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RESUMEN
En este trabajo se ha analizado el proceso de reaccin acrosmica de muestras congeladas de semen
bovino cultivados en tres medios de cultivo utilizados para la fecundacin in vitro TALP, TCM-199 y BO. El
estado del acrosoma y la viabilidad espermtica fue evaluada mediante una doble tincin fluorescente con
lectinas unidas a fluoresceina y ioduro de propidio. El medio utilizado y el tiempo de cultivo ejercen un efecto
significativo sobre los parmetros estudiados. As el porcentaje de espermatozoides con acrosomas intactos es
superior en el medio TCM-199 (valor medio 30.931.18) que en TALP (28.791.40) o BO (26.531.31). El
medio TALP es el que induce un mayor porcentaje de espermatozoides con reaccin acrosmica (valor medio
TALP 9.330.81, TCM-199 6.760.64 BO 7.330.54), mientras que los espermatozoides cultivados en el
medio TCM-199 presentan un retraso en el patrn de reaccin acrosmica.
Palabras clave: bovino, espermatozoide, reaccin acrosmica, fecundacin in vitro, medio de cultivo,
lectinas, ioduro de propidio
SUMMARY
Frozen bull semen was thawed and diluted in three different in vitro fertilization media: TCM-199, TALP
and BO. Assessment of cytoplasmicc membrane integrity and proportion of acrosome reacted sperm were
accomplished by FITC-PNA lectin and PI staining in a epi-fluorescent microscope. The results showed that
the number of intact, acrosome reacted and damaged membrane spermatozoa was significantly affected by
both IVF medium and time of culture (p<0.001). So, the number of sperm with intact acrosome and membrane
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AN. VET. (MURCIA) 19: 15-22 (2003). ACROSOME REACTION, BOVINE. GARDN, J.C., GADEA, J.
was higher when was cultured in TCM-199 (mean value 30.931.18) than in TALP (28.791.40) and BO
(26.531.31) and it was decreasing during the culture time. For the number of reacted acrosome spermatozoa
was significantly higher for TALP than the others media and it was increasing during the culture period (mean
value TALP 9.330.81, TCM-199 6.760.64, BO 7.330.54),. In relation to died sperm, BO was significantly
higher than the others media and the relation between the number of acrosome reacted and total intact
membrane spermatozoa was lower for TCM-199 than the other; finally, the process of acrosome reaction was
slower than BO and TALP.
Keywords: bull, spermatozoa, acrosome reaction, in vitro fertilization, culture medium, lectine, propidium
iodide
INTRODUCCIN
Sobre el xito de la fecundacin in vitro (FIV)
en la especia bovina incide una amplia variedad
de factores (revisado por Brackett y Zuelke, 1993;
Van Soom y de Kruif, 1996; Shamsuddin et al.,
1996). De entre todos ellos, destaca por su importancia la composicin de los medios de cultivo utilizados en los procesos de produccin de
embriones in vitro. De forma tradicional se ha
empleado un medio de cultivo especfico para
cada una de las fases del sistema de produccin
in vitro de embriones (maduracin, fecundacin
y cultivo embrionario), por lo que se busca la
posibilidad de utilizar un nico medio que cumpla los requisitos de cada una de las fases (Gandhi
et al., 2000). Por otra parte, sabemos que el medio utilizado en la FIV podra tener una importancia fundamental al ejercer efectos tanto en la
reaccin acrosmica del espermatozoide como
en la penetrabilidad de los ovocitos y en el desarrollo embrionario posterior.
La composicin del medio de FIV va a condicionar la posibilidad de desarrollo de la reaccin acrosmica, fase fundamental para el proceso de fecundacin en la que se produce la
fusin de la membrana acrosomal externa con
la membrana plasmtica del espermatozoide.
Para estudiar la reaccin acrosmica se ha utilizado con xito diversas tcnicas como la clsica
microscopa de contraste interdiferencial (Saake
y Marshall, 1968), diversas tinciones y microscopa de campo claro (Way et al., 1995), lectinas
unidas a fluorescena y anticuerpos monoclonales
(Parinaud et al., 1993).
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NaCl
KCl
CaCl2 2H2O
Ca-Lactato 5H2O
MgCl2 6H2O
MgSO4
NaH2PO4
NaHCO3
Lactato sdico (ml/L)
Na-Piruvato sdico
Glucosa
BSA (mg/ml)b
Penicilina G
Streptomicina
Sulfato de gentamicina (g/L)
Sulfato de Kanamicina
TALP
TCM-199a
BO
114.06
3.20
8.00
0.50
0.35
25.07
10.00
1.10
5.00
20.00
116.35
5.36
1.80
8.75
0.81
1.01
25.07
112.00
4.02
2.25
0.90
3.05
20.00
0.17
0.07
0.52
0.83
37.00
10.00
1.25
20.00
5
0.17
Anlisis estadstico
Las variables fueron analizadas mediante un
ANOVA de dos vas, siendo los factores fijos el
tratamiento y el tiempo de incubacin. Se consider estadsticamente significativo cuando se
alcanz un nivel de probabilidad de p<0.05. Los
datos se muestran como media sem.
RESULTADOS
Observamos que en todos los parmetros
estudiados que caracterizan el patrn de reaccin acrosmica: porcentaje de intactos (I), reaccionados (AR), con membrana alterada (AM)
y la proporcin de reaccionados frente al total
de vivos (RA/VIVOS), hay un efecto significativo del medio de fecundacin utilizado y del
tiempo de incubacin (p<0.002) (Tabla 2).
El porcentaje de espermatozoides vivos y
con el acrosoma intacto es significativamente
mayor cuando se utiliza el medio TCM-199 que
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AN. VET. (MURCIA) 19: 15-22 (2003). ACROSOME REACTION, BOVINE. GARDN, J.C., GADEA, J.
Tabla 2. Porcentaje de espermatozoides intactos (I), con reaccin acrosmica (RA), con
alteracin de la membrana (AM) y proporcin de reaccionados del total de vivos (RA/
VIVOS) despus de ser cultivados en tres diferentes medios de fecundacin in vitro (TALP,
TCM-199 y BO). Datos expresados en medias error estndar de la media
Tiempo (min)
RA
AM
RA/VIVOS
TALP
0
30
60
90
120
150
44.312.12
36.842.07
29.692.25
24.612.68
19.462.46
17.842.01
0.150.38
5.151.65
9.151.07
11.461.45
16.691.59
13.381.52
55.532.15
57.692.61
61.922.38
64.002.72
63.532.82
70.303.10
0.310.21
11.072.88
24.062.49
32.413.48
47.054.20
42.853.04
TCM-199
0
30
60
90
120
150
42.001.91
38.841.56
33.071.85
29.612.48
22.381.81
19.691.60
0.070.07
1.460.35
6.310.89
8.381.18
11.611.04
12.761.18
57.921.90
59.691.40
59.841.45
61.151.67
66.001.70
67.462.34
0.200.20
3.800.91
16.502.55
23.363.64
34.563.20
39.092.39
BO
0
30
60
90
120
150
42.231.52
32.081.96
26.922.34
23.842.61
18.612.25
15.762.01
0.230.16
4.920.76
8.460.84
9.761.06
9.610.92
11.001.06
57.531.59
63.001.26
64.081.64
66.381.91
71.761.88
71.692.88
0.480.34
14.322.76
25.583.19
31.013.87
36.333.94
42.103.05
RA
AM
RA/VIVOS
0.0018
<0.0001
0.8467
0.0001
<0.0001
0.0145
0.0037
<0.0001
0.7377
0.0001
<0.0001
0.2765
Fuentes de variacin
Medio de FIV
Tiempo de cultivo
Medio*Tiempo
19
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Acrosomas intactos
50
45
40
35
30
%
25
20
TALP
TCM-199
BO
15
10
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Tiempo (minutos)
Reaccionados/vivos
50
40
30
20
%
10
TALP
TCM-199
BO
20
40
60
80
100
120
140
160
Figura 1. Evolucin del porcentaje de espermatozoides con acrosoma intacto (a) y la relacin reaccionados/
vivos a lo largo del tiempo de cultivo para los tres medios estudiados (TALP, TCM-199 y BO).
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BO son soluciones salinas relativamente sencillas que se utilizan para el proceso de fecundacin. La posibilidad de utilizar con xito un
solo medio en todas las fases del proceso facilitara las tareas en el laboratorio y el trabajo
experimental.
Los resultados obtenidos en el presente trabajo confirman que el medio utilizado para la
fecundacin in vitro afecta al patrn de reaccin
acrosmica. De manera que la reaccin
acrosmica est acelerada en los medios TALP
y BO en relacin con la producida en el medio
TCM-199.
Aunque se ha descrito una relacin entre la
concentracin de Ca++ en el medio asociado a la
capacidad para desarrollar la reaccin
acrosmica (Fraser y McDermott, 1992) y producir una mayor tasa de penetraciones in vitro
(Mats et al., 2000). Sin embargo, en este estudio no se confirma esta relacin directa, ya que
el medio TCM-199 es el que contiene una mayor concentracin de Ca++ que los otros estudiados y sin embrago, la reaccin acrosmica est
retrasada, por tanto otros factores deben estar
implicados.
Un factor a tener en cuenta es la compleja
composicin del medio TCM-199, que incluye
una amplia variedad de aminocidos, lpidos y
vitaminas. Estos componentes podran modular
la biodisponibilidad de calcio. Del mismo modo,
la albmina srica bovina adicionada a los medios puede ejercer un efecto directo sobre la
membrana espermtica, como la fijacin del
colesterol presente en la membrana modificando cambios en la arquitectura de la misma (Flesh
y Gadella, 2000).
Otro factor implicado en el proceso de capacitacin y reaccin acrosmica est asociado a
los niveles de bicarbonato presentes en el medio, estando en mayor concentracin en el medio BO. Este bicarbonato se une directamente a
una enzima adenil ciclasa especfica del espermatozoide incrementndose considerablemente
los niveles de AMPc intracelular (Okamura et
al., 1985). Esta seal acta como activador de
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una cadena de reacciones que llevan a la capacitacin y reaccin acrosmica (Benoff, 1998).
La eleccin de los medios de cultivo y los
procesos de preparacin de los espermatozoides
van a ser determinantes para el proceso de fecundacin y suponen un rea de gran inters
para el desarrollo de los estudios de fecundacin in vitro. Del mismo modo, en otras especies ha sido demostrado el efecto del medio de
fecundacin sobre los patrones de reaccin
acrosmica y sobre los resultados de fecundacin y desarrollo embrionario, tanto en la especie caprina (Izquierdo et al., 1998) o la porcina
(Coy et al., 2002).
Para utilizar con xito el medio TCM-199
en el proceso de fecundacin bovina sera necesaria ajustar otras variables como la concentracin de Ca++ y de los inductores de la capacitacin (en este caso heparina y cafena) que permitan acelerar los procesos de capacitacin y
reaccin acrosmica.
BIBLIOGRAFA
Benoff S. 1998. Modelling human sperm-egg
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Coy P., Gadea J., Romar R., Mats C., Garca
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Coy, P., Ruiz, S., Romar, R., Campos, I., Gadea,
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AN. VET. (MURCIA) 19: 15-22 (2003). ACROSOME REACTION, BOVINE. GARDN, J.C., GADEA, J.