Anda di halaman 1dari 6

Laporan Praktikum Genetika

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)


Via Apriyani*, A.N. Suci, A.N. Jannah, D.P. Kusumawati, I.N. Azizah, R. Febriani, S. Leo, V.
Priansari, Y.Vebliza, D.M. Priyono, R. Ardiansyah, R. Maylasari
Universitas Indonesia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Departemen Biologi
Mei 2013

Abstrak
Perkembangan biologi molekuler telah sampai pada metode untuk memperbanyak DNA atau
disebut dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) yang ditemukan oleh seorang ilmuwan
bernama Kary B. Mullis pada tahun 1983. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA
target sehingga jumlahnya menjadi banyak. Teknik tersebut dapat dilakukan secara in vitro dan
berlangsung dalam waktu yang relatif cepat. Proses perbanyakan DNA dilakukan dengan
menggunakan reaction mixture dan berlangsung dalam mesin thermal cycler. Reaction mixture
merupakan campuran yang terdiri atas beberapa komponen, diantaranya berisi DNA cetakan yang
akan diamplifikasi. Telah dilakukan praktikum pembuatan reaction mixture serta amplifikasi sampel
DNA dengan mesin thermal cycler Perkin Elmer 9600. Hasil yang didapatkan ialah berupa segmen
DNA amplifikasi yang jumlahnya sangat banyak.
Kata kunci : Polymerase Chain Reaction (PCR); reaction mixture; DNA; amplifikasi; thermal cycler
1.

Pendahuluan

Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu teknik yang paling penting dalam biologi
molekuler. Teknik tersebut bertujuan untuk memperbanyak DNA secara in vitro dalam suatu reaksi
termal. Metode PCR telah banyak berperan dalam pengembangan bidang biologi molekuler
khususnya genetika. Beberapa aplikasi metode PCR diantaranya human genome project, diagnosis
penyakit genetik,
analisis filogenetik dan lain-lain. Oleh karena itu, dilakukanlah praktikum teknik PCR sebagai modal
awal sebelum mengaplikasikannya dalam bidang genetika yang lainnya.
Teknik PCR merupakan suatu metode enzimatik untuk memperbanyak (amplifikasi) DNA secara in
vitro (ekstraselular) (MSU 2008:1). Prinsip kerja PCR yaitu menggunakan reaction mixture serta
memanfaatkan DNA polymerase yang bersifat termostabil dan fragmen DNA yang pendek disebut
primer. Primer berfungsi untuk mensintesis secara langsung sekuens DNA target spesifik dari DNA
template. Reaksi sintesis tersebut terus berulang sehingga membentuk suatu siklus. Produk dari
siklus sintesis sebelumnya dapat berfungsi sebagai template atau cetakan bagi siklus selanjutnya.
Hasilnya ialah amplifikasi eksponensial dari sekuens DNA target. Siklus yang berulang tersebut
dapat berlangsung karena penggunaan Taq polymerase. Taq polymerase ialah sebuah enzim

polymerase bersifat termostabil yang diisolasi dari bakteri termofilik yaitu Thermus aquaticus ( MSU
2008:1).
Komponen komponen dalam reaction mixture PCR yaitu H2O steril, fungsinya sebagai pelarut
campuran. Bufer berfungsi untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan
enzim DNA polymerase. Bufer biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia. Komponen lainnya yaitu
dNTP (deoxynucleoside triphosphate) sebagai pembentuk basa komplementer dan penyusun DNA,
terdiri atas 4 macam sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP (MSU
2008: 2). Primer berfungsi untuk menginisiasi sintesis DNA pada sekuens target yang spesifik dan
membatasi reaksi polimerisasi DNA. Primer terdiri dari dua macam, yaitu primer forward dan primer
reverse. Primer forward untuk menginisiasi sintesis untai DNA dari ujung 5 ke ujung 3, sedangkan
primer reverse menginisiasi sintesis DNA dari ujung 3 ke ujung 5. Kation divalen terdiri dari ion
logam bivalen (umumnya Mg2+) dan ion logam monovalen (K+), berfungsi sebagai kofaktor bagi
enzim DNA polymerase. Tanpa ion-ion tersebut enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja
(Science biotech.net 2011: 1). DNA template adalah DNA yang memiliki sekuens target untuk
penempelan primer, berfungsi sebagai cetakan DNA yang akan diamplifikasi (Agustian 2008: 11).
Komponen yang terakhir yaitu enzim DNA polymerase berfungsi untuk membaca kode DNA serta
menghubungkan pasangan nukleotida dalam menghasilkan salinan DNA (The university of Utah
2008: 1).
Primer atau disebut juga dengan oglinukleotida (sepasang DNA utas tunggal pendek) merupakan
suatu fragmen yang terdiri atas 20-30 basa dan basa-basa tersebut akan berkomplemen secara
spesifik dengan DNA cetakan. Primer dirancang dengan memiliki sekuens yang komplemen dengan
DNA template sehingga dapat mengapit daerah tertentu yang diinginkan. Syarat primer yang baik
antara lain memiliki panjang basa oglinukleotida antara 18-24 basa, mempunyai urutan basa-basa
spesifik untuk melekat pada DNA cetakan, tidak terdapat basa-basa yang berkomplemen pada
ujung 3 yang menyebabkan terjadinya dimer, komposisi basa guanin (G) dan sitosin (C) adalah 50%
dari seluruh basa, dan dua primer yang dipasangkan memiliki suhu melting yang tidak berbeda jauh
(Agustian 2008: 10). Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing, dan
polimerisasi. Denaturasi berlangsung pada suhu 94oC selama 30 detik. Pada tahap denaturasi,
reaksi enzimatik
berhenti dan ikatan hidrogen terputus sehingga DNA untai ganda berpisah menjadi DNA untai
tunggal. Annealing berlangsung pada suhu 55 oC selama 3 detik. Pada tahap tersebut primer akan
menempel pada DNA template di tempat yang berkomplemen dengan sekuens primer. Tahap
terakhir yaitu polimerisasi berlangsung selama 30 detik pada suhu 72 oC merupakan proses
pemanjangan primer menggunakan untai tunggal DNA sebagai cetakannya. DNA polymerase akan
memasangkan dNTP yang sesuai dengan pasangannya (Agustian 2008: 11).
Cara mendesain suhu dan waktu pada setiap tahap siklus PCR ialah dengan mengatur CYCL
program pada mesin thermal cycler. Pada menu utama, ditekan tombol option dan dipilih create lalu
enter. Kemudian ditekan tombol option dan dipilih CYCL lalu tekan enter. Tentukan angka setpoints
satu sampai tiga. Dimasukkan suhu dan waktu sesuai dengan yang diinginkan. Ditekan enter untuk
mengkonfirmasi nilai yang telah dimasukkan. Selanjutnya, ditentukan jumlah siklus dengan menekan
enter a new value. Mesin thermal cycler akan running sesuai dengan kondisi yang telah diatur.
Jumlah siklus PCR ditentukan oleh rumus 2n dengan n adalah banyaknya jumlah siklus (Labequip
2006: 1).

Suhu penempelan atau annealing ditentukan berdasarkan primer yang digunakan serta dipengaruhi
oleh komposisi dan panjang primer. Suhu penempelan yang baik berkisar 5oC dibawah suhu leleh
atau melting temperature (Tm). Suhu leleh (Tm) dapat dihitung dengan menggunakan rumus :
Tm = 4(G+C) + 2(A+T) oC
Keterangan :
Tm = melting temperature
(G+C) = jumlah guanin dan sitosin pada oglinukleotida
(A+T) = jumlah adenin dan timin pada oglinukleotida (Abinawanto dkk. 2011: 47).
Mesin thermal cycler merupakan mesin yang dapat diprogram untuk menaikkan dan menurunkan
suhu sesuai dengan urutan waktu dan suhu yang diinginkan, dalam hal ini mengatur siklus
annealing, elongasi, dan denaturasi pada saat amplifikasi DNA berlangsung (UNAIR 2011: 1).
Kontrol positif diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal yang tidak
diinginkan. Selain itu, kontrol positif juga diperlukan untuk memverifikasi hasil amplifikasi negatif dan
reaksi kontrol positif harus mengandung komponen yang sama dengan sampel. Kontrol negatif
dibutuhkan untuk menghindari kesalahan positif semu seperti terjadinya kontaminasi atau reaksi
amplifikasi non spesifik (Handoyo & Ari 2001: 28).
Amplifikasi DNA dengan metode PCR memiliki kelebihan dan kekurangan jika dibandingkan dengan
teknik lain. Adapun kelebihan metode PCR adalah dapat digunakan untuk mengamplifikasi segmen
DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam beberapa jam. Selain itu reaksi amplifikasi sangat
spesifik dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis. Kekurangan metode PCR adalah
dibutuhkan banyak biaya untuk memperbanyak DNA, campuran yang digunakan rentan terhadap
kontaminasi, dan metode PCR tidak bisa mengekspresikan mutasi genetik (Handoyo & Ari 2001:
20).
Metode PCR dapat diaplikasikan dalam banyak hal, diantaranya untuk deteksi mutasi penyakit
genetik, kloning hasil PCR, sekuensing hasil PCR, kajian evolusi molekuler, dan kajian forensik
(tersangka kriminal dan tersangka ayah pada kasus paternal). Kajian forensik untuk identifikasi
seseorang yang terlibat kejahatan (baik korban dan pelaku), atau korban kecelakaan. Jika
identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan
yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk
mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang disebut fingerprint (DNA sidik jari). Hasilnya
dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah. Jika memiliki
kecocokan yang sangat tinggi maka identitasnya dapat dipastikan. Aplikasi lainnya yaitu dalam
proyek pemetaan genom manusia (human genome project) untuk memetakan dan mempelajari
fungsi dari gen manusia. Dengan demikian, penemuan dan manfaat metode PCR ini berdampak
sangat luas terhadap kemajuan sains dan teknologi secara umum (Handoyo & Ari 2001: 28).

2.

Metodologi

Alat yang digunakan dalam praktikum Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah mesin thermal

cycler, tabung PCR 0,2 ml, sarung tangan, pipet mikro, dan tips. Bahan yang dibutuhkan dalam
praktikum ini ialah campuran PCR mix dan sampel DNA. Komposisi PCR mix terdiri dari 14 l dd
H2O steril, 4 l 5x Kapa 2G Robust Buffer A with Mg, 0,4 l 10 mM dNTPs, 0,3 l primer FvCRF
(forward), 0,3 l primer FVCRR (reverse), dan 1 l 2G Kapa Robust. Sampel DNA sebanyak 5 l,
yaitu sampel DNA tumbuhan atau DNA darah.

3.

Hasil dan Pembahasan

Optimasi PCR perlu dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan hasil PCR yang optimal. Secara
umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi yang digunakan
pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor seperti jenis
polimerase DNA, suhu, konsentrasi, PCR bufer, dan waktu. Pemilihan suhu pada proses PCR
sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan suatu
PCR. Dalam hal ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan elongasi
primer. Suhu tergantung pada panjang DNA templat yang digunakan dan juga pada panjang
fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA
yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan
suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna.
Pemilihan waktu yang digunakan berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat, annealing dan
elongasi primer. Denaturasi DNA templat umumnya dilakukan selama 30 90 detik, ini semua
tergantung pada DNA templat yang digunakan. Waktu denaturasi yang terlalu lama akan merusak
templat DNA dan sekaligus dapat menurunkan aktivitas polimerase DNA. Sedangkan waktu
denaturasi yang terlalu pendek dapat
menyebabkan proses denaturasi tidak sempurna. Penentuan waktu untuk proses annealing
berkaitan dengan panjang primer. Untuk panjang primer lebih besar dari 22 basa diperlukan waktu
annealing 60 detik, sedangkan untuk panjang primer 18 22 basa cukup dengan 30 detik. Pemilihan
waktu elongasi primer tergantung pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Secara
umum untuk mengamplifikasi setiap satu kilo basa DNA diperlukan waktu 30 60 detik (Handoyo &
Ari 2001: 26-28).
Enzim DNA polymerase yang digunakan pada saat proses perbanyakan DNA berasal dari Thermus
aquaticus. Hal tersebut disebabkan karena bakteri tersebut bersifat termostabil sehingga enzim tidak
mudah terdenaturasi pada proses PCR yang berlangsung pada suhu tinggi (Agustian 2008: 10).
Cara membuat reaction mixture yang pertama harus dilakukan ialah mengetahui komposisi atau
komponen yang diperlukan dalam membuat campuran serta menyiapkan alat dan bahan yang
digunakan. Selanjutnya, dengan menggunakan mikropipet dan tips, dimasukkan 14 l ddH2O steril
kedalam tabung PCR. Lalu, dimasukkan larutan bufer sebanyak 4 l. Setelah itu ditambahkan
dengan dNTP sebanyak 0,4 l. Kemudian dicampurkan dengan primer forward dan primer reverse
masing masing sebanyak 0,3 l. Dimasukkan larutan enzim DNA polymerase sebanyak 1 l. Total
reaction mixture yaitu 20 l, karena belum dimasukkan dengan sampel DNA template. Setelah
dimasukkan dengan DNA template sebanyak 5 l, total larutan reaction mixture menjadi 25 l
(Abinawanto dkk. 2011: 49).

Metode PCR menggunakan mesin Thermal cycler Perkin Elmer 9600 untuk memperbanyak DNA.
Pada dasarnya mesin tersebut bekerja sesuai dengan prinsip mesin thermal cycler yaitu dapat
menaikkan suhu pada saat denaturasi dan polimerisasi serta menurunkan suhu pada tahap
annealing sesuai dengan urutan waktu yang ditentukan. Pengaturan waktu dan suhu siklus PCR
dilakukan melaui pemograman tertentu. Tombol-tombol yang terdapat dalam mesin mengindikasikan
perintah tertentu. Tombol program tersebut meliputi HOLD, CYCL, AUTO, dan METH. CYCL
mengandung thermal ramps dan hold segments untuk siklus PCR, biasanya berisi dua atau tiga
setpoints. HOLD untuk memprogram siklus akhir. METH dapat menggabungkan antar siklus.
Program AUTO memungkinkan untuk menaikkan atau menurunkan jumlah setpoints waktu dan suhu
setiap siklus. Amplifikasi DNA menggunakan mesin Thermal cycler Perkin Elmer 9600 yang pertama
ialah dengan memprogram CYCL lalu menentukan tiga setpoints yang terdiri dari tahap denaturasi,
annealing, dan polimerisasi lalu tentukan jumlah siklus. Kemudian diatur program HOLD satu
sampai tiga. Setelah itu, gabungkan siklus dengan menekan tombol METH. Terakhir tekan tombol
run untuk menjalankan siklus secara keseluruhan (Labequip 2006: 1).
Kondisi siklus reaksi yang digunakan dalam praktikum bergantung pada setiap tahap yang meliputi
denaturasi, annealing, dan polimerisasi. Pada tahap denaturasi diatur dengan suhu sebesar 94oC
selama 30 detik. Denaturasi berfungsi untuk menguraikan untai ganda DNA menjadi untai tunggal.
Tahap annealing (penempelan primer) berlangsung selama 30 detik pada suhu 55oC. Tahap
elongasi atau polimerisasi DNA berlangsung pada suhu 72oC karena suhu tersebut merupakan
suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR. Polimerisasi terjadi
selama 30 detik.
Hasil dari tugas membuat diagram atau gambar perbanyakan DNA hingga siklus ke-5 didapatkan
total jumlah untai DNA sebanyak 32 buah. Hal tersebut sesuai dengan rumus 2n, (25 = 32). Diagram
siklus PCR dimulai dari satu rantai DNA yang akan diperbanyak, kemudian DNA tersebut mengalami
denaturasi pada suhu 95oC sehingga menjadi untai tunggal. Selanjutnya DNA untai tunggal tersebut
mulai dipasangkan dengan basa komplementernya pada tahap annealing. Pada tahap tersebut
terdapat dua jenis primer yang bekerja, yaitu primer reverse yang melakukan penempelan dari ujung
3 ke 5 serta primer forward yang melakukan penempelan dari ujung 5 ke 3. Tahap terakhir ialah
polimerisasi atau elongasi, yaitu pemanjangan untai DNA sehingga membentuk untai ganda DNA
yang baru. Pada siklus ke-1 dihasilkan dua untai ganda DNA yang baru. Tahapan siklus PCR untuk
siklus ke-2 hingga siklus ke-5 pada prinsipnya sama dengan siklus ke-1. Perbedaannya hanya pada
jumlah untai DNA yang dihasilkan. Tahap siklus ke-2 menghasilkan empat untai DNA, siklus ke-3
menghasilkan delapan untai DNA, siklus ke-4 menghasilkan 16 untai DNA, dan yang terakhir siklus
ke-5 menghasilkan 32 untai DNA.

4.

Kesimpulan

Reaction mixture merupakan komponen penting dalam metode PCR yang dibuat melalui
serangkaian prosedur dan didalamnya terdiri dari komposisi berupa DNA template, bufer, dNTP,
enzim DNA polymerase, air, dan primer. Siklus PCR terdiri dari tiga tahapan yaitu denaturasi
(pemisahan untai ganda DNA), annealing (pelekatan primer), dan polimerisasi (pemanjangan DNA).
Thermal cycler merupakan mesin yang digunakan untuk memperbanyak DNA, prinsip kerjanya yaitu

menaikkan dan menurunkan suhu sesuai dengan urutan waktu yang telah ditentukan.

Daftar pustaka
Abinawanto, R. Lestari, A. Bowolaksono, M. Dian, D.
P. Astuti & H. Yasmin. 2011. Pedoman praktikum genetika dasar. PT. Pandu Aksara, Jakarta Timur:
iii + 77 hlm.
Agustian, A. 2008. Karakterisasi variasi tanaman jarak
pagar. 13 hlm. http://lontar.ui.ac.id/file%3Ffile%3Ddigital/124084-BIO.002-08-Karakterisasi
%2520variasi-Literatur, diakses 09 Mei 2013, pk. 10.55 WIB.
Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR).
PCR 9: 17-28.
Labequip. 2006. Perkin elmer gene amp 9600 thermal cycler. 1 hlm.
http://www.labequip.com/perkinelmer-geneamp-9600-thermal-cycler.html, diakses 09 Mei 2013, pk.
15.57 WIB.
Michigan State University (=MSU). 2008. PCR
fundamental. 6 hlm. https://www.msu.edu/course/lbs/159h/PCR04.pdf, diakses 05 Mei 2013, pk
21.24 WIB.
Science biotech.net. 2011. Mengenal PCR (Polymerase
Chain Reaction). 1 hlm. http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/, diakses
09 Mei 2013, pk 10.36. WIB.
The University of Utah. 2008. Genetic science learning center, PCR virtual lab. 1 hlm.
http://learn.genetics.utah. edu/content/labs/pcr/, diakses 09 Mei 2013, pk. 11.18 WIB.
Universitas Airlangga (=UNAIR). 2011. Polymerase Chain Reaction. 1 hlm.
http://unair.ac.id/artikel_detail-50379-Umum-Polymerase Chain Reaction, diakses 09 Mei 2013, pk.
13.40 WIB.