Anda di halaman 1dari 9

LAPORAN AKHIR PRAKTIKUM FARMAKOTERAPI PENYAKIT

INFEKSI
PEWARNAAN GRAM
NAMA

: Nabilla Azka Qonita

NPM

: 260110140108

HARI/TANGGAL PRAKTIKUM

: RABU/23 SEPTEMBER 2015

ASISTEN

:1. BETHARY K
2. HIMMATUL ULYA

LABORATORIUM FARMAKOTERAPI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS PADJADJARAN
JATINANGOR
2015

I.

Tujuan
1. Mengamati dua kelompok bakteri yaitu bakteri Gram positif dan Gram
negatif dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram.
2. Memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjadi dalam
prosedur tersebut.

II.

Prinsip

1. Teknik Pewarnaan Diferensial


Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba
atau bagian-bagian sel mikroba (Pelczar dan Chan, 2007).
2. Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram atau metode gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar gram-positif dan
gram-negatif berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel bakteri (Karman,
Oman, 2008).
3. Zat Warna
Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, salah
satu di antaranya berwarna (Volk & Wheeler, 1993).
III.

Teori Dasar
Bakteri berkembang biak dengan membelah diri, dan karena begitu kecil

maka hanya dapat dilihat menggunakan mikroskop. Bakteri mempunyai


beberapa organel yang dapat melaksanakan beberapa fungsi hidup (Waluyo,
2004). Menurut Pratiwi (2008) bentuk-bentuk bakteri, yaitu bulat (tunggal:
coccus, jamak: cocci), batang atau silinder (tunggal: bacillus, jamak: bacilli),
dan spiral yaitu berbentuk batang melengkung atau melingkar-lingkar.
Pewarnaan gram (GS) adalah teknik pewarnaan utama yang digunakan
untuk pemeriksaan mikroskopis bakteri. Bakteri yang tidak diketahui dapat
diklasifikasikan menjadi Gram-positif atau Gram negatif oleh GS, di mana
kehilangan warna adalah perangkap utama, karena beberapa bakteri gram positif
mengalami kehilangan warna lebih cepat, dan salah diidentifikasi sebagai gram
negatif (Candra dan Mani, 2011).

Ada tiga prosedur pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan


diferensial, dan pewarnaan khusus. Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan
satu macam pewarna dan bertujuan mewarnai seluruh sel mikroorganisme
sehingga bentuk seluler dan struktur dasarnya dapat terlihat (Pratiwi, 2008).
Pewarnaan diferensial menggunakan lebih dari satu pewarna dan memiliki
reaksi yang berbeda untuk setiap bakteri, sehingga digunakan untuk
membedakan bakteri. Pewarna diferensial yang sering digunakan adalah
pewarna gram. Pewarna gram ini mampu membedakan dua kelompok besar
bakteri, yaitu Gram positif dan Gram negatif. Pada pewarnaan gram ini, bakteri
yang telah difiksasi dengan panas sehingga membentuk noda pada kaca objek
diwarnai dengan pewarna basa yaitu kristal ungu. Karena warna ungu
memenuhi semua sel, maka pewarnaan ini disebut pewarnaan primer. Bakteri
yang tetap berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan
bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif. Perbedaan
warna antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif disebabkan oleh
adanya perbedaan struktur pada dinding selnya. Dinding bakteri Gram positif
banyak mengandung peptidoglikan, sedangkan dinding bakteri Gram negatif
banyak mengandung lipoposakarida (Pratiwi, 2008).
Bakteri Staphylococcus aureus merupakan bakteri Gram positif yang banyak
menyerang

manusia

maupun hewan

mamalia lainnya. Dalam jumlah 105

CFU/ml bakteri S. aureus berpotensi menghasilkan toksin dan dalam jumlah


106 CFU/ml bakteri E. coli berpotensi menyebabkantoksik. Bakteri Escherichia
coli ialah bakteri Gram negatif yang berbentuk batang danmerupakan salah satu
bakteri aerob atau fakultatif anaerob (Karlina et al, 2013).
Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk batang dalam sel
tunggal atau berpasangan, merupakan anggota famili Enterobacteriacea dan
flora normal intestinal yang mempunyai kontribusi pada fungsi normal intestin
dan nutrisi tetapi bakteri ini akan menjadi patogen bila mencapai jaringan di luar
jaringan intestinal. Spesies E.coli bersifat motil dengan flagel peritrik yang
dimilikinya, tetapi beberapa ada yang nonmotil (Noviana, 2004).

IV.

Alat dan Bahan

1. Alat
-

Bak Pewarna

Kaca obyek

Kapas

Kertas saring

Mikroskop majemuk

Pembakar spirtus

Ose

Pipet

2. Bahan
-

Alkohol 95%

Alcohol 70%

Air suling

Suspensi campuran bakteri E.coli dan S. aureus

Suspensi campuran bakteri E. coli dan B. subfilis

Zat warna: karbol gentian violet, lugol (iodium; kalium iodium; air
suling 1:2 100 mL), dan air fuksin.

V.

Prosedur
Kaca obyek dibersihkan dari larutan alkohol mengguakan kapas, kemudian

dibuat olesan dri masing-masing campuran bakteri menggunakan ose, lalu


difiksasi di atas api spirtus. Kaca obyek diletakkan di atas rak kawat di atas bak
pewarna. Oelsan bakteri digenangi dengan CGV (Carbol Gentian Violet) selama
satu menit, dibilas dengan air suling. Olesan digenangi dengan lugol selama 2
menit, dibilas dengan air suling. Olesan dicuci dengan pemucat alcohol 95%
tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna larut, lalu dibilas dengan
air suling. Olesan digenangi dengan pewarna tandingan air fuksin selama 30
detik, dibuang warna yang berlebih bilas dengan air suling lalu dikeringkan
dengan kertas saring. Minyak emersi ditetesi sedikit demi sedikit pada preparat,
diperiksa di bawah mikroskop. Dimulai dari obyektif perbesaran 10X, lalu
diganti dengan lensa obyektif perbesaran 100X. diamati dan digambar hasilnya.

VI.

Data Pengamatan
Perlakuan

Hasil

1. Kaca obyek dibersihkan dari Kaca obyek sudah bersih. Bakteri


alcohol

menggunakan

kapas, sudah menempel di atas kaca obyektif.

bakteri dioleskan ke kaca obyek,


difiksasi di atas api spirtus.
2. Olesan digenangi dengan CGV Olesan sudah digenangi dengan CGV.
selama 1 menit.
3. Olesan digenangi dengan lugol Olesan sudah digenangi dengan lugol.
selama 2 menit.
4. Olesan dicuci dengan pemucat Olesan sudah dicuci.
alcohol 95%.
5. Olesan

digenangi

dengan Olesan

pewarna tandingan fuksin.

sudah

digenangi

dengan

pewarna tandingan fuksin.

6. Diamati di bawah mikroskop


pada perbesaran 40x dan 100x.

Perbesaran 40 x
Jenis bakteri = bakteri gram positif.
Warna = biru
Bentuk = coccus / bulat
Nama bakteri = Staphylococcus aureus

Jenis bakteri = bakteri gram negatif


Warna = violet
Bentuk = basil / batang
Nama bakteri = Escherichia coli

VII.

Pembahasan
Pada percobaan praktikum kali ini dilakukan pengecatan atau pewarnaan

gram pada bakteri. Dalam pewarnaan gram, akan dihasilkan dua jenis bakteri:
bakteri gram positif atau bakteri gram negatif. Dua jenis bakteri tersebut
dibedakan dari warna yang dihasilkan setelah prosedur percobaan sudah
dilakukan. Pada teknik pewarnaan bakteri, ada beberapa jenis teknik
pewarnaan bakteri, yaitu pewarnaan sederhana atau tunggal, pewarnaan
diferensial atau majemuk, dan pewarnaan khusus. Perbedaan antara pewarnaan
tunggal dan majemuk adalah jumlsh dari pereaksi yang digunakan dalam
pewarnaan pada bakteri tersebut. Pada pewarnaan tunggal, pereaksi yang
digunakan entah hanya metilen blue, CGV, fuksin, atau lugol. Metilen blue
digunakan hanya untuk melihat morfologi bakteri. Dalam pewarnaan majemuk,
digunakan dua jenis zat warna, dan yang diidentifikasi adalah jenis bakteri
(gram positif atau negatif, acid fast stain, capsule stain, dan lain-lain. Untuk
praktikum ini, teknik pewarnaan yang digunakan adalah pewarnaan majemuk,
lebih spesifiknya lagi adalah pewarnaan gram, karena zat pewarna yang
digunakan dalam teknik ini ada dua macam yaitu CGV ( Carbol Gentian
Violet) dan fuksin.

Sebelum dilakukan penentuan gram negatif atau positif, dibuat preparat


terlebih dahulu pada kaca objek yang sudah dibersihkan dengan larutan
alcohol. Setelah bakteri sudah dioleskan pada kaca obyek menggunakan ose,
kaca obyek difiksasi terlebih dahulu. Sebelum bakteri dapat diwarnai, bakteri
tersebut harus difiksasi agar terikat pada kaca objek. Apabila fiksasi tidak
dilakukan, maka pemberian zat warna pada bakteri yang dilanjutkan dengan
prosedur yang menggunakan air mengalir dapat menyebabkan bakteri ikut
tercuci. Setelah difiksasi, digenangi dengan CGV selama 1 menit dengan tujuan
agar pewarna tersebut dapat memenuhi semua sel. Proses pewarnaan dengan
CGV juga disebut dengan pewarnaan primer karena warna dari CGV yang
memenuhi seluruh sel. Setelah itu, olesan digenangi dengan lugol selama 2
menit yang berfungsi sebagai pemantek atau penguat warna (mordant). Setelah
pemberian lugol dilakukan, olesan ditetesi dengan alcohol 95% selama 30
detik, dimana alcohol ini berfungsing sebagai discoloring atau senyawa
peluntur warna yang pada spesies bakteri tertentu dapat menghilangkan warna
ungu dari sel. Setelah prosedur sebelumnya sudah dilakukan, olesan digenangi
dengan safranin, yaitu fuksin, selama 30 detik, yang berfungsi sebagai zat
warna tandingan, dimana fuksin adalah pewarna basa berwarna basa berwarna
merah.
Setelah serangkaian prosedur sudah dilakukan, diamati di bawah
mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x, dimana sebelum diamati ditetesi
terlebih dahulu dengan minyak imersi untuk mengurangi indeks bias cahaya.
Bakteri yang tetap berwarna biru/violet digolongkan ke dalam gram positif,
Sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam gram negatif.
Perbedaan dari kedua jenis tersebut ada pada perbedaan dari struktur pada
dinding selnya. Dinding bakteri gram positif mengandung peptidoglikan yang
tebal, sehingga pewarna primer terserap secara sempurna dan menyeluruh dan
tidak meluruh ketika ditambahkan senyawa peluntur warna, dimana kompleks
Kristal ungu-iodin yang masuk ke dalam sel bakteri gram positif tidak dapat
tercuci oleh senyawa peluntur warna karena lapisan peptidoglikan yang tebal.
Sedangkan pada bakteri gram negatif, alcohol atau senyawa peluntur warna

akan merusak lapisan lipopolisakarida. Kompleks Kristal ungu-iodin pada


bakteri gram negatif dapat tercuci dan menyebabkan bakteri terlihat transparan
setelah diberikan zat pewarna tandingan yaitu fuksin.
Hasil yang ditunjukkan pada praktikum, dimana didapatkan bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli. Sesuai dengan literatur,
Staphylococcus aureus adalah bakteri gram positif berbentuk kokus dan
Escherichia coli adalah bakteri gram negatif berbentuk basil.
VIII.

Kesimpulan

1. Bakteri gram positif dan negatif dapat ditentukan dengan penambahan dua
macam pewarna pada bakteri, yaitu pewarna primer dan pewarna
tandingan, dimana teknik pewarnaan dalam percobaan ini adalah
pewarnaan majemuk.
2. Reaksi-reaksi dalam pewarnaan gram pada dasarnya bergantung pada
kompleks warna ungu-iodin, apakah kompleks tersebut tercuci dengan
penambahan zat peluntur warna atau tidak. Apabila tidak luntur (warna
tetap ungu/violet), bakteri tersebut adalah bakteri gram positif, karena
mempunyai peptidoglikan yang tebal. Sebaliknya, apabila luntur, bakteri
tersebut merupakan bakteri gram negatif, karena hanya mempunyai
peptidoglikan yang sedikit.

DAFTAR PUSTAKA
Brown. R.G., Burns, T., 2005. Lecture Notes Dermatology. Jakarta: Penerbit
Erlangga.
Chandra, T. J., dan P. Subha Mani. 2011. A study of 2 rapid tests to differentiate
Gram positive and Gram negative aerobic bacteria. Journal of Medical &
Allied Sciences. 1 ( 2 ) : 84-85.
Waluyo,

L.

2004.

Mikrobiologi

Umum.

Malang:

Penerbit

Universitas

Muhamadiyah Press.
Karliana, C.Y., et al. 2013. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Herba Krokot
(Portulaca oleracea L.) terhadap Staphylococcus aureus Dan Escherichia
coli. Lentera Bio, vol. 2, no. 1.
Karman, O. 2008. Biologi untuk Kelas X Sekolah Menengah Atas. Bandung:
Grafindo Media Pratama.
Noviana, H. 2004. Pola Kepekaan Antibiotika Escherechia coli yang Diisolasi
dari Berbagai Spesimen Klinis. Jurnal Kedokteran Trisakti, Vol. 23, No.4.
Pelczar, M. J., dan Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. New York : Mc
Graw Hill Book
Pratiwi, ST. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Penerbit Erlangga.
Volk & Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Erlangga