MICROBIOLOGA DE
SUELOS
Tcnicas, mtodos y
medios de cultivo
2004
MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Tcnicas, mtodos y medios de cultivo
MICROBIOLOGIA DE SUELOS
Tcnicas, mtodos y medios de cultivo
ISBN: 970-32-1907-1
D.R. 2004 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO
Prohibida su reproduccin total o parcial con fines de lucro.
PAPIME: EN216403
CONTENIDO
Pgina
I
INTRODUCCION
II
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5
2.6
III
EL MICROSCOPIO
PROBETAS DE CULTIVO
CAJA PETRI
PIPETAS BACTERIOLGICAS
EL ASA Y LA AGUJA PARA INOCULAR
PORTAOBJETOS
3
5
5
5
5
5
4.1 ESTERILIZACION
4.2 PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
V
5.1
5.2
5.3
5.4
VI
7
7
7
7
8
8
9
10
11
11
11
13
14
14
14
16
TECNICAS DE INOCULACIN
17
17
18
6.3 INOCULACIN
CONSERVACION
DE CEPAS
VII
7.1
7.2
7.3
7.4
7.5
7.6
7.7
VIII
EN
AGAR
INCLINADO
PARA 18
TECNICAS MICROSCPICAS
19
19
19
19
19
20
20
21
TINCIONES DIRECTAS
23
23
24
25
IX
AISLAMIENTO DE BACTERIAS
27
AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS
33
XI
AISLAMIENTO DE HONGOS
37
XII
AISLAMIENTO DE ALGAS
43
XIII
AISLAMIENTO DE PROTOZOARIOS
45
XIV
AISLAMIENTO DE NEMATODOS
49
XV
BIBLIOGRAFA
53
I .- INTRODUCCIN
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la Microbiologa es, probablemente, la nica
que se ocupa de todos los aspectos relativos a los organismos que constituyen su objeto de
estudio. Se trata, por tanto, de una biologa general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano, sin ayuda de un instrumento ptico
que ample su imagen, y que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organizacin biolgica muy simple. Por consiguiente, la Microbiologa se ocupa tanto del estudio
de las caractersticas inherentes a los microorganismos (tales como su estructura celular, su
bioqumica, su fisiologa y su gentica, entre otras), como de sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que habitan. Entre estas ltimas se
encuentran aqullas caractersticas que tienen que ver con el papel de los microorganismos
como transformadores de la materia orgnica e inorgnica (y, por tanto, con la participacin de
los microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza), as como aqullas que hacen que
muchos de ellos se comporten como agentes patgenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable inters en agronoma.
La Microbiologa del suelo no es una disciplina pura ya que sus orgenes pueden buscarse en la
Bacteriologa, la Micologa y la Edafologa adems de la Bioqumica y la Fitopatologa. Estas
disciplinas se entrelazan para formar la Microbiologa del suelo y se debe estar familiarizado en
cierta medida con sus principios para poder entender e interpretar todos los fenmenos que
suceden dentro del suelo y el impacto que tienen en el medio ambiente y en particular en la
agricultura.
En el suelo existe una gran variedad de organismos que realizan muy diversas funciones que
ejercen influencias benficas y perjudiciales sobre la capacidad de alimentacin del hombre y la
calidad del medio ambiente entre los cuales podemos citar a los hongos, bacterias,
actinomicetos, algas, protozoarios, nematodos y virus. Para realizar un anlisis de los
organismos edficos es necesario llevar a cabo una serie de tcnicas bsicas y experimentales
que nos permitan conocer su morfologa, hbitos, fisiologa, en general su biologa as como la
forma de extraccin. Para el estudio de estos microorganismos se necesita conocer aprender y
familiarizarse con los mtodos bsicos de extraccin de los mismos; por ello este manual se
divide en dos partes, la primera trata los aspectos generales donde se hace mencin del
material, reactivos, tcnicas bsicas y experimentales de uso comn para iniciarse en estudios
de Microbiologa de suelos. En la segunda parte se menciona las caractersticas generales de la
microbiota del suelo , los medios especficos y la manera de aislarlos. Este manual va dirigido a
los alumnos de la carrera de Biologa, para que se inicien en la informacin bsicas necesaria
para poder realizar estudios microbiolgicos. Es un recopilacin de mtodos y tcnicas que se
utilizan en estudios de microbiologa bsica y microbiologa de suelos.
Microbiologa de Suelos
__ Se debe utilizar primero el objetivo de bajo poder para lograr el foco ptimo y luego cambiar
al objetivo de alto poder y mover el tornillo micromtrico para obtener el nuevo foco ptimo de
inmediato.
__ Es necesario mantener limpios los lentes para que la imagen no este borrosa.
__ No usar el lente de inmersin en seco o bien el objetivo de alto poder con aceite pues
mancha el lente y provocara su desprendimiento.
OCULARES
BRAZO
REVOLVER
OBJETIVO
PLATINA
TORNILLOS
Macromtrico
y
Micromtrico
DIAFRAGMA
CONDENSADOR
BASE
Microbiologa de Suelos
del material filtrante. Para su aplicacin se debe usar material estril y se coloca el material
filtrante sobre el soporte de la unidad de filtracin, se fija y se pasa el lquido a travs de la
membrana o material filtrante, recolectndose el filtrado en un matraz esterilizado. Adems
estos filtros se utilizan para esterilizar el aire ambiental de sitios que lo requieran (Fig. 2).
3.2.1- Flujo Laminar.- Es una tcnica que permite controlar la contaminacin que proviene del
aire, mediante dos procesos simultneos: 1).- El paso del aire a travs de filtros absolutos (
HEPAVECOFLOW que retiene partculas de 0.3 micras) y 2).- Regulacin de la velocidad del
aire filtrado y direccin del mismo.
Los dispositivos que aplican esta tcnica son las campanas de flujo laminar horizontal y vertical,
que se utilizan en actividades que requieren esterilidad.
Tierra de
diatomeas
Material de
Porcelana
Filtro de Porcelana
Filtro Berkefield
Microbiologa de Suelos
Presin de vapor en
libras
(mayor que la presin
atmosfrica)
0
5
10
20
Temperatura
C
100.0
108.3
115.5
126.6
Microbiologa de Suelos
10
Microbiologa de Suelos
11
12
Inoculacin primaria
Microbiologa de Suelos
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medio nutritivo,
14
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china y luego se coloca el cubreobjetos. Dicha emulsin no debe ser muy espesa, pues puede
bloquear la luz al observar al microscopio.
7.5.- METODO DEL HEMATOCITOMETRO CALIBRADO
Para realizar un examen microscpico directo de las colonias en el suelo se utiliza este mtodo,
que consiste en la incorporacin de una cantidad de suelo en agar lquido colocando unas gotas
de esta infusin en un hematocitmetro calibrado, la suspensin se tie y luego es observada al
microscopio. Si se conoce la cantidad de suelo, el volumen de agar y el rea sobre la cual este
distribuido, puede determinarse el nmero de bacterias en la muestra.
7.6.- METODO DE ROSSI Y CHOLODNY
Se conoce como el mtodo del portaobjetos enterrado o portaobjetos de contacto de Rossi y
Cholodny, fue el primero en utilizarse en estudios de las caractersticas de la poblacin
microbiana del suelo en relacin con su medio ambiente, est mtodo no es cuantitativo sino
cualitativo; se utiliza para estudios de laboratorio y campo.
Las limitaciones del mtodo es la incapacidad para aislar y cultivar las clulas microbianas
observadas a travs del microscopio, para realizar esta tcnica se hace lo siguiente:
* Estudio en campo.- Se coloca de 4 a 6 portaobjetos en el campo, introducindolos en la
regin ms cercana a las races, durante un periodo de 15 a 30 das, pasado este tiempo se
remueven con cuidado de no destruir el frotis formado sobre el portaobjetos y se sigue este
procedimiento.
1.- Lave ligeramente el frotis con agua para eliminar las partculas gruesas del suelo y djelo
secar al aire libre.
2.- Se tie con el siguiente colorante, cuya composicin es:
Rosa de bengala......................
.....1.0 g
Cloruro de calcio dihidratado..............0.1 g
Fenol al 5% acuoso.................... .100.0 mL
3.- Se deja con el colorante 10 minutos sin dejarlo secarse.
4.- Se lava y seca al aire libre.
5.- Se observa al microscopio la forma y tamao de las clulas bacterianas y forma de las
colonias, presencia de filamentos de Actinomicetos, hongos, esporas, algas o algn otro
organismo.
* Estudio en laboratorio.- Se pesan tres porciones de 200 gramos de muestra de suelo
tamizado y se colocan en vasos de precipitados de 500 mL, se agrega agua hasta 40 a 50% de
la capacidad de campo, luego se insertan 2 portaobjetos en cada vaso, se cubren con papel no
poroso o con cajas Petri para evitar la evaporacin rpida del agua, se deja incubar a
temperatura ambiente durante 15 das y se remueve un portaobjetos y el otro se retira a los 30
das, con el fin de compararlos, siguiendo el proceso antes mencionado para su observacin
microscpica ( Echegaray, 1993).
Microbiologa de Suelos
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grupos por su diferente reaccin tintrea ante la coloracin de Gram los cuales son: la bacterias
Gram-Positivas y las Gram-Negativas.
En esta tcnica se utiliza el cristal violeta o violeta de genciana que acta como colorante
primario, que se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solucin
dbil de yodo. Algunas especies de bacterias debido a la naturaleza qumica de su pared
celular, poseen la capacidad de retener l cristal violeta aun despus del tratamiento con
decolorantes orgnicos (mezcla de acetona-alcohol), tales bacterias se denominan GramPositivas. Otras bacterias las llamadas Gram-Negativas pierden la coloracin primaria del cristal
violeta al ser tratadas con decolorantes debido a un mayor contenido de lpidos en su pared
celular y mediante la aplicacin de un colorante secundario como la safranina adquieren un
color rosado o rojo vistas al microscopio habiendo fijado la safranina como contracolor a su
pared celular y se realiza de la manera siguiente:
* Cubrir el frotis ya fijado con solucin de cristal violeta durante un minuto, luego se deja escurrir
el exceso del colorante.
* Lavar gota a gota con agua de la llave, cubrir el frotis con lugol durante un minuto.
* Escurrir y lavar con agua de la llave o destilada.
* Inclinar el portaobjetos y agregar gota a gota una mezcla de acetona al 30% en alcohol etlico
para decolorar, aproximadamente 15 segundos.
* Lavar con agua de la llave gota a gota.
* Cubrir con safranina en solucin al 2.5% en alcohol del 95% durante un minuto.
* Lavar con agua, escurrir y dejar secar al aire
* Observar al microscopio y determinar si es Gram-positiva (se tie de color violeta) o Gramnegativo (se tie de color rojo).
8.2.- TINCIONES ACIDORRESISTENTES O DE ZIEHL-NEELSEN
Las microbacterias poseen una cpsula gruesa y cerosa resistente a la tincin, sin embargo,
una vez teidas la cpsula resiste a la decoloracin con potentes solventes como el alcohol y el
cido. Por tal
motivo los microorganismos que tienen esta propiedad se les llama
acidorresistentes.
A fin de que el colorante primario (Carbolfucsina) logre penetrar las cpsulas cerosas de los
bacilos acidorresistentes, se requiere de un tratamiento fsico como es la aplicacin de calor
despus de haber aplicado el colorante de cabolfucsina a la muestra.
Otras tinciones que se utilizan son la Azul de Metileno de Loefflere como coloracin simple en
una gran variedad de microorganismos, en donde se tien intensamente los grnulos
metacromticos, diferencindose del citoplasma que adquiere un color azul claro. Tambin se
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usa el Lactofenol Azul de Algodn, como contracolor para tejidos sin fijar, bacterias y protozoos;
adems en la actualidad se usa para tincin directa de micelio fngico y cuerpos fructferos que
toman un color azul claro (Moreno, 1988).
8.3.- TINCIONES SELECTIVAS
Este tipo de tincin nos permiten observar un organelo celular determinado, ya que el colorante
se combina selectivamente con l. Para lograrlo se usan mordentes, agentes acidificantes o
precipitantes y de contraste, las importantes son:
Tincin de endosporas,
Tincin de flagelos,
Tincin de ncleo y
Tincin de cpsula.
Tincin de flagelo.- los flagelos son estructuras que estn constituidos por una
sustancia llamada flagelina, son muy pequeos, ya que su espesor va de 10 a 30 m, no
son vistos en el microscopio ptico, por ello se tien para aumentar su grosor. Se utiliza
cido tnico como mordente, que precipita sobre los flagelos al teirse con para-rosaanilina y el colorante de contraste usado es el azul de metileno, para teir el resto de la
clula, no se fija a la flama. Los flagelos de organismos eucariotes, como algas y
protozoarios son ms gruesos y se pueden observar con tinciones simples.
Tincin de ncleo.- el ncleo contiene a los cromosomas, los cuales se pueden teir
con mtodos como el de Feulgen o Giemsa-HCL. El HCL reduce la afinidad del
citoplasma (RNA) por el colorante y aumenta la afinidad del ncleo por el mismo.
Observando al ncleo bien teido y el citoplasma en color claro. Tambin se puede
utilizar una solucin diluida de azul de metileno, que tiene afinidad por los cidos
nucleicos y no se fija a la flama, pues se precipitaran todas las protenas.
Microbiologa de Suelos
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IX.-AISLAMIENTO DE BACTERIAS
El nmero de bacterias en el suelo es grande pero los individuos son pequeos y constituyen
menos de la mitad de la masa celular microbiana total. Taxonmicamente las bacterias se
ubican segn el Manual de Bergey (1988) en grupos donde se consideran sus caracterstica
fisiolgicas, nutricionales y metablicas, as como el tipo de energa que utilizan para realizar su
metabolismo como podra ser el uso de carbohidratos, nitrgeno, etc.
La morfologa celular tambin sirve para caracterizar a las bacterias, las cuales pueden ser
bacilos, cocos y espirilos (poco comunes en el suelo). Algunos bacilos producen endosporas
que permanecen en estado latente en condiciones adversas, otras especies poseen estructuras
que tambin se toman en cuenta como son la presencia de flagelos y posicin de los mismos.
La cantidad y tipo de bacterias estn determinadas en gran medida por el tipo de suelo,
humedad, aireacin, temperatura, pH, cantidad de materia orgnica, profundidad, prcticas de
cultivo y estacin del ao. Por lo general el nmero de bacterias es mayor en zonas cultivadas
que en zonas vrgenes, ya que el cultivo favorece las condiciones para la proliferacin de las
mismas (Alexander, 1990; Sprent, 1990)).
Los gneros de bacterias que aparecen comnmente en placas de agar con suspensin de
suelo diluido son: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,
Micrococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Sarcina, Staphylococcus, Streptococcus y
Xantomonas. Adems de Azotobacter, Nitrobacter, Nitrosomona, Aerobacter, Azospirillum, y
Rhizobium.
Los gneros Bacillus y Clostridium son formadores de endoesporas. De todos los gneros antes
mencionados que aparecen en placas de agar son del 5% al 60% de Artrobacter del 7% al 67%
de Bacillus, del 3% al 15% de Pseudomonas, 20% de Agrobacterium y menos del 5% lo
representan los otros gneros.
Figura 8.- Bacteria comn que se encuentra en el suelo Pseudomonas sp. (foto de
Alexander, 1990)
24
Para aislar las bacterias del suelo hay que realizar el mtodo de dilucin de suelo serial y
posteriormente sembrar en el medio de cultivo que se requiera para el estudio, incubando a una
temperatura ptima para el desarrollo de estas bacterias. Revisar peridicamente el cultivo
hasta que aparezcan las primeras colonias, las cuales se podrn observar a travs del
microscopio ptico utilizando las tcnicas del montaje en solucin salina, gota pendiente y para
conocer la abundancia de ellas en el suelo, realizar un conteo en placa o bien mediante el
mtodo del hematocitmetro calibrado.
Para conocer su ubicacin taxonmica se inicia con la elaboracin de una preparacin fija por el
mtodo de Gram y luego se realizan los cultivos puros para posteriormente sembrar en medios
especficos para observar que tipo de metabolismo realizan como podra ser la produccin de
cidos que actan como fermentadores de algunos compuestos carbohidratados,
caractersticas que nos ayudan a conocer su ubicacin taxonmica.
A continuacin se mencionar la composicin de algunos medios de cultivo que se utilizan con
mayor frecuencia en el estudio de bacterias (ver cultivos de bacterias Fig. 9). Para la
preparacin de los medios se deben disolver las sustancias en agua destilada caliente, aadir el
agar y calentar; normalmente se esteriliza a 15 libras de presin durante 20 minutos. Antes de
que se enfre el medio se vierte en las cajas Petri junto con el inoculo y se espera a que
solidifique para incubar de 3 a 4 das a la temperatura de 28C a 30C o en algunos casos
particulares puede variar, para que se desarrollen las colonias bacterias (Mac-Faddin, 1984;
Rickwood, 1997; Singleton, 1997).
MEDIO DE AGAR-EXTRACTO DE SUELO
Agar
15.0 g
0.4 g
K2 HPO4
(NH4)2 HPO4
0.5 g
0.05 g
Mg SO4.7H2O
0.1 g
MgCl2
Fe Cl3
0.01 g
0.1 g
CaCl2
Peptona
1.0 g
Extracto de levadura
1.0 g
Extracto de suelo
250 mL
Agua destilada
750 mL
Se ajusta a pH 7.4
Para ajustar el pH se utiliza NaOH, KOH y HCl 1 N, segn se requiera.
MEDIO DE GELOSA SIMPLE
(MEDIO GENERAL)
Extracto de carne
1.0 g
Peptona
1.0 g
Agar-agar
4.0 g
Agua destilada
200 mL
Microbiologa de Suelos
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Solucin A.- Disolver 0.6 g de cido sulfanilico en 70 mL de agua destilada caliente; se enfra la
solucin y se agrega 20 mL de HCl concentrado, diluir esta mezcla en 100 mL con agua
destilada.
Solucin B.- Agregar 0.6 g de a-Naftilamina en 10-20 mL de agua destilada y agregar 1 mL de
HCl concentrado, diluir y aforar a 100 mL con agua destilada.
Solucin C.- Disolver 16.4 g de CH-COONa.3H2 O (acetato de sodio) en 100 mL de agua
destilada. Se guardan por separado las soluciones en frasco mbar y en refrigeracin.
Para la identificacin de la presencia de Nitrosomonas se aaden tres gotas del reactivo de
Griess-llosvay al tubo de cultivo, la aparicin de un color rojo indica la presencia de nitritos.
MEDIO DE CULTIVO PARA Nitrobacter
El medio del cultivo lleva la misma composicin que el cultivo para Nitrosomonas excepto que el
sulfato de amonio es reemplazado por la misma cantidad de nitrito de sodio, con el mismo
tiempo de esterilizacin, incubacin y temperatura. Para la cuantificacin se le agregan tres
gotas del reactivo de Griess-llosvay, si el tubo permanece incoloro esto indica la presencia de
nitratos y por lo tanto el tubo ser positivo para Nitrobacter.
MEDIO DE CULTIVO PARA Azotobacter
Manitol
2.0 g
0.02 g
K2 HPO4
Agua destilada
100 mL
Ajustar el pH de 7.3 a 7.6
Se colocan 50 mL del medio de cultivo en un matraz de 250 mL, esterilizar y una vez fro
inocular con 0.1 0.2 g de suelo fresco. Se incuba de 25-30 C en la oscuridad hasta que se
desarrolle una pelcula sobre la superficie para lo cual tendr que hacerse un observacin al
microscopio a partir del tercer da. Ellas son clulas grandes en forma de bacilos cortos y
gruesos con extremos achatados (levaduriformes). Se debern purificar en el medio antes
mencionado solo que hay que agregarle 2 g de agar por cada 100 mL con el propsito de
solidificar y en este medio solo crecern organismos fijadores de nitrgeno, ya que el medio
carece de l.
AGAR DE ENDO
(Coliformes)
Fosfato de potasio
3.5 g
Peptona
10.0 g
Agar
15.0 g
Lactosa
10.0 g
Sulfito de sodio
2.5 g
Fucsina bsica
0.5 g
Agua destilada
1000 mL
pH final
7.4
Microbiologa de Suelos
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Este medio se utiliza para aislar coliformes y otros organismos entricos. El sulfito de sodio y la
Fucsina bsica inhiben el desarrollo de bacterias Gram-positivas; las colonias fermentadoras de
lactosa aparecen de color rosa o rojo, con un brillo metlicos. Se esteriliza a 15 libras de presin
durante 15 minutos y se incuba a 35 C.
MEDIO DE CULTIVO PARA BACTERIAS FITOPATOGENAS
Sacarosa
10.0 g
Casena cida hidrolizada
8.0 g
Extracto de levadura
4.0 g
2.0 g
K2 HPO4 (anhidro)
0.3 g
MgSO4 .7H2 O
Agar
15.0 g
Agua destilada
1000 mL
MEDIO DE CULTIVO GENERAL Y PARA MANTENERLOS
Glucosa
20.0 g
Extracto de levadura
10.0 g
20.0 g
CaCO3
Agar
15.0 g
Agua destilada
1000 mL
Los dos medios anteriores se esterilizan a 15 libras de presin durante 20 minutos y se
incuba de 28-30 C.
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X.-AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS
Los actinomicetos se pueden considerar como un grupo de transicin entre las bacterias
simples y los hongos, cuyos lmites se superponen con ambos. Los actinomicetos son
microorganismos que producen filamentos delgados, ramificados, que se desarrollan en un
"micelio" en todos los gneros del suelo, excepto el gnero Actinomyces, est filamento es largo
y puede fragmentarse en unidades pequeas.
Las hifas o filamentos son muy parecidas a la de los hongos, pero son muy delgados,
generalmente de 0.5 a 1 milimicra de dimetro, Gram-positivos y aerobios facultativos. Muchos
de estos actinomicetos producen esporas asexuales llamadas conidias, aisladas en pares o
formando cadenas y solo algunos producen estructuras especializadas como los esporangios
(Fig. 10). Se les encuentra en suelos ricos en materia orgnica, no toleran pH bajo, ni suelos
hmedos y con baja aireacin. Por regla general son saprobios, pero pueden provocar
enfermedades en las plantas, animales domsticos y el hombre ( Quintero, 1984; Alexander,
1990; Van, 1997)).
A pesar de estar asociados con las bacterias su relacin con los hongos se manifiestan en tres
propiedades:
* El micelio es externo y ramificado.
* Algunos actinomicetos presentan micelio areo.
* El crecimiento en cultivo liquido rara vez produce la turbidez asociada a las bacterias, produce
la formacin de filamentos, grumos o esferas.
El reconocimiento de los actinomicetos en placas de agar es relativamente sencillo, si se
incuban un tiempo largo las colonias tienen una consistencia firme y se adhieren al sustrato, en
algunos casos la superficie es pulverulenta pigmentada con esporas areas. Las estimaciones
por cuenta en placa proporcionan valores de 105 a 108 organismos/gramo de suelo, en zonas
templadas, tanto en terrenos vrgenes como terrenos cultivados y ellos constituyen del 10 al
50% de la comunidad total.
En el suelo encontramos gneros como Nocardia, Rhodococcus, Streptomyces (producen
antibiticos), Frankia (fija nitrgeno), Mycobacterium, Micromonospora, Thermonospora,
Chainia, Agromyces y otros. El gnero Streptomyces es el que produce un olor a tierra mojada
o a terrenos recin arados, caracterstica que se origina por una serie de metabolitos de
estreptomiceto denominados geosminas y es una sustancia formada de sesquiterpenoides,
anillos de carbono insaturado, oxigeno e hidrgeno.
El gnero Nocardia tiene semejanzas con las bacterias verdaderas ya que en su ciclo de vida
presenta un micelio rudimentario que se fragmenta con facilidad en clulas cortas semejantes a
bacilos y en medios lquidos forma turbidez.
Microbiologa de Suelos
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5.0 mL
2.0 g
1.0 g
15.0 g
1000 mL
5.0 mL (acuoso al 1 %)
15.0 g
2.0 g
1.0 g
0.5 g
0.5 g
0.01 g
30.0 g
1000 mL
30
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31
Fusarium
Aspergillus
32
Mucor
Penicillium
Trichoderma
Microbiologa de Suelos
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contienen al patgeno y a varios contaminantes, mientras que los dems tiempos no permiten el
desarrollo de cualquier microorganismo, debido a la accin del esterilizante de superficie. Los
cortes con tiempos intermedios permiten que slo el patgeno se desarrolle y forme colonias
puras en el cultivo, luego ests colonias se resiembran aspticamente para su cultivo (Fig. 13).
34
El hecho de que los cuerpos fructferos del hongo aparezcan sobre las hojas del hospedero
facilita su recoleccin y permite durante varios segundos aplicar el esterilizante de superficie
para luego ser sembrado en medio de cultivo o pueden tambin presionarse en una gota de
agua estril y diluir sus esporas en forma seriada con agua estril contenida en pequeos
tubos de ensayo; por ltimo algunas gotas de cada uno de los tubos de dilucin seriada se
colocan en un medio nutritivo, a fin de que se desarrollen las colonias libres de contaminantes.
Para aislar hongos patgenos de tallo o fruta, se puede realizar un corte de la parte infectada y
por la parte donde se hizo el corte se toma una pequea porcin con una asa flameada y luego
se coloca directamente en el medio de cultivo ( Mitchell, 1992).
Un mtodo que nos sirve para observar en forma intacta las estructuras de un hongo y nos
facilita su determinacin taxonmica es el mtodo del Microcultivo, que se puede realizar de la
manera siguiente en condiciones aspticas.
1.- Dentro de una caja Petri coloque un tringulo de tubo de vidrio y sobre de l acomode un
portaobjetos y cubreobjetos estriles.
2.- Con una esptula flameada corte varios cuadros de agar solidificado y esterilizado en una
caja Petri, de aproximadamente 0.5 a 1 cm, colquelos encima del portaobjetos, que esta
dentro de la caja Petri.
3.- Inocule en punto con una asa recta flameada en cada esquina del cuadro de agar y luego
coloque el cubreobjetos.
4.- Vierta unos 10 mL de glicerol al 10% en el fondo de la caja Petri, para mantener hmedo el
microcultivo.
5.- Incube a temperatura ambiente hasta notar crecimiento.
6.- Agregar de 3 a 4 gotas de formaldehido al microcultivo para inactivar al hongo por unos
minutos.
7.- En un portaobjetos limpio coloque una gota de azul de algodn, con una pinza de diseccin
flameada tome el cubreobjetos del microcultivo y colquelo en el portaobjetos con el colorante .
8.- Observe al microscopio.
Los hongos pigmentados no son fciles de observar al microscopio, y se recomienda el uso de
KOH al 10% o 30%, para aclarar y observar el color normal de las estructuras.
Tambin se pueden realizar preparaciones semipermanentes de hongos, para realizar con
mayor facilidad su determinacin y se utiliza la solucin de Lactofenol de Amman, la cual tiene
la siguiente composicin:
SOLUCION DE LACTOFENOL DE AMMAN
Fenol
20 mL
cido lctico
20 mL
Glicerol
40 mL
Agua destilada
20 mL
Azul de algodn
0.05 g
Todos los medios usados para cultivar hongos deben ser previamente esterilizados, los
matraces no deben llenarse demasiado para evitar que al hervir se derrame el medio, por
ejemplo, preparar medio litro de medio en un matraz de un litro, el cual alcanza para unas 20
cajas de Petri. A continuacin se mencionar la composicin de algunos medios de cultivo, los
cuales se esterilizan de 15 a 20 minutos a 15 libras de presin.
Microbiologa de Suelos
35
36
Los trozos de papa se cosen y se hacen papilla y se filtran a travs de varias capas de manta
de cielo y se aade el resto de los ingredientes al filtrado. En lugar de los trozos de papa se
puede usar papa para pur instantneo, y este es un medio favorable para muchos hongos y es
utilizado para cultivar hongos patgenos de plantas.
JUGO DE 8 VERDURAS AGAR (V-8 A)
Jugo V-8.. ..............180 mL
Carbonato de calcio.......2 g
Agar.. ..........................20 g
Agua destilada......1000 mL
El medio V-8 agar es un medio excelente general de uso rutinario. La mayora de los
ascomicetos esporulan bien en l, al igual que los mucorceos y muchos deuteromicetos. El
medio es cido (pH de 5.5) y el jugo V-8 puede sustituirse por jugo de tomate o zanahoria.
AGAR-AGUA (AA)
Agar...........................20 g
agua destilada......1000 mL
El medio de agar- agua es til cuando se requiere obtener un crecimiento micelial escaso, como
cuando se intenta aislar hongos del suelo y plantas, adems para inducir la esporulacin de
algunos hongos.
Hay muchos colorantes que pueden usarse para teir hongos como el azul de algodn y floxina
(soluciones acuosas al 0.5%), agregando una o dos gotas a un lado del cubreobjetos para teir
el material fngico.
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Las algas estn presentes casi en todos los suelos, pero no son tan numerosas como las
bacterias, actinomicetos y hongos. Son muy abundantes en hbitats en los cuales la humedad
es adecuada y la luz accesible, su desarrollo en la superficie de tierras vrgenes o cultivadas se
nota frecuentemente a simple vista con una coloracin verde sobre la superficie del mismo y es
debido a que poseen clorofila.
Las algas pueden ser unicelulares o pueden presentarse en pequeos filamentos, pero las
cepas del suelo, como grupo, son caractersticamente ms pequeas y estructuralmente menos
complejas que las algas acuticas. Las algas del suelo se dividen en Chlorophytas o algas
verdes, Cyanophytas o algas verde-azules, Bacillariophyta o ditomeas y Xanthophyta o algas
verde-amarillas (FIG. 14).
Gomphonema
Gonium
Pandorina
Nostoc
Volvox
Anabaena
Ceratium
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Los nematodos tienen un aspecto vermiforme, la mayora vive libremente en aguas dulces,
saladas y en el suelo alimentndose de plantas y animales microscpicos. Se sabe que
centenares de ellos viven como parsitos y se alimentan de plantas vivas, en las que producen
una gran variedad de enfermedades (Edwards, 1995).
Los nematodos fitopatgenos son organismos pequeos de 300 a 1000 micrmetros, con
formas de anguila y en un corte transversal se ven redondos, de cuerpo liso no segmentado, sin
apndices. Sin embargo las hembras de algunas especies se hinchan en la madurez y
adquieren la forma de una pera o cuerpos ovoides (Fig. 16); su cuerpo es ms o menos
transparente, cubierto por una cutcula incolora, la cual mudan en sus diferentes etapas
larvarias. Su ciclo de vida lo llevan a cabo en 3 o 4 semanas en condiciones ambientales
ptimas, con temperatura clida.
La mayora de los nematodos fitopatgenos viven parte de su ciclo de vida en el suelo, en
forma libre, alimentndose de races y tallos subterrneos. La temperatura, humedad y
aireacin del suelo afectan su sobrevivencia y se les encuentra a profundidades de 0 a 15 cm
en forma comn y algunas veces en profundidades mayores en torno de races de plantas
susceptibles, con suelos muy hmedos (Christie,.1986).
Los pocos nematodos que atacan a los rganos areos de la plantas llegan en salpicaduras
cuando llueve o cuando se riega, o suben por s mismos a las superficies hmedas de las hojas
o tallos de las plantas. Estos nematodos parsitos pueden ser Ectoparsitos o Endoparsitos,
pero en forma general se aislan de la races de las plantas que infectan o del suelo en torno a
las races de las que se alimentan. Ambos grupos pueden ser migratorios, es decir, viven
libremente en el suelo y se alimentan de las plantas sin que se fijen a ellas o se mueven dentro
de la planta, tambin pueden ser sedentarios, es decir, las especies una vez que han
penetrado en la raz permanecen fijas a ellas (Eisenback, 1983; Richards, 1987; Werner, 1992).
Los nematodos ectoparsitos incluyen a los nematodos anillos (sedentarios) y a los nematodos
daga, picador y de la raz escobilla (todos migratorios). Los nematodos Endoparsitos incluyen
a los enquistados, de los ctricos y del nudo de la raz (todos sedentarios) y a los nematodos
esprale lanza inductor de lesiones, del bulbo y del tallo, perforador, foliar y del achaparramiento
de las plantas (Migratorios).
Los nematodos se pueden aislar de muestras frescas de suelo de 100 a 300 g, mediante los
mtodos del Embudo de Baermann, Tamizado y de Centrifugacin o de Flotacin del azcar.
La poblacin de nematodos extrada se coloca en un recipiente con poca agua para contarlos
en una alcuota conocida y as proceder a su fijacin.
Para su fijacin, primero se relajan, para ello se aplica un calentamiento lento progresivo en la
suspensin donde se encuentran hasta que e inmovilizan. Luego se transfiere al fijador que
puede ser formalina al 2.5-5 % y se deja en l, de 5 a 6 das. Posteriormente se deshidrata en
una mezcla de etanol, glicerina y agua destilada (20:1:79), luego se deja evaporar la mezcla y
se aade de una nueva mezcla de glicerina y etanol ( 7:93 ) y por ltimo se le agrega glicerina
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pura deshidratada. Al final los organismos se colocan en una cmara desecadora la cual
contiene CaCl2, hasta su montaje.
Cuando los especmenes estn deshidratadas, pueden montarse de glicerina pura sobre
portabjetos, cubrindolos con un cubreobjetos y sellando los bordes con barniz de uas
transparentes (Alexander, 1990; Agrios, 1996).
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de precipitado se invierte entonces en el embudo con el trozo de tela y todo el suelo se sumerge
en el agua, dejndolo as durante toda la noche o por varias horas.
Los nematodos vivos se mueven activamente y migran a travs de la tela o el papel poroso
hacia el agua y se sumergen hasta el fondo del tubo de goma inmediatamente por arriba del
nivel donde se encuentra la abrazadera. Ms del 90% de los nematodos vivos se colectan en el
primer volumen de agua (5 a 8 mL) acarreada desde el tubo de goma y esta muestra se coloca
en una caja Petri para examinarla al microscopio o bien para aislar individualmente a los
nematodos.
Para aislar los nematodos de las plantas, se cortan en trozos muy pequeos y se vierten en el
embudo de Baermann segn el mtodo antes descrito.
METODO DEL TAMIZADO
El mtodo por tamizado se basa en el hecho de que cuando una pequea muestra de suelo, por
ejemplo: 300 g de suelo se mezclan con un volumen mucho mayor de agua ( 2 litros), los
nematodos flotan en el agua, colectndose en tamices con poros pequeos. El procedimiento
es el siguiente:
* Se mezcla la muestra de suelo con el agua.
* Se agita y se deja que repose durante 30 segundos.
* El sobrenadante se cuela en un tamiz de 20 mallas (20 orificios por pulgada), el cual retiene a
los residuos de gran tamao, pero permite que los nematodos se cuelen hasta el frasco
receptor.
* El lquido que contiene a los organismos se vierte despus a travs de un tamiz de 60 mallas,
el cual retiene a los de gran tamao y algunos residuos, pero deja pasar los nematodos ms
pequeos y se colectan en otro recipiente.
* Est ltimo lquido se pasa a travs de un tamiz de 200 mallas, el cual retiene a los
nematodos pequeos.
* Ambos tamices de 60 y 200 mallas se lavan de 2 a 3 veces para remover los residuos y los
organismos se colectan en cajas Petri con agua para su examen directo y posteriormente
aislarlos.
METODO DE CENTRIFUGACION O DE LA FLOTACION DEL AZUCAR
El mtodo de centrifugado consiste en mezclar una cantidad de suelo con agua dentro de un
vaso de precipitado, agitar, luego vaciar la mezcla en tubos de centrifuga y se hacen girar a
3000 r.p.m. durante 4 minutos, posteriormente se tira el sobrenadante quedando los nematodos
y residuos en el fondo del tubo, luego se llena el tubo a la mitad con una solucin de azcar
(453 g/L de agua), se tapa el tubo y se agita hasta que se suspenda el sedimento, se llena el
tubo con la solucin de azcar y se centrifuga a 300 rpm durante 30 a 120 segundos. Los
nematodos se mantienen suspendidos en el sobrenadante, el cual se decanta en un tamiz fino
quedando atrapados en l, con agua se elimina la solucin azucarada que los cubre lo ms
rpido posible y por ltimo los nematodos limpios se vierten en una caja Petri para efectuar una
cuantificacin y hacer observaciones.
Microbiologa de Suelos
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XV .- BIBLIOGRAFA
Agrios, G.N. 1996. Fitopatologa. Ed. Limusa. Mxico.
Alexander, M. 1990. Introductin to Soil Microbiology.Ed. John Wiley & Sons. New York.
Alexopoulos, C.J. and C.W.Mims.1979. Introductory mycology. Ed. John Wiley & Sons, New
York.
Atlas , R. M. and Bartha, R.. 1993. Microbial Ecology. The Benjamin / Cumming Publishing
Company, Inc. New York. USA.
Bradshaw, J. L. 1976. Microbiologa de Laboratorio. Ed. El Manual Moderno S.A. Mxico.
Brock, D.T. 1978. Biologa de los Microorganismos. Segunda Edicin. Ed. Omega. Barcelona,
Espaa.
Brock, T. D, Smith, D. W. y Madigan, M. T. 1997. Microbiologa. Ed. Prentice-Hall
Hispanoamericana, S.A. Mxico.
Burges, A. 1971. Biologa del Suelo. Ed. Omega. Barcelona, Espaa.
Burgess, J., Marten, M. and Taylor R. 1990. Under The Microscope. Cambridge university
Press. New York, USA.
Christie, J.R. 1986. Nematodos de los vegetales. Ed. Limusa. Mxico.
Costilla, M.A.1969. Nematologa Agrcola. Ed. Hemisferio Sur. Chile.
Cullimore, D.R. 1992. Practical Manual of Groundwater Microbiology. Lewis Publishers .
Michigan , USA.
Davis, Dulbecco, Fisen y Ginsberg. 1985. Tratado de Microbiologa. Ed. Salvat S.A. Espaa
Delaat. A.N.C. 1985. Microbiologa. Segunda Edicin. Ed. Interamericana. Mxico.
Daz, R., C. Gamazo e I. Lpez-Goi. 1998. Manual prctico de Microbiologa. Ed. MASSON,
S.A. Espaa.
Edwards, C.A., Steiner, B.R. Stinner, D. and Rabatin, S. 1995. Biological Interactions in soil.
Elsevier SciencePublishiny company Inc. New York, USA.
Echegaray, A. 1993. Microbiologa de Suelos. Chapingo. Mxico.
Eisenback, J.D., Hirschmann, H. y Sasser, J.N. 1983. Gua para la identificacin de las cuatro
especies ms comunes del nematodo agallador (Meloidogyne Especies).Colegio de
Postgraduados, Chapingo, Mxico.
46
Microbiologa de Suelos
47
Richards, B.N. 1987. The Microbiology of Terrestrial Ecosystems. Longman Scientific Technical.
Jhon Wiley & Sons, Inc. New York, USA.
Rickwood, D. and Hames, B.d. 1997. Bacterial Cell Culture. E d.
Rose, A. H. 1977. Microbiologa Qumica. Ed. Alhambra S.A. Madrid, Espaa.
Schlegel, H:G: 1990. General Microbiology. Ed. Cambridge Universty Press. New York. USA.
Singleton, P. 1997. Bacteria in biology, biotechnology and medicina. Ed. John Wiley & Sons.
New York. USA.
Sprent, J.I. And Sprent, P. 1990. Nitrogen Fixing Organisms. Chapman and Hall. University
Press, Cambridge.
Stainer, R.Y., Ingraham, J.L. and M.L. Wheelis. 1986. The Microbial World. Ed. Prentice- Hall.
New Jersey. USA.
Stainer, R.Y., Ingraham, J.L. and
Revert, S.A. Espaa.
Ulloa, M. y Hanlin, H. 1978. Atlas de Micologa Bsica. Ed. Concepto S.A. Mxico.
Van, E.J.D., Trevors, J.T. and Wellington, H.M.E. 1997. Moderm Soil Microbiology. Marcel
Dekker,Inc. New York. USA.
Werner, D. 1992. Symbiosis of Plants and microbes. Ed. Chapman and Hall.. Germany.
Microbiologa de suelo
Entre todas las ciencias que estudian seres vivos, la
Microbiologa es, probablemente, la nica que se ocupa de
todos los aspectos relativos a los organismos que
constituyen su objeto de estudio. Se trata, por tanto, de una
biologa general de los microorganismos, entendiendo por
tales aquellos organismos que son invisibles al ojo humano,
sin ayuda de un instrumento ptico que ample su imagen, y
que son o bien unicelulares o bien pluricelulares pero con una
organizacin biolgica muy simple. Por consiguiente, la
Microbiologa se ocupa tanto del estudio de las
caractersticas inherentes a los microorganismos, tales como
su estructura celular, su bioqumica, su fisiologa y su
gentica, entre otras, as como sus actividades y sus
interacciones con otros seres vivos y con el medio en el que
habitan.
Entre estas ltimas se encuentran aqullas
caractersticas que tienen que ver con el papel de los
microorganismos como transformadores de la materia
orgnica e inorgnica y por tanto, con la participacin de los
microbios en los ciclos de los elementos en la naturaleza, as
como aqullas que hacen que muchos de ellos se comporten
como agentes patgenos de animales y vegetales, aspectos
todos ellos de indudable inters en la agricultura.
PAPIME EN216403
ISBN: 970-32-1907-1