el
+
2+
2+
p.4.2.3; la solucin citoplsmica contena 100 mM K y 0.1 20 mM Ca en el fondo de 0.5 1.5 mM Mg y
pH 7.5. Los registros fueron obtenidos desde un potencial de mantenimiento de -100 mV aplicando pulsos de
2+
voltaje hasta +160 con un paso de 20 mV. A,B - Registros en presencia de 1.5 mM Mg citoslico y 0.1 mM (A)
2+
20 mM (B) de Ca . Al igual que en la Fig.16A, la corriente del canal SV en presencia de 0.1 mM de Ca2+
citoslico es una fraccin de la corriente total, evocada por la presencia de 20 mM de Ca2+. No obstante, en
comparacin con la Fig.16A,B se nota una mayor amplitud de las corientes originadas, probablemente, por el
efecto activador del Mg2+ citoslico. Para ms claridad, los registros se muestran reflejados verticalmente, pero
representan las corrientes salientes del citoplasma, como establece la convencin de Bertl y cols., (1992).
1s
250pA
A
160
140
120
Ca 0.1 mM,
Mg2+ 0,5 mM
2+
100
80
60
Attached
B
160
140
Ca 20 mM,
2+
Mg 0.5 mM
2+
120
100
80
60
40
1s
250pA
A
160
140
120
Ca 0.1 mM,
Mg2+ 1,5 mM
2+
100
80
60
Attached
B
160
Ca 20 mM,
2+
Mg 1,5 mM
2+
140
120
100
80
60
40
67
A
NPo / NPomax
1
0.01
Parches aislados
0.0001
0.1mM Ca , 1.5 Mg
2+
2+
20mM Ca , 1.5 Mg
2+
1e-006
2+
1e-008
50
100
V / mV
2+
150
200
NPo / NPomax
1
0.01
Parches attached
0.0001
1e-006
1e-008
50
100
150
200
V / mV
4.3 Discusin.
A diferencia de estudios anteriores, en los cuales el canal SV emerga como un canal
verstil que responde a la aplicacin de diferentes estmulos y reagentes, los datos de nuestro
trabajo revelan un alto nivel de control de la actividad del canal SV por su entorno inico, que se
revela en una buferizacin de la actividad del canal en rangos bastante estrechos, en los cuales
la probabilidad de apertura del SV es relativamente insensible incluso al nivel de Ca2+ vacuolar
en el rango micromolar-milimolar uno de los factores propuestos como de mayor importancia
para la determinacin de la actividad del canal (Pottosin y col., 2004).
Efectos del pH sobre la actividad del canal SV.
El efecto del pH vacuolar sobre la probabilidad de apertura del canal SV fue estudiado en dos
trabajos, en clulas de guarda de Vicia (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y en vacuolas de
Hordeum (Pottosin y col., 1997). En el primer caso fue mostrada una disminucin de la
probabilidad de apertura del canal con la acidificacin del contenido vacuolar, aunque sta
disminucin fue obtenida en presencia de 1 mM de Ca2+ y 5 mM de Mg2+ dentro de la vacuola.
Pottosin y col. (1997, en Hordeum) sealaron que en presencia de concentraciones de Ca2+ en el
rango 0.05-2 mM de Ca2+ dentro de la vacuola, la disminucin del pH vacuolar no tiene efecto
sobre la probabilidad de apertura del canal SV (a diferencia del desplazamiento del umbral de
activacin de 20 a +40 mV en la disminucin del pH vacuolar de 7.5 a 5.5, en ausencia de Ca2+
vacuolar).
En el presente estudio es mostrado que la disminucin del pH vacuolar no tiene efecto sobre el
potencial V1% en condiciones de nulo calcio vacuolar, lo que significa que el valor de pK para los
grupos funcionales (sitios de unin con Ca2+, ver abajo) en el caso de vacuolas de raz de betabel
no vara para los estados cerrados y abierto del canal y, por lo tanto, la protonizacin no ocurre
preferentemente en ninguno de los estados. En el rango de Ca2+ vacuolar de 0.05-1.0 mM en la
dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal aparece una meseta en la curva de
calibracin del potencial V1% (Fig.13B). Este fenmeno pudiera deberse a que en condiciones de
pH vacuolar bajo disminuye la afinidad al Ca2+ de uno de los estados cerrados del canal,
probablemente por la competencia entre dos cationes H+ y Ca2+ (Schulz-Lessdorf y Hedrich,
1995; Pottosin y col., 1997). El cambio de pH de 7.5 a 5.5 en el lado vacuolar caus una
69
disminucin poco significativa de la corriente del canal unitario SV (Pottosin y col., 2004;
presente estudio, Fig.12) al igual que en el trabajo de Schulz-Lessdorf y Hedrich (1995).
Efectos del Na+ vacuolar sobre la actividad del canal SV
Recientemente, Ivashikina y Hedrich (2005) en Arabidopsis mostraron que el aumento de la
concentracin del Na+ vacuolar causa el desplazamiento del umbral de activacin del canal hacia
potenciales ms positivos, disminuyendo as la probabilidad de apertura del canal (ver p.1.2.2.2
para ms detalles), lo que podra sirvir como mecanismo para la disminucin de la liberacin
proveniente de la vacuola de excedentes txicos de Na+ al citoplasma durante el estrs salino. De
manera similar, nuestros datos sealan que, en ausencia de Ca2+ en el lado vacuolar el Na+ causa
un desplazamiento especfico de la probabilidad de apertura del canal a potenciales ms positivos
(ms significativo que el provocado por los cationes monovalentes en general, p.e. K+ [Fig.13A],
o cationes monovalentes orgnicos [Pottosin et al., 2005]). Sin embargo, el estudio de los efectos
conjuntos de Na+ vacuolar en presencia de Ca2+ vacuolar revel, ms que nada, una
desensibilizacin de la dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal SV al
nivel de Ca2+ cercano al presente en la vacuola (Fig.14B). La naturaleza de este efecto especfico
del Na+ vacuolar se desconoce, pero pudiera tratarse de una competencia entre el Na+ y el Ca2+
vacuolares por un sitio de unin al canal.
A pesar de la ambigedad de la modulacin del canal SV por Na+ vacuolar, este efecto
requiere un estudio ms detallado, ya que en condiciones fisolgicas potencialmente puede jugar
un papel importante en la resistencia de las plantas al estrs salino.
Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes para la regulacin de la actividad
del canal SV
La actividad del canal SV en condiciones inicas vacuolares cercanas a las fisiolgicas no ha
sido previamente estudiada. Como muestra la Fig.15, en estas condiciones la actividad del canal
SV se encuentra rigurosamente mantenida en un estrecho rango, que, en trminos de un
desplazamiento de la dependencia de voltaje del canal, representa menos de 20 mV alrededor del
rango de Ca2+ vacuolar estimado. Posiblemente, esta fuerte buferizacin de la actividad del
canal SV le permite desarrollar sus funciones en las diversas condiciones presentes en las
vacuolas de distintos tejidos de las plantas, caracterizadas, al menos, por una gran diferencia en la
concentracin total de Ca2+ presente (ver.p1.1.2).
70
Adicionalemente, para fines de nuestro estudio, este resultado signific la imposibilidad del
uso del canal SV como reportero intrnseco de la actividad del Ca2+ dentro de las vacuolas lticas
de betabel, como muestra la colocacin del potencial V1% de los registros realizados en parches
attached sobre la curva de calibracin del canal SV. No obstante, existe la posibilidad de que el
mtodo propuesto para la medicin del Ca2+ vacuolar pudiera ser aplicado a otros objetos de
estudio, por ejemplo vacuolas de clulas aleurnicas, que, a diferencia de las vacuolas lticas,
presentan un pH lumenal neutro, y en las cuales se ha reportado la presencia de canal SV (Bethke
y Jones, 1997).
Modelacin del entorno inico del canal SV y estimacin de la actividad del canal SV. La
elevacin fisiolgica del Ca2+ citoslico es suficiente para evocar la liberacin de Ca2+ inducida
por Ca2+.
La modelacin de las concentraciones de los cationes fisiolgicos ms importantes que
regulan la actividad del canal SV requiri la determinacin previa de esas concentraciones, ya
que a pesar de que son ampliamente especuladas en la bibliografa, existen contados estudios
dedicados a la determinacin de la actividad inica en compartimientos especficos. Un ejemplo
de sto es la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, postulada como de rango milimolar, despus
de la medicin realizada por Felle (1988) en vacuolas de dos especies de plantas. En nuestro
estudio fue determinado que, al menos en las vacuolas de las races de betabel examinadas, la
concentracin de Ca2+ libre es menor en un orden de magnitud a lo establecido en la literatura
(Tabla.15).
Adicionalmente, utilizando la tcnica de microelectrodos ionoselectivos fue determinada la
concentracin vacuolar de otro cation fisiolgico abundante y pobremente estudiado Mg2+,
que, a diferencia del Ca2+, en nuestro objeto de estudio se encuentra en niveles milimolares
(Tabla.14). Lamentablemente, la concentracin citoslica de Mg2+ tampoco ha sido objeto de
estudios detallados en clulas de plantas superiores, por lo que para la estimacin de la actividad
TABLA 15. Comparacin de la actividad de Ca2+ dentro de la vacuola, reportada en diferentes
objetos de estudio.
Valor de [Ca2+]vac / mM
2.3
1.5
0.2
Objeto de estudio
Riccia fluitans (rizoides)
Zea mays (races)
Beta vulgaris (races)
Referencia
Felle, 1988
Presente estudio
71
72
Total de canales
por vacuola
NPo / NPomax
1
10,000
0.01
100
0.0001
1
1e-006
0.01
1e-008
50
150
100
200
V / mV
20mM Ca2+, 1.5 Mg2+
0.1mM Ca , 0.5 Mg
2+
2+
canales SV calculado de ms de 60,000 por vacuola, lo que constituye un valor mayor al nmero
de canales, tomado como referencia en la literatura (Pottosin y Schnknecht, 2007).
Un clculo similar para los datos, obtenidos con la tcnica MIFE, nos devuelve:
I ( pA/vacuola ) = zFJA = 2 9.65 10 4 3 109 7.85 109 = 4.55 ,
donde z (sin unidad) carga elctrica del ion analizado; +2 para Ca2+; F (Coul/mol)
constante de Faraday (carga elctrica de un mol de sustancia; 9,65104 Coul/mol); J (mol m-2 s-1)
flujo de iones; en nuestro caso flujo de Ca2+, registrado con la tcnica MIFE; A
(m2/vacuola) rea de la membrana vacuolar.
Las corrientes de Ca2+ calculadas, salientes de la vacuola, son del mismo orden de magnitud;
la diferencia entre los dos valores determinados podra ser causada por: i) la contribucin de
canales hasta ahora desconocidos con permeabilidad para Ca2+ (diferentes del SV); 2) la
sobreestimacin del flujo de Ca2+ por la tcnica MIFE; 3) posibles errores de extrapolacin al
rango de bajas probabilidades de apertura y/o 4) por la subestimacin de la fraccin de la
corriente de Ca2+ en condiciones fisiolgicas. Sin embargo, los valores estimados son del rango
de pA, y por lo tanto pueden causar una significante y rpida elevacin del Ca2+ en el citoplasma
(Pottosin y Schnknecht, 2007). En otras palabras, la elevacin del Ca2+ citoslico es suficiente
para provocar la liberacin de calcio inducida por calcio, mediada por los canales SV de la
membrana vacuolar.
Por otra parte, en condiciones fisiolgicas deben existir factores-reguladores adicionales que
controlan esta activacin, ya que como es mostrado en el p.1.1.4, Tabla 1, no todos los estreses
que causan la elevacin del Ca2+ citoslico provocan la liberacin de Ca2+ desde la vacuola. El
estudio de las condiciones en las que se origina la liberacin de Ca2+ desde la vacuola durante
esos estreses (fro, sequa) pudiera, tal vez, revelar el mecanismo regulador adicional que le
permite al SV u otro canal permeable a Ca2+, hasta ahora desconocido, participar en la liberacin
de Ca2+ inducida por Ca2+.
74
5.1 Introduccin.
En general, la tcnica de deshidratacin-rehidratacin mostr ser adecuada para la
formacin de liposomas gigantes, aunque se tuvieron ciertos problemas de carcter tcnico
respecto a la optimizacin desde la cantidad de membrana a utilizar, hasta los tiempos y las
condiciones requeridas para la obtencin de liposomas adecuadas para la realizacin de registros
con la tcnica de patch clamp. Con visualmente buenas preparaciones fue logrado obtener sellos
de alta resistencia (2-7 GOhm) con un alto rendimiento (ms del 50%). En stas pudieron ser
obtenidas las cuatro configuraciones bsicas para la realizacin de registros con la tcnica patch
clamp: attached, inside-out, un anlogo del whole-cell liposoma entera, y outside-out. Las
configuraciones attached e inside-out presentaron resultados idnticos (Fig.22), mientras que la
configuracin liposoma entera mostr en la mayora de los casos un alto nivel de fuga
inespecfica. Probablemente esto se debe a que las liposomas no representan vesculas
completamente cerradas y, por lo tanto, carecen de potencial de membrana y las concentraciones
inicas en su interior son iguales a las del bao. Entonces, las configuraciones recomendadas para
el estudio con la tcnica de patch clamp son las de parche aislado inside-out y outside-out. La
utilizacin de estas dos orientaciones inversas de la membrana podra ayudar a investigar los
efectos de moduladores desde ambos lados de la membrana del RE, as como verificar la
orientacin preferente de la membrana de los liposomas gigantes.
5.2 Resultados.
Finalmente, se pudo caracterizar un canal catinico del retculo endoplsmico no reportado
previamente. Algunas de las carctersticas de este novedoso canal son mencionadas a
continuacin.
75
5.2.1 Selectividad.
La selectividad del canal fue estudiada aplicando la tcnica de rampas para determinar el
potencial de inversin de la corriente del canal. Aplicando pulsos de 15 ms de duracin de +150 a
-150 mV fueron registradas las corrientes de canales unitarios en gradientes de 10K/100K o
10K/100Na (pipeta-bao, respectivamente). Esto permiti demostrar la selectividad para cationes
(PCl/PK < 0.03) del nuevo descubierto canal y la ausencia de selectividad especfica para K+ o Na+
(Fig.22).
Estudios preliminares de la permeabilidad a Ca2+ fueron realizados mediante la aplicacin de
un gradiente bi-inico (150Ca/100K, respectivamente para la micropipeta y el bao) y la
obtencin de la curva corriente-voltaje del canal unitario. El potencial de inversin obtenido en
estas condiciones es de cerca de 30 mV (Fig. 23) y corresponde a una permeabilidad relativa PCa /
PK 3.5. La conductancia del canal para Ca2+ y K+, determinada en estas condiciones, fue de 157
pS para ambos.
5.3 Discusin.
Como es mostrado en este trabajo, la combinacin de las tcnicas de patch-clamp y de
lipososmas gigantes permite realizar de una manera efectiva el estudio de canales inicos
localizados en la membrana del retculo endoplsmico. A continuacin son mencionados algunas
de las limitantes y ventajas del mtodo desarrollado.
77
I / pA
10
100 KCl
150 CaCl2
-10
Er = 30 mV
-20
150
-100
-50
50
100
V / mV
2+
existe cierta incertidumbre en el tipo de configuracin en la que son realizados los registros
con la tcnica de patch-clamp.
Las ventajas principales del mtodo desarrollado que permiten posicionarlo como el ms
apropiado hasta el momento para el estudio de canales inicos de las membranas del retculo
endoplsmico, son:
La rapidez relativa de la tcnica. Debido a que las protenas del retculo endoplsmico no
caractersticas del canal en un entorno ms cercano al natural, sin lpidos adicionales. Esto
permite realizar los registros electrofisiolgicos en condiciones lo ms cercanas posible a
las que se dan en el retculo endoplsmico intacto.
Los registros presentados ms arriba muestran la presencia en liposomas gigantes de retculo
endoplsmico de un canal catinico que no conduce aniones (Cl) y posee una alta permeabilidad
para K+, Na+ y Ca2+, similar al canal formado por el receptor de ryanodina en el retculo
endoplsmico de clulas animales. Sin embargo hay diferencias cuantitativas entre estos dos
canales, principalmente, en valores de conductancia para K+ y la sensibilidad al Ca2+.
La dependencia de voltaje del canal estudiado en betabel (Fig.24) es diferente a la reportada
para los canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico de Bryonia y Lepidium: BCC1 y
LCC1 son activados nicamente por potenciales positivos; nuestro canal no presenta este tipo
80
rectificacin (Klsener y col., 1995; 1997; 1999). Por lo tanto, se puede afirmar que fue
registrado un canal novedoso, cuyo mecanismo de funcionamiento y sensibilidad a moduladores
quedan por ser estudiados. Al igual que en los trabajos de Klsener y col. (1995) no fue detectada
ninguna actividad de canales inicos en la agregacin de IP3 (2 M). Estos resultados pudieran
sugerir que el receptor de IP3 no forma parte de la estructura del canal permeable a Ca2+, sino que
pudiera estar acoplado a ste ltimo, lavndose durante el proceso de purificacin de la fraccin
membranal del retculo endoplsmico. Otra opcin pudiera ser que los canales-receptores de IP3
no se encuentran presentes (al menos, en cantidades determinables con las tcnicas
electrofisiolgicas actuales) en los tejidos de la raz napiforme de betabel, ya que se ha
demostrado que en preparaciones vesiculares el IP3 es capaz de evocar la liberacin del Ca2+
almacenado (aunque en otra fraccin membranal y en otra especie de planta; Schumaker y Sze,
1987).
81
6. Conclusiones.
1. El nivel de Ca2+ libre en vacuolas de raz de betabel (Beta vulgaris) es de alrededor de 0.2 mM
un valor 10 veces menor, que el establecido en la literatura para las vacuolas de clulas
vegetales.
2. En condiciones que modelan el entorno inico fisiolgico vacuolar del canal SV, ste presenta
una sensibilidad disminuida a la variacion de Ca2+ vacuolar en el rango fisiolgico, por lo que
no puede ser utilizado como reportero intrnseco para la medicin de la actividad del Ca2+ en
vacuolas de raz de betabel. En estas condiciones (caracterizadas, bsicamente, por los niveles
vacuolares de cationes fisiolgicos abundantes K+, Na+, Ca2+, Mg2+ y H+), la actividad del
canal SV se encuentra mantenida (buferizada) en un rango estrecho.
3. La comparacin de los registros obtenidos (i) mediante la modelacin del entorno inico
fisiolgico vacuolar y citoplasmtico del canal SV en parches aislados, y (ii) mediante la
modelacin del entorno inico citoplasmtico del canal SV en parches attached, revela la
semejanza de la dependencia de la probabilidad de apertura del canal SV en ambos casos. La
elevacin del Ca2+ citoslico en el rango 0.1-20 M no afecta a la dependencia de voltaje del
canal; ms bien incrementa el nmero de canales activables por voltaje.
4. Datos obtenidos con las tcnicas de MIFE y patch-clamp sugieren que en condiciones de Ca2+
citoslico elevado (varios M) la actividad de los canales SV permite una liberacin de Ca2+
de alrededor de picoamperios por vacuola; esta corriente es suficiente para mantener la
liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC).
5. El uso combinado de las tcnicas de liposomas gigantes y de patch clamp (por primera vez
en clulas vegetales) permiti registrar canales inicos en membranas del retculo
82
83
Agradecimientos
84
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101
Appndice
TABLA I. Obtencin de bajos valores de calcio libre para registros en configuracin attached.
[Ca2+] deseada / M
CaCl2 / M
EGTA / mM
(Kd 3.38e-05)
HEDTA / mM
(Kd 5.53e-06)
[Ca2+] libre / M
<0.1
50
660
2
-
~0.03
50.6
TABLA II. Obtencin de bajos valores de calcio libre para la determinacin del efecto del pH sobre
[Ca2+] deseada / M
CaCl2 / M
EGTA / mM (Kd
HEDTA / mM (Kd
5.53e-06, pH 6.4)
EDTA / mM
[Ca2+] libre/ M
<0.1
10
50
<0.1
10
50
2,600
4,250
0
650
660
2
1
-
5
5
5
-
~0.009
9.67
47.5
~0.03
10.2
50.6
5.5
6.4
3.38e-05, pH 6.4)
TABLA III. Obtencin de bajos valores de calcio libre para la determinacin del efecto conjunto de
los mayores cationes fisiolgicos sobre la actividad del canal SV (pH 5.5).
[Ca2+] deseada / M
CaCl2 / mM
EDTA / mM
(Kd Ca2+ 9.0e-06)
[Ca2+] libre / M
<0.1
10
2.6
5
5
~0.03
9.0
condiciones fiosolgicas.
Mg2+ /
mM
0.5
1.5
[Ca2+]
deseada /
M
MgCl2 / mM
CaCl2 / mM
(KdCa 3.4e-04,
KdMg 1.1, pH 5.5)
EGTA / mM
NTA / mM (KdCa
0.1
2.0
2.9
0.52
0.1
20
2.5
0.76
0.51
21.9
0.1
3.5
2.0
2.9
2.5
1.52
0.1
20
3.5
0.28
1.52
22.7
6,73e-03, KdMg
1.86e-01, pH 5.5)
102