Anda di halaman 1dari 140

PROGRAMA DE DOCTORADO BIOLOGA APLICADA A LA

SOSTENIBILIDAD DE RECURSOS NATURALES

DEPARTAMENTO DE BIOLOGA FUNCIONAL


(REA DE MICROBIOLOGA)

Caracterizacin mediante Biologa de Sistemas


del ciclo de desarrollo de Streptomyces y sus
aplicaciones biotecnolgicas

Paula Yage Menndez


Oviedo, 2012

RESUMEN (en Ingls)


Despite the fact that most industrial processes for secondary metabolite production are
performed with submerged cultures, a reliable developmental model for Streptomyces under
these culture conditions was lacking. With the exception of a few species which sporulate under
these conditions, it was assumed that no morphological differentiation processes take place. In
this thesis, we describe new developmental features of Streptomyces growing in liquid cultures
and integrate them into a developmental model analogous to the one previously described for
solid sporulating cultures. We also discovered by first time in Streptomyces the mycelial
structure producing secondary metabolites.
In addition, we compare the proteomes and transcriptomes of the different developmental
stages in liquid and solid S. coelicolor cultures. We demonstrate that differentiation in S.
coelicolor liquid cultures is comparable to solid cultures. The most remarkable differences
between solid and liquid cultures were associated with the final stages of hyphae
compartmentalization and spore formation, but not those involved in the onset of differentiation
and secondary metabolite production.
We also used transcriptomics and high-throughput quantitative proteomics to analyse genes
and proteins involved in Streptomyces cell death. We demonstrated that this process involves
the induction of specific proteins and genes, fulfilling the characteristics of a programmed cell
death (PCD). Results gave us a new perspective about Streptomyces development in which
PCD would be part of a competence-like process essential for the differentiation of a
reproductive phase (k-state) producing antibiotics and spores. We hypothesize about the
biological meaning of Streptomyces PCD, as a process in which differentiated hyphae would
become competent and would take free DNA fragments released by dying cells. This, in
conjunction with the vast recombination and transposition activities induced during PCD would
suppose an extraordinary ecologic advantage generating a huge genetic variability in spores in
an analogous way to eukaryotic meiosis.

SR.DIRECTORDEDEPARTAMENTODEBIOLOGAFUNCIONALANTONIOFUEYO

SR.PRESIDENTEDELACOMISINACADMICADELPROGRAMADEDOCTORADOEN
BIOLOGAAPLICADAALASOSTENIBILIDADDERECURSOSNATURALES

T | twx

Agradecimientos
La realizacin de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a mucha gente
que dentro y fuera del mundo cientfico me han prestado su ayuda, apoyo y
confianza.
Al Catedrtico Jess Snchez Martn, director de esta tesis doctoral, por
haberme dado la oportunidad de trabajar en su laboratorio, y su enseanza
a lo largo de estos aos.
Al Dr. ngel Manteca Fernndez, codirector de este trabajo, por la ayuda
prestada, los sabios consejos y la paciencia demostrada.
Al Catedrtico Juan Francisco Martn, por permitirme la estancia en el
Instituto de biotecnologa de Len sin la cual no habra sido posible la
realizacin de este trabajo.
Al Dr. Antonio Rodrguez Garca, por su paciencia, su capacidad docente y el
tiempo invertido en mi formacin y en el tratamiento estadstico de
nuestros datos, que le han dado ms de un dolor de cabeza.
Tambin han sido muy importantes durante esta andadura la Dra. Anabel
Pelez, la voz de la experiencia para todos los doctorandos del J, y el
apoyo en los momentos de estrs. Celia, Ivn, Victoria y Luis por su fuerza y
sus ganas de trabajar, su generosidad a la hora de ayudar dentro y fuera
del laboratorio y su increble ingenio en todas las situaciones.
A Jessica, David, Roberto, Esther y Desir, los Gijarritos, con los que he
tenido las mejores conversaciones sobre poltica, tica, religin, y en
ocasiones incluso ciencia! palabra de Brock. Porque son gente con la
siempre me ira de caas aunque hay una cosa que se llama investigacin y
la tenemos muy presente.
A Maite, BeaLab y BeaTec, mis nuevas compaeras de laboratorio, por las
risas compartidas en estos sus primeros meses aqu que han sido los mos de
escritura de tesis. Por hacerme reir siempre y aguantarme pretsica y como
no, por su inestimable ayuda con esta herramienta infernal llamada
Microsoft Word.
A OVIEDOTEC; Rubn, Vanesa, Rebeca, Mafe, Fernando, Jose, Charly, por
la buena acogida que siempre han tenido para m en tierras leonesas.

A mis estimadas doctoras: Miriam, por su meticulosa ayuda con Tsuku, los
mojitos y las croquetas. A Lorena, mi casa en Len, por show me and
support me to mutate, por sus enseanzas sobre ciencia y porque nunca le
falta una sonrisa.
A Pilar, Rafa, Cova, Carlos, y Sofa por seguir estando ah diez aos despus,
porque Slo los mejores sobreviven.
A Anna, porque empezamos juntas esta aventura que ahora est a punto
de terminar para las dos, y desde entonces hemos aprendido, madurado y
cambiado nuestra forma de ver la ciencia y la vida. grazie per tutto

Itaola

A Willy por intentar entender la biologa desde el punto de vista de una


microbiloga y olvidar las matemticas, y la qufica. Por su confianza.
Por ltimo, me gustara agradecer a mis padres y mi hermana su continuo
apoyo, su inters, y su nimo.

NDICE

I.INTRODUCCIN....1
I.1.CARACTERSTICASGENERALESDELGNEROSTREPTOMYCES3
I.2.CICLODEVIDADESTREPTOMYCES...4
I.2.1.CICLODEVIDATRADICIONAL..4
I.2.2.UNNUEVOMODELODEDESARROLLO..7
I.2.3.

RUTAS

BIOQUMICAS

REGULANDO

LA

DIFERENCIACIN

DE

STREPTOMYCES...8
I.3. LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA (MCP): UN SUCESO CLAVE PARA LA
DIFERENCIACINYPRODUCCINDEMETABOLITOSSECUNDARIOS.10
I.3.1.ELORIGENDELAMUERTECELULARPROGRAMADAENEUCARIOTAS..10
I.3.2.LAMUERTECELULARPROGRAMAENSTREPTOMYCES.12
I.4.ORGANIZACINGENMICADELGNEROSTREPTOMYCES..14
I.5.CICLODEVIDAENCULTIVOSLQUIDOS(FERMENTACIONES).16
I.6.LAERAMICA.FUNDAMENTOSDETRANSCRIPTMICAYPROTEMICA17
I.6.1.TRANSCRIPTMICA...18
I.6.2.PROTEMICA....20
I.7.OBJETIVOS...24
II.MATERIALYMTODOS...25
II.1.ANLISISTRANSCRIPTMICODELCICLODEVIDA.27
II.1.1.DISEODELEXPERIMENTO......27
II.1.2.PREPARACINDELAMUESTRASDESTREPTOMYCES....28
a)Muertecelularprogramada:separacindeclulasvivasymuertas...28
b)Desarrolloencultivosslidos:separacindelmicelioIyelmicelioII......................28
II.1.3.LISISYHOMOGENEIZACINDELMICELIO.29
II.1.4.EXTRACCINCUANTIFICACINYANLISISDELAPUREZADELARN...29
II.1.5.MARCAJEDELARNYELADNCROMOSMICOCONCY3YCY5...30
II.1.6.HIBRIDACIONCONMATRICESAGILENTTECHNOLOGIES..30
II.1.7.LAVADODELASMATRICES,ESCANEADOYLECTURADEDATOS....31
II.1.8.ANLISISESTADSTICODELOSDATOS....31
II.2. ANLISIS PROTEMICO DE LOS PROCESOS DE MUERTE CELULAR
PROGRAMADA..32
II.2.1.RECOGIDADEMUESTRAYFRACCIONAMIENTO.....32

II.2.2. SEPARACIN DE PROTENAS, DIGESTIN Y MARCAJE ISOBRICO


(ITRAQ)...32
II.2.3. ANLISIS DE PPTIDOS MARCADOS POR ITRAQ MEDIANTE NANO HPLC Y
ESPECTOMETRADEMASASENTANDEM..33
II.2.4.ANLISISBIOINFORMTICODELOSDATOS...34
II.3. OBTENCIN DE MUTANTES MEDIANTE LA COLECCIN DE CSMIDOS CON
INSERCIONESDELTRASPOSNTN5062..35
II.4. ANLISIS MORFOLGICO DE CULTIVOS LQUIDOS DE STREPTOMYCES:
FERMENTACIONES..37
II.4.1.MICROORGANISMOSUTILIZADOS.....37
II.4.2.MEDIOSDECULTIVO.....38
II.4.3.CONDICIONESDECULTIVO....40
II.4.4.CUANTIFICACINDEANTIBITICOS...41
II.4.5.MEDIDADEACTIVIDADHEXOQUINASA...42
II.4.6.GELESDEACTIVIDADNUCLEOLTICA:ZIMOGRAMAS....42
II.4.7.CUANTIFICACINDELOSRIBODESOXIRRIBONUCLETIDOSLIBRES..42
II.4.8.TCNICASDEFLUORESCENCIA.43
a) Tincindeviabilidadcelular..43
b) Tincindemembranas..43
c) Tincindeparedescelulares.44
d) Expresindelaprotenaverdefluorescente..44
II.4.9.

ANLISIS

FLUORIMTRICOS

DE

LA

DIFERENCIACIN

EN

FERMENTACIONES..44
III.RESULTADOS.....46
III.1.ANLISISMEDIANTETCNICASDEBIOLOGADESISTEMAS(TRANSCRIPTMICAY
PROTEMICA)

DE

LOS

PROCESOS

DE

DIFERENCIACIN

DE

STREPTOMYCES....48
III.1.1. TRANSCRIPTMICA DE LOS GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESADOS
DURANTE LAS FASES DE MI Y MII EN CULTIVOS SLIDOS DE S.
COELICOLOR...48
a) Fraccionamiento de las fases de MI y MII en cultivos slidos de S. coelicolor
M145..............................................................................................................................48

b)IdentificacinycuantificacindelosgenesdeS.coelicolorM145diferencialmente
expresadosduranteeldesarrollo....49
III.1.2. PROTEMICA Y TRANSCRIPTMICA DE LAS PROTENAS Y GENES
DIFERENCIALMENTEEXPRESADOSDURANTELOSPROCESOSDEMCP...54
a) Fraccionamiento de clulas vivas y muertas durante los procesos de MCP en
StreptomycescoelicolorM14554
b) Identificacin y cuantificacin de las protenas de Streptomyces coelicolor M145
diferencialmenteexpresadasdurantelaMCP...57
c) Identificacin y cuantificacin delos genes de S. coelicolor M145 diferencialmente
expresadosdurantelaMCP....59
d) Diferencias ms importantes entre los proteomas/transcriptomas de las clulas
vivasymuertas..61
III.2.ANLISISFUNCIONAL:MUTAGNESIS..63
III.3.OPTIMIZACINDELAPRODUCCINDEANTIBITICOSENCULTIVOSLQUIDOSDE
STREPTOMYCES.67
III.3.1.DESARROLLOYDIFERENCIACINDESTREPTOMYCESCOELICOLORM145
ENCULTIVOSLQUIDOS..67
a) Estudio mediante microscopa lser confocal de los procesos de muerte y
diferenciacin.67
b) Estudio de la compartimentalizacin de las hifas en cultivos lquidos de s.
coelicolor...70
c) Los procesos de muerte/diferenciacin en cultivos lquidos de s. coelicolor se
reflejanenlascurvasdecrecimiento...72
d)Marcadoresbioqumicosevidencianlaexistenciadeunamuertecelularprogramada
encultivoslquidosdeS.coelicolor.74
e)Laproduccindeantibiticoencultivoslquidosdestreptomycescoelicolorm145se
correlacionaconlosprocesosdedesarrollo/diferenciacin.76
III.3.2. OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN DE ANTIBITICO EN DISTINTAS
ESPECIES DE STREPTOMYCES MEDIANTE LA MODIFICACIN DE LOS PARMETROS DE
DESARROLLO/DIFERENCIACINENMEDIOLQUIDO....78
a)Streptomycescattleya:produccindetienamicina...78
b)Streptomycestsukubaensis:productordetacrolimus..82

III.3.3. UN NUEVO MTODO DE MONITORIZACIN ON LINE DE LAS


FERMENTACIONESINDUSTRIALES..86
IV.DISCUSIN...90
V.CONCLUSIONES...103
VI.BIBLIOGRAFA....107

Abreviaturas

ADNc:ADNcomplementario
ADNg:ADNgenmico
Amp:Ampicilina
ATCC:americantypeculturecollection
BSA:seroalbuminabovina
CIA:Cloroformoisoamilico.Mezclar24partesdecloroformoy1dealcoholisoamilico.
Clo:Cloranfenicol
Cy3:Cianina3
Cy5:Cianina5
DTT:ditiotreitol
EDTA:cidoetilendiaminotetraactico
FM464: N(3triethylammoniumpropyl)4(4diethylaminophenylhexatrienyl)
pyridiniumdibromide.
GFP:Greenfluoresceinprotein
GLM:glucosa,levadura,malta
IP:iodurodepropidio
iTRAQ:isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation
Km:Kanamicina
LB:LuriaBertani
LCMS/MS:CromatografaLquidaacopladaaespectrometrademasas
MCP:Muertecelularprogramada

MI:MicelioI
MII:MicelioII
MOPS:cido3(Nmorfolino)propanesulfonico
ORF:OpenReadingFrames
PBS:PhosphateBufferSaline
PLG:PhaseLockGel
SDS:docedilsulfatosodico
SDSPAGE:sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis
SFM:SoyFlavourManitol
THG:Transmisinhorizontaldegenes
TSB:TrypticSoyBroth
WGA:Aglutininadegermendetrigo
YEDPA:YeastExtractDextrosePeptoneAgar

Ferdinand Julius Cohn

Louis Pasteur

I. INTRODUCCIN

I.INTRODUCCIN

I.INTRODUCCIN

I.1.CARACTERSTICASGENERALESDELGNEROSTREPTOMYCES
Streptomyces pertenece a la familia Streptomycetaceae y al orden de los
Actinomicetales(Garrityetal.,2007,LilburnyGarrity2004).Losactinomicetosfueron
descubiertosafinalesdelsigloXIXcomolosorganismosproductoresdecompuestosa
losquesonsensiblesloscausantesdealgunasenfermedadesmortalescomolaleprao
la tuberculosis (Hansen, 1874; Koch, 1982, citado por Hopwood, 2007). Este orden,
engloba bacterias filamentosas, miceliales, grampositivas (Christian Gram, 1884),
aerobias,capacesdeutilizarungrannmerodecompuestosorgnicoscomofuentede
carbonoyenerga.Estnampliamentedistribuidosenlanaturaleza,siendoelsuelosu
hbitatmscomn,dondecontribuyenalosciclosbiogeoqumicosdedegradacinde
lamateriaorgnica.
Actualmente

hay

caracterizadas

ms

de

500

especies

(http://www.bacterio.cict.fr/s/streptomycesb.html). El primer Streptomyces descrito


data del ao 1875 (Cohn 1875, citado por Hopwood, 2007). Y nombrado as (hongo
enrollado), tras la clasificacin del grupo de los Actinomycetales realizada por
Waksman y Henrici en 1943. En ese mismo ao, el estudiante de doctorado Albert
Schatzabordelretodelabsquedadeunantibiticoparacombatirlatuberculosis.
Trabaj slo, en un laboratorio instalado en un stano en el Cook College en la
Universidad de Rutgers (New Jersey). El 19 de octubre de 1943 aisl dos cepas de
Streptomyces griseus que podan detener el crecimiento de ciertas bacterias
resistentes a la penicilina debido a la produccin de estreptomicina. El alto poder
antibitico de la estreptomicina contra Mycobacterium tuberculosis se consider de
talimportanciaqueen1952seleotorgaSelmanWaksman,supervisordeltrabajode
Schatz,elpremioNobeldemedicina.Durantelassiguientesdcadas,(especialmente
entrelosaos1950y1980),sedescubrieronmuchosantibiticosendiversasespecies
deactinomicetos(lallamadaEdaddeOrodelosantibiticos),convirtindosestos
enelgrupodemicroorganismosmsutilizadosenlaindustriafarmacutica(Hopwood,
2007).
Desde el punto de vista biotecnolgico, la importancia de estos
microorganismos radica en su capacidad de producir una gran diversidad de
3

I.INTRODUCCIN
metabolitossecundarios,lamayoradeellosconactividadbiolgica.Dentrodeestos
metabolitos secundarios se encuentran desde antibiticos y antitumorales hasta
inmunosupresores o antifngicos. Las bacterias del gnero Streptomyces son
productoras de ms de la mitad de los antibiticos de inters en biomedicina y
agricultura. La mayora de las especies de Streptomyces producen geosmina (del
griego;aromadelatierra),unmetabolitosecundarioresponsabledesutpicoolora
tierramojada.Adems,sehacomprobadoqueciertosgusanossonatradosporesta
sustancia,porloqueparecequelasesporasdeStreptomycespodranestaradaptadas
tantoparaladispersinareacomozoognica(Hopwood,2007).
Los estreptomicetos tambin son productores de gran cantidad de enzimas
extracelulares de inters en el sector industrial, entre las que destacan proteasas
(Henderson et al., 1987), celulasas, nucleasas, amilasas (Long et al., 1987), lipasas
(Jimnezetal.,1987),quitinasasyxilanasas(Morosolietal.,1986).

I.2.CICLODEVIDADESTREPTOMYCES
I.2.1.CICLODEVIDATRADICIONAL
El hbitat principal de Streptomyces es el suelo (Hagedorn, 1976), aunque
existen especies capaces de habitar el agua dulce o marina (Cross, 1981) y el aire
(Lloyd,1969).Unaspocassonpatgenasdeplantasyanimales(BouchekMechicheet
al., 2006; Quintana et al., 2008), aunque se han encontrado cepas en pulmones de
pacientesconinfeccionescrnicas(Mantecaetal.,2008)oinmunodeprimidostrasun
postoperatorio(Mantecaetal.2009).
Streptomyces es capaz de utilizar como fuente de carbono azcares,
polisacridos, alcoholes, cidos orgnicos, aminocidos y compuestos aromticos
(Williamsetal.,1983).Suhabilidadparacolonizarelsuelosedebeprincipalmenteala
capacidaddeformaresporasresistentesalasequedadqueenmuchoscasossedaen
dicho sustrato. Las esporas pueden permanecer latentes en el suelo varias dcadas
hasta que las condiciones ambientales proporcionen la humedad y los nutrientes
necesariosparaquestasgerminen.
Losestreptomicetospresentanunciclodevidacomplejoqueimplicaprocesos
de diferenciacin morfolgica y fisiolgica. Estas bacterias son capaces de colonizar
sustratos relativamente secos con restos de materia orgnica, formando una red de
4

I.INTRODUCCIN
hifas ramificadas que dan lugar al llamado micelio sustrato. Estas hifas obtienen los
nutrientes de la degradacin del material orgnico insoluble gracias a numerosas
enzimas hidrolticas (Chater, 1984). De forma clsica, se describe cmo las zonas del
micelio sustrato ms alejadas de la fuente de nutrientes empiezan a acumular
sustanciasdereserva(lpidos,glucgeno,),hastaqueenundeterminadomomentoy
debido a la carencia de nutrientes, se reciben una serie de seales que disparan la
expresindegenesimplicadosenlaformacindelllamadomicelioareo.Seproduce
as, el desarrollo de las hifas areas que emergen desde el micelio sustrato, se
desarrollanenelaire,yformancubiertashidrofbicasensusuperficie.Estashifasse
van a nutrir de los productos de degradacin del micelio sustrato, y en una segunda
etapavanasufrirunprocesodeenrollamiento,formacindeseptosyengrosamiento
delaparedcelularparadarlugaracadenasdeesporasuninucleares,queseliberarn
almedioyenlascondicionesadecuadas,germinarnydesarrollarnunnuevomicelio
sustrato (Figura 1). Ambos micelios, sustrato y areo son multinucleados, siendo las
esporaslanicafaseuninucleada(Claessenetal.,2006;FlrdhyButtner,2009).
A pesar de que el ciclo de desarrollo de Streptomyces se ha estudiado
fundamentalmenteenmedioslido,lamayoradelasfermentacionesindustrialesse
realizanencultivoslquidos(grandesbiorreactores),condicionesenlascualesnohay
procesos de esporulacin ni formacin de las cubiertas hidrofbicas; por lo que se
asuma que no haba diferenciacin. En consecuencia, los metabolitos secundarios
seranproducidosporelmiceliosustrato(StocksyThomas,2001;Denseretal.,2002;
Denseretal.,2004).

I.INTRODUCCIN

Fig.I.1.(a)CiclodedesarrollodeStreptomycesencultivosdeslidos;(b)Estructura
transversaldelacapademicelio(adaptadodeKieseretal.,2000).

I.INTRODUCCIN

I.2.2.UNNUEVOMODELODEDESARROLLO
En los ltimos aos nuestro grupo de investigacin ha realizado un anlisis
detallado del ciclo de diferenciacin de Streptomyces en cultivos slidos (en placa),
condiciones en las cuales Streptomyces sufre un proceso de diferenciacin que
conducealaformacindeesporas(VaseapartadoanterioryFig.I.1).Paraellosehan
utilizado colorantes fluorescentes de viabilidad y membranas, indicadores
fluorescentes de actividad celular, microscopa de fluorescencia confocal y diversos
marcadoresbioqumicosdemuertecelular(nucleasas,aminocidoslibres,yliberacin
delenzimacitoslicohexoquinasaalmedioextracelular),crecimiento(pesoyprotena)
ydiferenciacin(produccindeantibitico).Contodoesto,sedescubrilaexistencia
de un micelio joven totalmente compartimentalizado (MI) que se muere
tempranamente siguiendo un patrnmuy ordenadoqueconducea laalternanciade
segmentosvivosymuertosenlamismahifa(Mantecaetal.,2005a,b;Mantecaetal.,
2006a). Posteriormente, los segmentos de este MI que permanecan viables
comienzan a alargarse y crecer como un micelio multinucleado (MII). En cultivos
slidosexistendostiposdeMIIenfuncindelaausencia (desarrollotemprano)ola
presencia (desarrollo tardo) de las cubiertas hidrofbicas caractersticas de las hifas
areas (Manteca et al., 2007). El llamado micelio sustrato (vegetativo) en el ciclo de
desarrollo tradicional se corresponde con el MII multinucleado temprano que carece
delascubiertashidrofbicas(Mantecaetal.,2007)(Fig.I.2).SehapropuestoqueelMI
compartimentalizadoeselautnticomiceliovegetativodeStreptomycesenlossuelos
naturales (Manteca y Snchez, 2009b), y que los MII temprano (sustrato) y tardo
(areo) deberan ser considerados como parte de la misma fase reproductiva, dado
queambosestndestinadosalaesporulacin(MantecaySnchez,2009b).

I.INTRODUCCIN

Fig.I.2. Ciclo de desarrollo de S. coelicolor en cultivos slidos (esporulantes) Panel


superior:esquemailustrandolosdiferentestiposdemicelio(MIyMII).Semuestrala

nomenclaturaclsicademiceliosustratoyareo,ascomolascubiertashidrofbicas

del micelio
areo. MCP; muerte celular programada Panel inferior: Imgenes de
microscopa
lser confocal mostrando los septos (flechas) de los diferentes tipos de

micelio teidos con el colorante de membranas FM464, en el caso del MI, o el

colorantedeparedcelularWGAenelcasodelMIIylasesporas.

I.2.3.RUTASBIOQUMICASREGULANDOLADIFERENCIACINDESTREPTOMYCES
Tal como se coment arriba, el ciclo de desarrollo tradicional se ha centrado
principalmente en las fases de esporulacin que tienen lugar en cultivos slidos (Fig.
1).Losanlisisdecepasmutantesbloqueadasendiferentesestadosdeesporulacino
formacindecubiertashidrofbicashanconducidoaldescubrimientodelosgenesque
regulanestosprocesos:losgenesbald,cuyamutacinimplicalaausenciademicelio
areo(calvo),regulanlaactivacindelaskypathwayquecontrolalaproduccin
de las protenas que formarn las cubiertas hidrofbicas del micelio areo (rodlinas,
chaplinas, ramS); a continuacin se activan los llamados genes white, cuyos
mutantessondefectivosenlasfasesdeesporulacin(semantienenenfasedemicelio
areo, caracterizado por un color blanquecino); finalmente, tiene lugar la fase de
8

I.INTRODUCCIN
septacin y de formacin de esporas (revisado en Claessen et al., 2006; Flrdh y
Buttner, 2009). Los procesos de germinacin de Streptomyces han sido muy poco
estudiados.Recientementesehacaracterizadounaprotena(NepA)queformaparte
delascubiertasdelasesporas,ycontribuyeamantenerelestadodedormanciadelas
mismas (de Jong et al., 2009); Noens et al., (2007) han caracterizado SsgA como la
protenaquemarca lossitiosdegerminacin; aunquean faltamuchoporentender
sobrelagerminacindeStreptomyces(Fig.I.3).
Enelcontextodelciclodedesarrollotradicional,lasrutasbiomolecularesque
regulanlasfasesdepreesporulacinenStreptomyces(Fig.I.2)hansidoignoradas.Tal
como se detalla en Objetivos, la caracterizacin de estas rutas biomoleculares
(transicin MIMII, y activacin de la produccin de metabolitos secundarios)
(Fig.I.3),esunodelosobjetivosprincipalesdeestatesisdoctoral.

Fig.I.3. Principales rutas bioqumicas regulando los procesos de diferenciacin de

Streptomyces.
Se muestran las rutas biomoleculares bien caracterizadas y que estn
implicadasenlaformacindecubiertashidrofbicas(bald,sky)yesporulacin(whi

e implicados en septacin). La regulacin de la diferenciacin de las fases pre


esporulantes,diferenciacindeMIaMII(transicinMI/MII),queactivalaproduccinde

metabolitos secundarios en biorreactores industriales, ser uno de los objetivos

principalesdeestatesisdoctoral.

I.INTRODUCCIN
I.3. LA MUERTE CELULAR PROGRAMADA (MCP): UN SUCESO CLAVE PARA LA
DIFERENCIACINYPRODUCCINDEMETABOLITOSSECUNDARIOS.
I.3.1.ELORIGENDELAMUERTECELULARPROGRAMADAENEUCARIOTAS.
Algunosautoreshanconsideradoquelasbacteriasdeciclodevidacomplejoen
general,ylosestreptomicetosenparticular,sonelorigenevolutivodealgunosdelos
dominios proteicos implicados en los procesos de apoptosis o muerte celular
programada(MCP)(KooninyAravind,2002),constituyendoestasbacteriasunmodelo
sencillo en el que estudiar ese importante fenmeno. Las APATPasas (ATPasas
apoptticas)sonreguladoresdelaMCPqueinteraccionanconlascaspasasformando
el apoptosoma (citado en Koonin y Aravind, 2002), y abundan significativamente en
Streptomyces y otras bacterias con ciclos de vida complejos, desde donde podran
haber pasado a los eucariotas superiores (animales, plantas) y tambin a los hongos
(peronoalaslevaduras,dondenoestnpresentes).EnStreptomyces,eldominioAP
ATPasa se encuentra fusionado con el dominio adenilciclasa o con el dominio TIR
(Aravind et al., 1999; Koonin y Aravind, 2002), lo que sugiere la existencia de
interaccionesfuncionalesprotenaprotena,caractersticasdelaapoptosis.Eldominio
TIReslanicamolculaadaptadoradelaMCPencontradaenbacterias,estandomuy
representadaenStreptomyces.Lafuncindeesosdominiosbacterianos"apoptticos"
no se conoce, excepto en el caso de la protena AfsR de S. coelicolor (que contiene
tantoeldominioAPATPasacomoelTIR),yesunreguladorglobaldeladiferenciacin
(Umeyamaetal.,1999),yenelcasodeuna"caspasa"deMyxococcus,relacionadacon
la regulacin del morfgeno que interviene en la esporulacin (Gronewold y Kaiser,
2001). Lo que s es asumible, es que los homlogos bacterianos de las protenas
apoptticasinteraccionanfuncionalmente,ytalveztambinfsicamente,enrutasde
transduccin de seales an no conocidas: se ha sugerido que precisamente en
bacterias como Streptomyces los agregados de dominios "apoptticos" podran ser
anlogos funcionales o incluso predecesores del apoptosoma eucaritico (Koonin y
Aravind,2002).Lasevidenciasanteriores,elhechodequelosdominiosapoptticosno
se encuentren en las archaea pero si en bacterias y la mayor diversidad de estos
dominios bacterianos con respecto a los eucariticos, sugieren su transmisin
horizontal desde bacterias a eucariotas. De hecho, se ha propuesto un origen
polifiltico de los dominios de muerte: desde bacterias de ciclo de vida complejo
10

Eliminado:

I.INTRODUCCIN
(Streptomyces)ydesdeproteobacteriaspromitocondriales.Todosellosformaranla
maquinaria central de la apoptosis eucariota, que evolucionara despus hacia otros
dominios(efectores,CARD,etc.)(KooninyAravind,2002)(Fig.I.4).
A las evidencias comentadas arriba de Streptomyces como predecesor de los
procesosdemuertecelularprogramada,seunenlapresenciadeunelevadonmero
deprotenquinasasdetipoeucariotaquepodranestarrelacionadasconsealizacin
y el desarrollo (Zhang, 1996; Aravind et al., 1999; Petrickova y Petricek, 2003). Al
menos tres de ellas estn asociadas a la membrana: AfsK, que fosforila la protena
reguladora AfsR mencionada antes (Matsumoto et al., 1994); Pkg2, otra
serina/treonina quinasa (Nadvornik et al., 1999), cuya mutacin provoca lisis en
algunos medios (revisado en Bakal y Davies, 2000); y otra serina/treonina quinasa
dependientedeCa2+(ElizarovyDanilenko,2001).
Las caspasas estn implicadas en la regulacin de la apoptosis en animales
(NicholsonyThornberry,1997).Estafamiliadeproteasastieneunplegamientocomn
denominado caspasahemoglobinasa (Eichinger et al., 1999). Una subclase de esta
familia, el grupo paracaspasametacaspasa, est presente en el genoma de
Streptomyces,asociadoconunaprotenquinasa(Aravindetal.,2001)ysehasugerido
quelahipotticaproteasapodrafuncionardentrodecomplejossealizadores(Koonin
y Aravind, 2002). Las metacaspasas podran haber sido adquiridas por los eucariotas
mediante transmisin horizontal de genes (supuestamente por medio del
endosimbiontepromitocondrial),conlaadquisicinsimultneadeotroscomponentes
del sistema sealizador bacteriano ya existente, unido funcionalmente a las
metacaspasas y paracaspasas, como las APATPasas (Aravind et al., 2001). Mediante
este mecanismo tambin se habran adquirido otras protenas como por ejemplo
determinados grupos de ciclofilinas (Manteca et al., 2006c), y otros muchos genes
(Doroghazi y Buckley, 2010). Estos procesos de transferencia horizontal de genes
podran haber tenido un papel decisivo en la evolucin del sistema apopttico
eucariota(Aravindetal.,2001).

11

I.INTRODUCCIN

Fig.I.4.EsquemasimplificadodelorigenyevolucindelaMCPeucariota.(KooninyAravind,
2002).

I.3.2.LAMUERTECELULARPROGRAMAENSTREPTOMYCES
La muerte celular es un suicicio celular activo que sucede en eucariotas y
bacterias en respuesta a situaciones de estrs tanto biolgico como ambiental. La
muerte celular eucariota (apoptosis) es un proceso muy estudiado cuya regulacin
bioqumica se conoce relativamente bien. Sin embargo, rutas biomoleculares que
regulanlaMCPenbacteriasaunsondesconocidas.Miguelezetal.,(1999),yManteca
etal.,(2006b)demostraron,quelosprocesosdemuertequeacompaaneldesarrollo
de Streptomyces presentan las caractersticas de una MCP, en la que se activan
enzimas degradativos involucrados en el desmantelamiento celular (pared celular,
cidosnucleicos,protenas,etc.)(Fig.I.5).

12

I.INTRODUCCIN

Fig.I.5.CaractersticasdelaMCPdeStreptomyces.(a)Imgenesalmicroscopioconfocalde
cultivosteidosconSYTO9IodurodePropidio(clulasmuertasenrojo,vivasenverde),y
almicroscopioelectrnico.(b)Estadodedegradacindeloscidosnucleicos(ADNyARN).
(c)Estadodedegradacindelasprotenas.M,clulasmuertas;V,clulasvivas.(Tomadode
Mantecaetal.,2006yYageetal.,2012,enviado)

NuestrogrupodeinvestigacinharealizadounanlisisprotemicodelaMCP
de Streptomyces mediante geles bidimensionales, demostrando que la MCP se
acompaaba de la aparicin de enzimas implicadas en la degradacin de los
componentes celulares, as como de protenas reguladoras y protenas de estrs
(Manteca et. al., 2006a). Entre estas protenas se encontraban muchas protenas
implicadas en los procesos de estrs oxidativo, lo que sugiere a estos procesos de
estrs como la causa o la consecuencia de la MCP. Entre las protenas reguladoras
encontradas en las clulas que se moran y no en las que permanecan viables se
encontrunaAAAATPasa(SCO1648),cuyoshomlogoeucariotaesunodelosenzimas
que componen el proteosoma; ClpC1 (SCO3373), la subunidad de unin al ATP del
complejoproteolticoClp,queestpresenteenlamayoradelosorganismosvivosy
tieneunpapelenlahomeostasiscelulardurantecondicionesdeestrs;unasintasade
inositol1fosfato (SCO3899) que participa en la formacin de inositol fosfato, una
molculasealizadoraenbacteriasyeucariotas;variasprotenasdeuninalAMPcde
funcin desconocida (SCO2368, SCO4277); y varios reguladores transcripcionales
(SCO5405,SCO1490)(Mantecaetal.,2006a).

13

I.INTRODUCCIN
Enconsecuencia,aunfaltamuchotrabajoparacomprenderendetallelasrutas
biomolecularesqueregulanlaMCPdeStreptomyces,yloqueesmsimportante,su
papel en la biologa de esta bacteria y sus aplicaciones biotecnolgicas. En esta tesis
doctoral,hemosprofundizadoenestosaspectos.

1.4.ORGANIZACINGENMICADELGNEROSTREPTOMYCES
Una de las principales caractersticas del gnero Streptomyces es el elevado
contenidoenguaninasycitosinas(74%G+C)ensugenoma(Woese,1987).Mediante
el anlisis de fragmentos de restriccin, en electroforesis de campo pulsado, de
cromosomasdediferentesespeciesdeStreptomycescomoS.coelicolor(Kieseretal.,
1992),S.ambofaciens(Leblondetal.,1990),S.lividans(Leblondetal.,1993),S.griseus
(Lezhavaetal.,1995)oS.rimosus(Pandzaetal.,1997),sehallegadoademostrarla
linealidaddesugenoma(Linetal.,1993)ascomosutamaoaproximadode8Mb.Se
piensa,quesugrantamaopuedadebersealapresenciadegrannmeroderegiones
no codificantes (Robinson et al., 1981), repeticiones de ADN en tndem (Shrempf,
1985) o duplicacin de genes con la misma funcin aparente (Ohnuki et al., 1985;
Tohyamaetal.,1987).Poseeprotenasunidascovalentementealosextremos5del
cromosoma (Chang y Cohen, 1994). Dichas protenas telomricas (Tpg) actan como
cebadoresparalareplicacindelostelmerosdelcromosoma(BaoyCohen,2001).La
protenaconfuncinhelicasaTap(protenaasociadaaltelmero)tambinintervineen
este proceso (Bao y Cohen, 2004). Por lo general estas protenas telomricas estn
bienconservadasentrelasespeciesdelgneroStreptomyces,conalgunasexcepciones
comoS.griseus(Ohnishietal.,2008).LareplicacindelcromosomadeStreptomyces
tiene lugar bidireccionalmente desde un oriC localizado centralmente en el
cromosoma(Musialowskietal.,1994;Jakimiwiczetal.,1998).ElhechodequeeloriC
se conserve centrado en el cromosoma sugiere una presin selectiva sobre dicho
posicionamiento(Bentleyetal.,2002).Porelcontrario,losextremosdelcromosoma
estn formados por secuencias repetidas e invertidas de entre 20 y 600 Kb
denominadasTIRs(acrnimoinglsderepeticionesinvertidasterminales)yporzonas
de insercin de fagos, plsmidos y elementos transponibles que causan la conocida
inestabilidad gentica del cromosoma de Streptomyces (Volff y Altenbuchner, 1998).
Sepostulaqueestasregionestenganlafuncindeevitarladelecindeotrasregiones
14

I.INTRODUCCIN
delcromosomaqueseanimprescindibles(Redenbachetal.,1996).Enlaactualidadse
encuentransecuenciadosensutotalidadelgenomadeStreptomycescoelicolorA3(2)
(Bentleyetal.,2002),Streptomycesavermitilis(Omuraetal.,2001;Ikedaetal.,2003),
S.scabies(SangerinstituteyLoriaR.),S.griseus(OhnishiYetal.,2008)yS.clavuligerus
(Song et al., 2010), lo que ha aportado un gran avance en el conocimiento de la
organizacin gnica en Streptomyces. La comparacin de los cromosomas de S.
coelicolor, S. avermitilis y S. griseus muestra un ncleo central de 6 Mb muy
conservado en el que residen mayoritariamente genes relacionados con el
metabolismo primario (Ohnishi et al., 2008). El ncleo central se sita ligeramente
hacialaizquierdadelcromosomaporloquedejadosregionesterminalesasimtricas
de1y2Mbaproximadamente.Enestasregiones,denominadasbrazos,seencuentran
mayoritariamente genes no esenciales, incluidos genes y agrupaciones del
metabolismosecundario(Bentleyetal.,2002).
El genoma de la primera cepa secuenciada, considerada cepa tipo
(Streptomycescoelicolor),esuncromosomalinealde8.667.507pbconlapresenciade
7.825 probables genes, dentro de los cuales se incluyen ms de 20 clusters
implicados en la sntesis de metabolitos secundarios. El genoma de Streptomyces
avermitilistambinesuncromosomalineal,enestecasosutamaoesde9.025.608
pbquecodificanalmenos7.574regionesabiertasdelectura,dentrodelascualesse
han identificado 30 clusters relacionados con el metabolismo secundario,
aproximadamente un 6,6% de todo el genoma. La distribucin de los genes en el
genoma no es aleatoria, se ha visto que los genes que resultan esenciales,
housekeeping, (genes implicados en la divisin celular, en la replicacin del ADN,
transcripcin,traduccinybiosntesisdeaminocidos)seencuentranenelcentrodel
cromosoma,mientrasquelosgenescodificantesparafuncionestalescomolasntesis
demetabolitossecundariosseencuentranenlosbrazosdelcromosoma.Dehecho,los
cromosomas de Streptomyces ocasionalmente sufren prdidas espontneas de sus
extremos, tras lo cual son capaces de unirse y formar cromosomas circulares que se
replican como los del resto de las bacterias (Hopwood, 2007). La transmisin
horizontal de ADN en los extremos del cromosoma pudo provocar el incremento del
tamaodelcromosomadeStreptomycesdurantelaevolucinreciente(Bentleyetal.,
2002). Se han detectado una gran cantidad de plsmidos en Streptomyces, entre los
15

I.INTRODUCCIN
queseincluyen:plsmidoslineales,integrativos,grandesplsmidoscircularesdebajo
nmerodecopiasypequeosplsmidoscircularesdealtonmerodecopias(Kieseret
al.,2000).AdemsdiversosfagosytransposonespresentesenStreptomycesseutilizan
en estudios de biologa molecular; destacando el fago C31 y el transposn IS117,
utilizados como vectores integrativos, y los transposones IS493, Tn4556, y Tn5062,
utilizados para procesos de mutagnesis aleatoria (Kieser et al., 2000; Fernndez
MartnezLTetal.,2011).

I.5.CICLODEVIDAENCULTIVOSLQUIDOS(FERMENTACIONES)
La diferenciacin en cultivos lquidos se ha estudiado, en general, mucho
menosqueencultivosdeslidos,debidoprincipalmenteaquelamayoradelascepas
noesporulanenestascondicionesporloqueseasumaquenohabadiferenciacin.
No obstante, la mayora de los procesos industriales de produccin de metabolitos
secundarios se realizan precisamente en estas condiciones. En consecuencia, la
optimizacin de los procesos de fermentacin se ha realizado tradicionalmente de
formaemprica,existiendograndesproblemasenlareproducibilidaddelosmismos.
Hasta ahora, todos los trabajos sobre la diferenciacin de Streptomyces en
cultivos lquidos, y la produccin de antibitico se han centrado en el anlisis de la
morfologa del micelio (Stocks y Thomas, 2001; Denser et al., 2002). As, se han
diferenciadocuatroclasesmorfolgicas:pellets(masascompactasdeunas950m
dedimetro),clumps(masasmenoscompactasdeunas600mdedimetro),hifas
ramificadas, e hifas no ramificadas (Denser et al., 2002). Tambin se ha demostrado
que la formacin de estas estructuras puede ser considerada como la de una
biopelcula(KimyKim2004).Seaceptadeformacasiunnimequelamorfologadel
micelio secorrelaciona conlaproduccinde metabolitossecundarios,peroa suvez,
existe bastante controversia respecto a la relacin causaefecto, de manera que,
algunosautoresafirmanquelaagregacincelularyportantolaformacindepellets
y clumps son fundamentales a la hora de obtener una buena produccin de
metabolitos secundarios; Por ejemplo la retamicina en el caso de S. olindensis
(Hobbset al., 1989; Denser et al., 2004); las nikomicinas en el caso de S. tendae
(VechtLifshitzetal.,1992);antibiticoshbridosenS.lividans(Sarretal.,1997).Por
otro lado, otros autores afirman lo contrario: la formacin de pellets implica una
16

I.INTRODUCCIN
menortasadeproduccindeantibitico;nistatinaenS.noursei(Jonsbuetal.,2002);
produccindeprotenasrecombinantesenS.lividans(Yunetal.,2001);tiolisinaenS.
fradiae (Park et al., 1997); actinorrodina en S. coelicolor A3(2) (Doull y Vining 1989).
Tambinsehadescritoqueenalgunascepasnoexisterelacinentrelamorfologayla
produccindemetabolitossecundarios:produccindevirginiamicinaporS.virginiae;
(Yangetal.,1996.).Portanto,laconclusin,bastantedesalentadora,esquenosehan
encontrado pautas generales para relacionar morfologa y produccin (no son
predeciblesparacadacepautilizada)yquelosfactoresqueinfluyenenlaagregacin
sontantofsicoqumicoscomogenticos(VechtLifshitz,1990).Dichodeotraforma,
lafaltadeunmodelodedesarrollocoherenteenelgneroStreptomyces,haimpedido

Comentario [P1]: Esta ref


estaba mal es del 90 y son tres
autores el primero no es Braun es
este

describir fenotipos claros y fiables a la hora de analizar y optimizar los procesos de


fermentacin.
Existen numerosos grupos de investigacin trabajando en la caracterizacin
gentica de rutas de sntesis de antibiticos y otros metabolitos secundarios por
Streptomyces, o en la obtencin, mediante mutagnesis al azar o dirigida, de cepas
sobreproductoras para la produccin de diferentes metabolitos secundarios; no
obstante,existenmuypocosgruposquetrabajenenlaoptimizacindelosprocesosde
fermentacin desde el punto de vista del ciclo de desarrollo y diferenciacin del
microorganismo. Tal como se detalla en resultados (apartado III.3.I), uno de los
objetivos realizados en esta tesis doctoral fue la descripcin de los procesos de
diferenciacinydesarrollodeStreptomycesenmediolquido,loquenoshapermitido
definir por vez primera la fase del ciclo de desarrollo productora de metabolitos
secundarios(apartadoIII.3.1e)(Mantecaetal.,2008b;Yageetal.,2010).

I.6.LAERAMICA.FUNDAMENTOSDETRANSCRIPTMICAYPROTEMICA.
En la ltima dcada, las metodologas experimentales que se basan en el
anlisis sistemtico y a gran escala de las molculas reguladoras y efectoras de los
procesoscelulares(protenas,genes,metabolitos,etc.)hantomadoespecialrelevancia
debido a su gran utilidad para la ciencia. El sufijo oma tiene un origen latino, que
significaconjuntode,esportantoquelaadicindeestesufijoadiferentesestudios
cubre las nuevas aproximaciones masivas en las que se est enfocando la biologa
recientemente.Todoestetipodeestudioshandecombinarseconexhaustivosanlisis
17

Eliminado:

I.INTRODUCCIN
bioinformticos de los resultados y de tcnicas rpidas y automatizadas de alto
rendimiento (highthroughput techniques) debido al gran volumen de informacin
quesegeneradurantelasinvestigacionesrealizadasagranescala.
El trmino micas hace referencia a las disciplinas como la genmica, la
protemica,latranscriptmica,lametabolmica,etcAestastresltimastambinse
las agrupa bajo la denominacin de genmica funcional, ya que estudian a los
productosdelaexpresindelosgenes.
Latranscriptmicaestudiaycomparatranscriptomas,esdecir,losconjuntosde
ARN mensajeros o transcritos presentes en una clula, tejido u organismo. Los
transcriptomassonmuyvariables,yaquemuestranqugenesseestnexpresandoen
unmomentodado.Latranscriptmicasevaledelabioinformticaylasmicromatrices.
La idea bsica de las micromatrices (o microarrays) es construir, sobre una
membranaolminadevidrio,muestrasquecontienenfragmentosdeADNutilizados
comosondasrepresentativasdelosgenesdeinters.Porotrolado,semarcaelADN
copia (cDNA) de una poblacin celular con fluorescencia o radioactividad, y se usa
estapreparacinparahibridarconelADNdelamicromatriz.Generalmentesehibrida
simultneamentelamismamicromatrizconunamuestradeADNcopiadereferencia,
parafacilitarlacomparacin(FiguraI.6).

I.6.1TRANSCRIPTMICA.
LosmicroarraysomicromatricesdeADNsurgendelanecesidaddeanalizarla
cantidad de informacin procedente de los grandes proyectos de secuenciacin de
genomas.ElprimermicroarrayfueusadoporSchenaetal.,(1995)paracompararla
expresindegenesenclulastumoralesconlaexpresinenclulassanas(FiguraI.6).
Los microarrays permiten la medida simultnea de los niveles de expresin
de miles de genes (sondas) en un solo experimento de hibridacin con una mezcla
compleja de ADN o ARN (dianas). Las Sondas, son secuencias de ADN conocidas
(oligonucletidos o productos de PCR) inmovilizadas ordenadamente sobre una
superficieslida,cadasondadelamicromatrizestdiseadaparaunirseaungende
formaespecficayestdispuestadeformaordenadasobreelmismoylasdianas,son
lamuestraproblemadeADNoARNmarcadacuyaabundanciaserdeterminadapor

18

I.INTRODUCCIN
hibridacin. Un experimento bsico de transcriptmica mediante el empleo de
micromatricesdeDNAconsisteen:
1Diseoyfabricacindelmicroarray.
2Preparacindelamuestraehibridacin.
3Escaneodelmicroarray.
4Anlisisdelaimagen.
5Anlisisestadsticoynormalizacindelosdatos.

Fig.I.6.Representacinsencilladeunexperimentodetranscriptmica.Despusdeaislar
el ARN de cada muestra problema (cancerosa y normal) ste se convierte en cDNA
(RTPCR) a la vez que se marca con distintos fluorforos (rojo y verde). Los cDNA se
hibridanconlamicromatriztraslocualstaseescaneacuantificndoselasintensidades
delosfluorforosenrelacinalamayoromenorexpresindecadagen.

19

I.INTRODUCCIN
Tal como se expone en los resultados (apartados III.I.1 y III.I.2), en esta tesis
doctoralhemosaplicadoestastcnicas detranscriptmicaalestudiodelosprocesos
dediferenciacinencultivosslidos(MIyMII),ascomoalanlisisdelosprocesosde
muertecelularprogramada.

I.6.2PROTEMICA

Tal como se ha comentado arriba, la protemica consiste en el estudio del

proteoma de las clulas. La protemica tradicional se ha desarrollado mediante el


empleodegelesbidimensionalesylaidentificacindelasprotenas(spots)mediante
el patrn de pesos moleculares (huella peptdica) de las mismas obtenido mediante
digestin con una proteasa (generalmente tripsina), y su anlisis mediante
espectrometra de masas (MALDITOF) (Figura I.7). Aunque el uso de geles
bidimensionales es una tcnica muy poderosa para el estudio de los proteomas
celulares, que ha dado y sigue dando excelentes resultados en diversos
microrganismos, incluyendo Streptomyces (Kim et al., 2005, Hesketh et al., 2007,
RodrguezGarcaetal.,2007,),suprincipallimitacineselconsumodetiempo,quees
elevado en experimentos de protemica a gran escala (aquellos que consiguen
identificarcientoseinclusomilesdeprotenas).

Fig.I.7. Esquema ilustrativo del fundamento de la protemica clsica. Las protenas se


separan mediante un gel bidimensional; se digieren con tripsina; se identifican los pesos
molecularesdesuspptidostrpticosmedianteespectrometrademasas(huellapeptdica);
seidentificalaprotenaenbasededatos

20

I.INTRODUCCIN
Durante la ltima dcada, se han producido avances muy significativos en
tcnicas de cromatografa y espectrometra de masas que estn revolucionando el
campodelaprotemica.Todosestosavanceshanllevadoaldesarrollodelasllamadas
tcnicas libres de gel: tcnicas de nanoHPLC combinadas con espectrometra de
masasentndem(LCMS/MS).EstastcnicasseresumenenlafiguraI.8:enestecaso
sedigierecontripsinalamuestraoriginal(formadaportresprotenasenelejemplo);
la mezcla de fragmentos trpticos se separa por un nano HPLC, y cada fraccin
cromatogrficadelnanoHPLCseseparaenelprimerespectrmetrodemasas(MS),se
fragmenta en una celda de colisin, y el anlisis de los pesos moleculares de estos
fragmentos en el segundo espectrmetro de masas permite deducir la secuencia
aminoacdica de esos pptidos, que en ltima instancia permiten identificar las
protenasdepartida(Fig.I.8).

Fig.I.8. Esquema ilustrativo del fundamento de la protemica libre de gel (LCMS/MS). La


mezcla de protenas se digiere con tripsina; los pptidos trpticos se separan mediante nano
HPLC;lasfraccionesdelnanoHPLCseanalizanenunprimerespectrmetrodemasas(MS1);
los pptidos aislados en el MS1 se fragmentan en la celda de colisin; los fragmentos se
analizanenelsegundoespectrmetrodemasas(MS2);losfragmentosdelMS2nospermiten
deducirlasecuenciaaminoacdicaeidentificarlaprotenacomparandoconunabasededatos.

21

I.INTRODUCCIN
Adems,sehandesarrolladotcnicasdemarcajedelasmuestrasquepermiten
hacer cuantitativa la tcnica del LCMS/MS. Uno de los marcajes ms extendidos en
protemicacuantitativaeselmarcajeisobrico:Isobarictagsforrelativeandabsolute
quantitation(iTRAQ),quehasidooptimizadopornuestrogrupodeinvestigacinpara
elestudiodeStreptomyces(Mantecaetal.,2010a,b),yquetambinhemosaplicado
enestatesisdoctoral(apartadoIII.1.2).ElfundamentodeliTRAQsemuestradeforma
resumidaenlafiguraI.9:trasladigestincontripsina,cadaunadelasmuestras(hasta
8) se marcan con uno de los 8 reactivos iTRAQ; se mezclan; se separan en el primer
espectrmetro de masas; se fragmentan en la celda de colisin, y en esta
fragmentacinserompeelenlaceentreelreactivoiTRAQyelpptidodandolugara
los llamados iones reporter; se identifican las protenas por su secuencia de
aminocidos, y se identifican y cuantifican las cantidades de los pptidos en las
muestras originales mediante los pesos moleculares e intensidades de los iones
reporterqueseusaronenelmarcajeoriginal(Fig.I.9).

Fig.I.9. Esquema de la tcnica de marcaje isobrico (iTRAQ). Hay 8 reactivos iTRAQ


formados por 8 iones reporter unidos a un grupo de balanceo (la suma de la masa del
ion reporter ms el grupo de balanceo es 305 Da). Cada muestra se marca con un
reactivoiTRAQ,incrementandosupesomolecularen305Da(isobrico;pesomolecularde
todas las protenas se incrementan en 305 Da). MS1separacin pptidos trpticos; en la
celda de colisin se fragmentan los pptidos, y tambin se fragmenta el reactivo iTRAQ
liberando el ion reporter. MS2identificacin y cuantificacin; la proporcin entre las
reasdelosionesreporternosdalaconcentracindelaprotenaenlamuestraoriginal.

22

I.INTRODUCCIN
Mediante elempleodeestastcnicasde protemicacuantitativa (LCMS/MS,

Eliminado:

iTRAQ), nuestro grupo de investigacin ha realizado un estudio de las variaciones en


los proteomas del MI vegetativo, y del MII reproductivo durante el desarrollo de
Streptomyces en cultivos slidos (Manteca et al., 2010a). Los resultados, que se
resumen en la figura I.10, demostraron que la diferenciacin morfolgica (formacin
del MI y MII) se correlaciona con un cambio fisiolgico: el cambio del metabolismo
primario(MI)alsecundario(MII):lasinmensamayoradelasprotenasimplicadasen
el metabolismo primario estn reguladas al alza en el MI, mientras que aquellas
implicadas en metabolismo secundario, protenas transportadoras, protenas
relacionadas con el estrs, y protenas reguladoras estn reguladas al alza en el MII
(Fig.I.10). Adems, se identificaron muchas protenas reguladoras (reguladores
transcripcionales, quinasas, etc.) que se expresan diferencialmente en los MI y MII.
Estas protenas posiblemente estn regulando las fases preesporulantes de
Streptomyces, y su caracterizacin contribuir a discernir las rutas biomoleculares
regulando esta diferenciacin, que en ltima instancia permitirn un mejor
entendimientodelasfermentacionesindustrialesqueutilizanStreptomyces.
Enestatesisdoctoral,hemosempleadolamismaaproximacinexperimental
(iTRAQ LCMS/MS) al estudio de los procesos de muerte celular programada, en
combinacin con las tcnicas de transcriptmica descritas arriba (apartado II.1.2;
Yageetal.,2012enviado).

Eliminado:

Fig.I.10.Valoresdeabundanciarelativa(logiTRAQMII/MI)delosprincipalesgrupos
funcionalesdeprotenasidentificadosduranteeldesarrollodeStreptomycesenmediosido
(Mantecaetal.,2010).

23

I.INTRODUCCIN

I.7.OBJETIVOS
Tal como se ha comentado a lo largo de la introduccin el grupo de
investigacin en el que he realizado mi tesis doctoral ha estado trabajando en el
estudio de los procesos de desarrollo y diferenciacin de Streptomyces en cultivos
slidosesporulantes,ampliandosignificativamenteelciclodedesarrollotradicionalde
esta bacteria (apartado I.2.2). Por esta razn, el objetivo principal de esta tesis
doctoralfueahondarenelconocimientodelasfasesclaveenelciclodedesarrolloen
medioslidomediantebiologadesistemasydefinirelcicloenmediolquido,parasus
aplicacionesindustriales.
Msconcretamentelosobjetivosson:

1. Caracterizacin de los genes (transcriptmica) y las protenas (protemica)


regulando los procesos de diferenciacin (MI y MII; MCP) (Biologa de
sistemas).

2. Bsquedadelasrutasbiomolecularesquecontrolanlasfasespreesporulantes
de diferenciacin (formacin de MIMII; MCP) mediante experimentos de
mutagnesis y estudios fenotpicos de los genes identificados. en el contexto
delobjetivo1.

3. Estudio morfolgico y funcional de los procesos de diferenciacin en cultivos


lquidos de Streptomyces: formacin de MI compartimentalizado MII
multinucleado; medida del crecimiento y produccin de metabolitos
secundarios;anlisisdelosprocesosdemuertecelularprogramada.

4. Aplicaciones del conocimiento generado en el objetivo anterior a las


fermentacionesindustrialesdeStreptomycesyalosprocesosdebsquedade
nuevosmetabolitossecundariosapartirdecepasdeStreptomyces.

24

Anton van Leeuwenhoek

Robert Koch

II. MATERIAL Y MTODOS

II.MATERIALYMTODOS

II.MATERIALYMTODOS
II.1.ANLISISTRANSCRIPTMICODELCICLODEVIDA
II.1.1.DISEODELEXPERIMENTO
Para el anlisis de los genes expresados al alza en los procesos de muerte
celularprogramadaseutilizaron4rplicasbiolgicasdecadacondicin(protoplastos
vivos 16 h y protoplastos comenzando a morir 12 h, vanse detalles en el prrafo
siguiente) hibridadas entre s alternando los fluorforos (CY3, CY5) de la siguiente
maneraenunamicromatrizdeAgilentTechnologies:

ARNVIVOS1CY3+ARNMUERTO1CY5

ARNVIVOS2CY5+ARNMUERTOS2CY3

ARNMUERTOS3CY3+ARNVIVO3CY5

ARNMUERTOS4CY5+ARNVIVO4CY3

ParaelanlisisdelosgenesexpresadosdiferencialmenteenelMIyenelMIIse
hibridARNdelasmuestrasmarcadoconCy3(3rplicasbiolgicasdecadatiempo,R)
conADNgenmicodereferenciadeStreptomycescoelicolormarcadoconCy5(Gadgil
etal.,2005)entresmicromatricesdeAgilentTechnologies:

ARN16R1Cy3+ADNgCy5

ARN48R1Cy3+ADNgCy5

ARN24R1Cy3+ADNgCy5

ARN72R1Cy3+ADNgCy5

ARN16R2Cy3+ADNgCy5

ARN48h2Cy3+ADNgCy5

ARN24R2Cy3+ADNgCy5

ARN72h2Cy3+ADNgCy5

ARN16R3Cy3+ADNgCy5

ARN48R3Cy3+ADNgCy5

ARN24R3Cy3+ADNgCy5

ARN72R3Cy3+ADNgCy5

27

II.MATERIALYMTODOS
II.1.2.PREPARACINDELAMUESTRASDESTREPTOMYCES
A) MUERTE CELULAR PROGRAMADA: SEPARACIN DE CLULAS VIVAS Y
MUERTAS.
Tal como se comenta en resultados (apartado III.1.2a), uno de los retos a la
horadeestudiarlaMCPenunabacteriafilamentosacomoesStreptomyces,eselde
separar las clulas vivas de las que estn comenzando a morir. Para ello, hemos
utilizado la metodologa creada previamente en nuestro grupo de investigacin que
consisteenlaobtencindeprotoplastoscelulares(Mantecaetal.,2006b)tras1216
horasdecultivo,segnestemosbuscandounamuestraenriquecidaenclulasmuertas
o vivas, se extrajo el micelio fresco del celofn utilizando una esptula roma y se
deposit en un tubo falcon para pesarlo. Se aade tampn P (Kieser et al., 2000) de
forma que quede denso pero hidratado para que se agite bien y est accesible a la
lisozima(4mldetampnPporcada2gdemicelio).Seaadelalisozima(15mg/ml),y
seagitaconlamanomediantegolpessecos.Seincubaa37Cdurante510minutos.
Semezclaconlapipetade5mlysevuelveaincubardurante5minutos.Seaaden5
mlmsdetampnPysemezcladenuevoconlapuntade5ml.Sedejaincubando34
minutos ms y se mira la muestra en el microscopio de contraste de fases para
comprobarquesehanformadolosprotoplastos.
A continuacin se filtra la muestra con una jeringa de 20 ml y algodn graso
(algodnhastaunos2mldelamedidadelajeringa)ysecentrifuga10mina1000gs.
Sedecantaelsobrenadante,seresuspendeelsedimentocon10mldetampnP,yse
repiteelprocesotresveces,traseltercerlavadoseanalizaunapequeaalcuotadela
muestra en el microscopio confocal (colorantes vitales disueltos en tampn P) para
observarelestadodeviabilidaddelosprotoplastos(verdes=vivos,rojos=comenzando
a morir). El resto de protoplastos se reparte en alcuotas de 200 l y se guarda
congeladoa80Chastasuutilizacin(Mantecaetal.,2006b).

B) DESARROLLO EN CULTIVOS SLIDOS: SEPARACIN DEL MICELIO I Y EL


MICELIOII
SerecogielmiceliodeplacasdeGLMconcelofnadistintostiempos.ElMIse
recogialas12horas,yelMIIalas24,48y72horas.Lacantidaddemuestrarecogida

28

Eliminado:

II.MATERIALYMTODOS
selimita0,1genpesofrescopormuestrayrplicaconelobjetodenosaturarlas
columnasdeextraccindeARN.
Seguimos el protocolo publicado por Manteca et al., (2010), en el que se
describelaobtencindelasmuestrasdemicelioIyIIparaunanlisisprotemico,con
lasmodificacionesnecesariasparalaobtencindeARN:llenarelfondocnicodeun
tubofalconde50mlconbolasdevidriode5mmdedimetro(SigmaAldrich);aadir
5mldeRNAProtect(Quiagen)yagitarenvortexdurante1minuto;dejarreposar
durante5minutos;recogerlamuestraconunapuntadepipetade1ml(cortndolasi
fuera necesario); lavar las bolas de vidrio con 1 ml adicional de RNA Protect para
recuperarelmiceliorestante;centrifugar10minutosamximavelocidadydescartar
elsobrenadante.Lasmuestrasseguardaroncongeladasa80C.

II.1.3.LISISYHOMOGENEIZACINDELMICELIO
Lasmuestrassedescongelanyselesaaden170ldelisozima(15mg/ml)en
TE (1mM EDTA, 10 mM Tris pH 8), se pasan a un tubo de 2 ml. Posteriormente se
incuban atemperaturaambientedurante10 minutos(enelcaso delosprotoplastos
este paso no hace falta). Se aaden 600 l de RLTME a cada tubo. (RLT: RNeasy
ProtectMinikitdeQiagen).Seagitaenvortexenrgicamenteysepreempaquetaen
Tubos Phase Lock Gel (PLG) Heavy (5PRIME) 2030 s al mximo de rpm; se
transfirieren 750 l del homogeneizado a un nuevo tubo PLG; se aaden 750 l de
AquafenolCIA;seagitavigorosamentehastaformarunasuspensin(1minaprox.;no
usarvortex);secentrifugadurante5mina13000g;lafasesuperioracuosasepasaa
otrotubo PLGpordecantacin;se repite laextraccincon AquafenolCIA; sepasa la
fase acuosa a microtubos de 2 ml por decantacin; se aaden 395 l de etanol
absolutoysemezclaporinversin.

II.1.4.EXTRACCINCUANTIFICACINYANLISISDELAPUREZADELARN
Terminadalafasedeprepurificacinylisadoporfenolizacinlasmuestrasde
micelioelARNsepurificamediantecolumnas(RNeasyProtectMinikitdeQiagenRef.
74524),siguiendolasindicacionesdelfabricante.
Tras la extraccin del ARN el siguiente paso es su cuantificacin mediante el
nanodrop(AgilentTechnologies)(2ldemuestra).ParaelcontroldecalidaddelARN
29

Eliminado:

II.MATERIALYMTODOS
(estado de degradacin y pureza) se utiliz un gel en chip para el bioanalizador de
AgilentTechnologies(5ldemuestra).

II.1.5.MARCAJEDELARNYELADNCROMOSMICOCONCY3YCY5.
La primera consideracin a tener en cuenta en el marcaje es trabajar con la
menor luz posible y manteniendo los reactivos en oscuridad (posteriormente las
mezclas),siendoelCy5especialmentesensiblealozonoylahumedad.
Se mezcla la cantidad de ARN necesaria en cada caso con los cebadores y se
somete la mezcla a 70C durante 10 minutos favoreciendo la desnaturalizacin del
ARN y la unin de los cebadores. Posteriormente se pasa a hielo. Se prepara la
premezclaconelenzimatranscriptasareversa(enzimaquesintetizaADNcapartirde
ARN)yCy5dCTPs/Cy3dCTPs(nucletidostrifosfatomarcadosconCy5Cy3utilizados
para la sntesis de ANDc a partir de ARN). Se aade la premezcla a la mezcla ARN
cebadoresyseincubaeneltermociclador10minutosa25Cy5horasa46C.Unavez
terminada la reaccin, se eliminan los restos de ARN que puedan quedar presentes
medianteunalisisconNaOH1N,aadiendo1/3delvolumendelamezclaeincubando
enoscuridad10minutosa70C.Finalmenteseaade1/3delvolumendereaccinde
HCl1NparaneutralizarlasosayseguardaelADNcCy5/ADNcCy3enoscuridada
20C.
Enelcasodelasmuestrasdeprotoplastosvivosymuertoselmarcajesehizo
conCy3yCy5paraambosARN,alternandoeltipodemarcajeenlasrplicas.
EnelcasodelasmuestrasdemicelioIymicelioIIlosARNsemarcanconCy3y
se enfrentan a ADN genmico de referencia que marcamos con Cy5. (apartado II.1.1
diseodelexperimento).
Las muestras marcadas se purifican mediante minicolumnas de purificacin
PCR MinElute (Qiagen, ref. 28004), y se cuantifican mediante el equipo nanodrop
(AgilentTechnologies).

II.1.6.HIBRIDACINDEMICROMATRICES
Las micromatrices utilizadas fueron adquiridas en Oxford Gene Technology.
Contienen 1417 sondas control y 43798 sondas sintetizadas in situ por medio de la
tecnologaAgilentconcidosnucleicosprocedentesdeS.coelicolor.
30

II.MATERIALYMTODOS
Semezclanlosmarcajesporparejasdehibridacinysedesnaturalizana94C
durante3minutos.Acontinuacinloscidosnucleicosmarcadosydesnaturalizadosse
mezclaninmediatamenteconlasolucindehibridacin(NaCl5M,formamida100%,
EDTA0,5M,Tritn10%).
Se prepara la cmara de hibridacin (Agilent Technologies) con el soporte a
usar; se ponen 100 l de la mezcla anterior evitando la formacin de burbujas y se
cierralacmaradehibridacin.Enorientacinverticalserotaelconjunto23vecesen
sentido horario para humedecer las superficies eliminando las posibles burbujas
mediantegolpesenverticalsobreunasuperficiefirme.
La cmara se incuba a 55C durante 60 horas en un horno de hibridacin
colocando la micromatriz en el rotor verticalmente respecto al eje de giro a una
velocidadde4rpm(convienerevisarcada12hlaposibleformacindeburbujas).

II.1.7.LAVADODELASMATRICES,ESCANEADOYLECTURADEDATOS.
Traslas60hlamicromatrizsesacadelacmarayselavaabundantementecon
dossolucionesde lavadocomerciales (Agilent Technologies)yfinalmenteseseca al
aire.Enestemomentolamatrizyaestlistayseprocedeasuescaneadoutilizandoel
escner Agilent G2565BA. La cuantificacin de las intensidades de fluorescencia
correspondientes a cada sonda se realiz con el programa FeatureExtraction v9.5.1
(Agilent).SeobtienenmilesdedatosbrutosdeintensidadesdeCy3,Cy5ymezclade
ambos(genesqueseexpresanenambasfases).ElgenomadeStreptomycescoelicolor
tiene 7.825 genes (dentro de cada micromatriz existen repeticiones como controles
internos),portodoestoesmuyimportantelabioinformticacomoherramientapara
filtrar los datos utilizando los estadsticamente fiables para sacar conclusiones
acertadas.

II.1.8.ANLISISESTADSTICODELOSDATOS.
LosdatosdecuantificacinseprocesaronporelDr.AntonioRodrguezGarca
delInstitutodebiotecnologadeLen,utilizandolospaquetesdeanlisisdelproyecto
Bioconductor en el entorno R (R DevelopmentCore Team,2011; versin 2.12.2). Por
mediodelasfuncionesincluidasenelpaquetelimma(Bioconductor2.7,limma3.6.9;
Smyth,2004)serealizaronlanormalizacinyelanlisisestadstico.
31

II.MATERIALYMTODOS
La normalizacin utilizada fue Scale (en el caso de la transcriptmica vivo
muerto)yclm(enelcasodelatranscriptmicaMIMII).Log(M/V)=datosnegativos
alalzaenlovivo,ypositivosalalzaenlomuerto.Log(MII/MI)=datosnegativosalalza
en el MI y positivos en el MII. Considerando solamente los datos estadsticamente
significativos, es decir, con un p valor menor de 0,05 y en los que los datos de
intensidaddetodaslassondasparaunmismogensonreproducibles.

II.2. ANLISIS PROTEMICO DE LOS PROCESOS DE MUERTE CELULAR


PROGRAMADA.
II.2.1.RECOGIDADEMUESTRAYFRACCIONAMIENTO
El micelio se recogi y proces para el fraccionamiento de clulas vivas y
muertasdelmismomodoquesedescribienelapartadoII.1.2aparalosexperimentos
detranscriptmica.Sehicieronduplicados(rplicasbiolgicas),ylosextractoslibresde
clulasseprepararonmedianteunchoqueosmticodelosprotoplastosentampnA
(50 mM Tris HCl pH 7, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM EDTA, 7 mM beta
mercaptoetanol, protease inhibitor cocktail tablets de Roche), y sonicacin en
hielo. Las fracciones de citosol y membrana se obtuvieron mediante el mtodo
descrito por Quirs et al., (1986), mediante ultracentrifugacin a 100000 g en la
ultracentrfuga Beckman LB70 M. El sobrenadante constituye la fraccin citoslica
mientrasqueelsedimentorepresentalafraccindemembrana.Ambasfraccionesse
dializaronfrenteaaguadestiladaa4C(duranteunahoraconcuatrocambiosdeagua,
y usando tubos de dilisis benzoilados (D7884 Sigma). La cantidad de protena se
cuantificmedianteelmtodoBradford(Bradford1976),seliofilizyseconserva
80C.

II.2.2. SEPARACIN DE PROTENAS, DIGESTIN Y MARCAJE ISOBRICO


(iTRAQ)
Las protenas (50 g /pocillo), se separaron mediante geles de protenas SDS
PAGE usando geles prefabricados PAGEr en gradiente 420 % Trisglicina (Lonza) y
teidos con azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G250). Para las protenas
intrnsecas de membrana,extractosde50gdeprotenasehirvieron entampnde
32

II.MATERIALYMTODOS
carga con SDS durante 5 minutos y se corrieron directamente en el gel. Las dos
muestras (clulas vivas y muertas) de cada fraccin subcelular y las dos rplicas
biolgicassecargaron2veces(rplicasmetodolgicas)en2gelesindependientes,uno
paralasprotenascitoslicasyotroparalasprotenasdemembrana.Cadacalledelgel
secortposteriormenteconunbisturen6fracciones.Lasporcionesdelgelselavaron
con agua destilada y se deshidrataron con acetonitrilo. Los residuos de cistena se
redujeronconDTT,sealquilaronconiodoacetamida,serehidrataronconunasolucin
de10ng/ldetripsina(Promega)enuntampndedigestin(50mMbicarbonatode
trietilamonio) y se incub toda la noche a 37C. Despus de la digestin, los
sobrenadantes se recuperaron y los pptidos del resto de los fragmentos del gel se
extrajeron con cido frmico al 5 % durante 30 minutos, despus de los cuales se
aadielmismovolumendeacetonitrilopuroylasmuestrasseincubarondurante30
minutosmsatemperaturaambiente.Losextractossesecaronenvaco.Lospptidos
semarcaronmediantemarcajeisobrico(iTRAQ,AppliedBiosystems)deacuerdoal
protocolopublicadopreviamente(Mantecaetal.,2010).Seusaronlosreactivos113,
114,115y116parallevaracabodosexperimentosiTRAQporseparado:unoparalas
protenascitoslicasyotroparalasdemembrana.Despusdelmarcaje(durantedos
horas a temperatura ambiente) las muestras se combinaron (6 muestras que se
corresponden con los trozosoriginales del gel). El solvente orgnico se concentr en
un Speedvac y la purificacin de los pptidos se realiz manualmente mediante
cromatografa hidrofbica en puntas de micropipeta GELoader (Eppendorf)
preparadasconC18(discosdeextraccin3MEmpore)yR3(POROS).

II.2.3.ANLISISDEPPTIDOSMARCADOSPORiTRAQMEDIANTENANOHPLC
YESPECTOMETRADEMASASENTANDEM.
Los pptidos trpticos se separaron usando un sistema de nano HPLC
ULTIMATE3000LCsystem(Dionex,Idstein,Alemania).LafasemvilAfue0,1%de
cidofrmicoenaguadestiladaylafasemvilBfue0,1%decidofrmicoen90%de
acetonitrilo(FisherScientific).Seutilizarondoscolumnasconunaprecolumnade1
cm(100mdimetrointerior,350mdimetroexterior)yunacolumnaanalticade
15cm(75mdimetrointerior,350mdimetroexterior)empacadaconresinaC18
(ReproSil,PurC18AQ3m,Dr.Maisch,Alemania).Enlaprecolumnasecargaron5l
33

II.MATERIALYMTODOS
demuestraencidotrifluoroacticoal1%.Elgradientedeelucinfuede27%Ben4
min,730%Ben60min,3060%Ben15min,y6090%Ben5minconunflujode300
l/min.Lacolumnaselavcon90%Bdurante2minseguidodelequilibradodurante
22min aunflujo de300l/min.Lasolucindebloqueo demasapara MS y MS/MS
estaba compuesta por 500 mol/l de [Glu1]Fibrinopeptide B (Sigma). El sistema
Ultimate 3000 fue la interfaz de un espectmetro de masas en tndem QTOF
(Synapt,WatersCorporation).ElanalizadorTOF(vmode)delespectmetrodemasas
se calibr externamente con fragmetos inicos de [Glu1]Fibrinopeptide B desde m/z
50a1500.LosdatosLCMS/MSseobtuvieronusandoelmtododatodependiente.El
voltajecapilarfue4.5kVLaenergadecolisinseintensificde20a45eV.Elestudio
MSserealizdurante0,48sconunretrasode0,02s.ElrangodeescaneadoMSfue
3501500 m/z y el rango de escaneado del MS/MS fue 501500 m/z. Los fragmentos
inicosdelosdosprecursoresinicosmsabundantessedetectaronconunatasade
integracin de 0,48 s con 0,02 s de retraso. Cada muestra se analiz dos veces; los
precursores inicos seleccionados durante el primer anlisis LCMS/MS fueron
excluidosenelsegundo.

II.2.4.ANLISISBIOINFORMTICODELOSDATOS
ElprogramautilizadoparaconvertirlosdatosbrutosdelanlisisLCMS/MSen
archivos pkl fue Data Analysis ProteinLynx Global server (PLGS) versin 2.3. Los
archivospklfueronutilizadosparalasbsquedaenMASCOTsearchengine(version
2.2) utilizando la base de datos NCBInr con la taxonoma limitada a Streptomyces
coelicolor(2diciembre,2009,8573entradas).Losparmetrosdebsquedautilizados
fueron: tolerancia de la masa del pptido (MS) 10 ppm; fragmento tolerancia masa
MS/MS, 0,1 Da; iTRAQ, cistenas carbidometiladas, y metioninas oxidadas como
modificaciones.Lastasasdedeidentificacindefalsospositivosparalospptidosse
calcularonusandolaopcindecoydelMASCOTresultandoen1,2%defalsospositivos
paralasmuestrasdecitosoly1,1%paralasprotenasdemembrana.
La cuantificacin relativa se realiz usando el programa PLGS (waters) con
normalizacin automtica. El algoritmo de cuantificacin PLGS utiliza mtodos
Bayesianosmuypotentesalahoraderealizarunacuantificacinfiable.Losresultados
obtenidos por PLGS se exportaron en Microsoft Excel para continuar con su
34

II.MATERIALYMTODOS
procesamiento. Las protenas que no estaban representadas por ningn pptido por
encimadelumbraldelahomologadelMASCOTsedescartaron.Cuandounaprotena
sedetectenmsdeunadelasseisfraccionesdegelprocesadas,laprotenaconla
puntuacin MASCOT ms alta fue la que se us. Las abundancias relativas se
consideraron significativas si el promedio desus ratios iTRAQ era consistente en las
dos rplicas biolgicas analizadas (CV< 0,25), y si su ratio iTRAQ entre rplicas
metodolgicas (vivo/vivo, y muerto/muerto) est incluido en el intervalo 0,811,23
(Log2ratioiTRAQde0,3;sinvariacin).

II.3.OBTENCINDEMUTANTESMEDIANTELACOLECCINDECSMIDOS
CONINSERCIONESDELTRASPOSNTN5062.
Mediante un sistema de mutagnesis de alto rendimiento mediada por el
trasposn Tn5062, se ha realizado mutagnesis sistemtica del 83 % del genoma de
Streptomycescoelicolor(FernndezMartnezetal.,2011).Labasededatosdetodas
lasinsercionesseencuentraenhttp://strepdb.streptomyces.org.uk/.
En esta tesis doctoral, se ha utilizado esta coleccin de csmidos para los
experimentos de mutagnesis. Para ello utilizamos los csmidos con las inserciones
interrumpiendocadagendeinters.LasinsercionesseenviarondesdelaUniversidad
deSwansieenE.coliJM109.Lascepassecrecieronduranteunanocheenagitacina
37CenmedioLBconapramicina(resistenciaquellevanloscsmidos).Aestasclulas
selesextrajoelcsmidomedianteelkitGenEluteHPPlasmidMiniprep(sigma).Con
esteADNsetransformaronclulaselectrocompetentesE.coliET12567damquellevan
elplsmidoconjugativopUZ8002(Pagetetal.,1999).SeutilizelprogramaECI(1,8v)
del electroporador Micropulser (Biorad). Con un tiempo de recuperacin ptimo de
entre3,80y5,40ms.
Lasclulassedejaronen1mldeLBa37Cdurante1h1,30hyposteriormente
sesembraronenplacasdemedio2xTYquellevancloranfenicol(resistenciapropiade
las E. coli ET12567 dam) kanamicina (resistencia del plsmido conjugativo) y
apramicina (resistencia del trasposn Tn5062). Tras 2 das de incubacin a 37C, una
delascoloniastransformantesseponeacrecerunanocheen5mldeLB+1%glucosa
conlostresantibiticosderesistencia(Clo,Km,Amp).Los5mlseconcentranen0,5
35

II.MATERIALYMTODOS
mlysehacen3lavadosconLBparaeliminarelantibitico.Paralelamenteseextraen
esporasfrescasdeunaplacadeS.coelicoloryseresuspendenen0,5mldeR5.Estas
esporas se incuban 10 minutos a 50C, transcurrido este tiempo se mezclan las
esporas y las clulas ET12567 dam (transformadas con el csmido que lleva la
insercinenelgendeinters),ysesiembranenplacasdeSFMenriquecidocon10mM
de MgCl2. Al da siguiente se cubren las placas con cido nalidxico (para impedir el
crecimientodelasclulasdeE.coli)yapramicina(paraseleccionarlostransformantes
de S. coelicolor), las placas se dejan incubando a 30C durante 4872 horas tras las
cualessecomienzalasiembrade lascolonias aisladasde Streptomyces,en formade
pequeos parches, en placas de kanamicina y apramicina de forma paralela. Las
coloniasresultantesdeunadoblerecombinacincrecernenlasplacasdeapramicina
(resistenciadeltransposnTn5062)peronoenplacasconkanamicina.Trasresembrar
entre 200600 colonias y dejar incubar las placas 34 das se obtienen entre 14
colonias de S. coelicolor doblerecombinantes (crecen en am y no en km). A estas
coloniasselesdanvariospasesdesiembraenplacasdeGLMconamyparalelamente
enplacasconkm(paraconfirmarladoblerecombinacin)yfinalmentesesiembranen
placasdeSFMconapramicinaparaguardarlasesporasapartirdeunacoloniaaislada.
LosmutantessoncomprobadosporPCRconlosoligonucleotidos:
ApraF:5'ATTTTAATGCGGATGTTGCG3'
ApraR:5CTCACGGTAACTGATGCC3
KanaR:5'TCGGTCATTTCGAACCCC3'
KanaF:5'GATGGCTTTCTTGCCGCC3'
Dndose por buenos aquellos en los que amplifica la banda del gen de la
apramicina(1300pb)ynodelgendelakanamicina(794pb).
Posteriormente y para una comprobacin completamente fiable se realizan
hibridacionestipoSouthernBlotenlasqueseutilizacomosondaelfragmentode3442
pbresultantedeladigestinPvuIIdelvectorpQM5062(5795pb),quesecorresponde
coneltrasposnTn5062marcndolocondigoxigenina.ParalarealizacindelSouthern
se extrae ADN cromosmico de los mutantes y se digiere con SalI (se digiere como
controltambinelADNdeloscsmidoscorrespondientes),quecortaeneltrasposn
dejandounfragmentode835pb(unidoalrestodelcsmidohastaelsiguientecorte
de SalI) y otro fragmento de 2600 pb (unido al resto del csmido hasta el siguiente
36

II.MATERIALYMTODOS
corte de SalI). Para el clculo del tamao de las bandas que han de salir en cada
Southernsebuscalasecuenciadelcsmidocorrespondienteylaposicinyorientacin
delainsercin,(basededatosdehttp://www.strepdb.com)sedigierevirtualmentela
secuenciadelcsmidoconSalI(NEBcutterV2.0),ydeestaformapodemoscalcularlos
primeroscortesSalIaguasarribayaguasabajoenrelacinalaposicindeltrasposn
ysumndoles835o3600pbsegnlaorientacindelmismotenemoslostamaosde
lasbandas.

Fig.II.1.EsquemadeltrasposnTn5062tomadodeFernndezMartnezetal.,2011.Laflecha
rosaindicaelcorteSalIdentrodelainsercin.

II.4.

ANLISIS

MORFOLGICO

DE

CULTIVOS

LQUIDOS

DE

STREPTOMYCES:FERMENTACIONES.
II.4.1.MICROORGANISMOSUTILIZADOS.
En la siguiente tabla se muestran los microorganismos empleados en este
trabajo:
Organismo

Cepa

Streptomycescoelicolor

M145

Streptomycescoelicolor

M600

Streptomycescattleya

NRRL8057

Staphylococcusaureus

ATCC6538P

Streptomycestsukubaensis

NRRL18488

Saccharomycescerevisiae

TB23

Escherichiacolidamdcm

ET12567

37

II.MATERIALYMTODOS
Las cepas de Streptomyces se conservaron en forma de esporas en glicerol al
20% a 80C (Kieser et al., 2000). El resto de microorganismos se conservaron en
formadeclulasvegetativastambinenglicerolal20%ya80C.

II.4.2.MEDIOSDECULTIVO.

a)MediosparaStreptomycescoelicoloryStreptomycescattleya.
MedioGLM:(paraelseguimientodelciclodevidaenmedioslido)

5g/ldeglucosa.

4g/ldelevadura.

5g/lextractodemalta.

0,5g/lMgSO4.7H2O.

20g/ldeagar.

Despus de esterilizar y antes de repartir en placas se suplementa con una


concentracinfinalde0,5g/lK2HPO4tambinestril.

MedioR5A:(paraelseguimientodelciclodevidaenmediolquido)

0,25g/lK2SO4

10,12g/lMgCl2.6H2O

10g/lglucosa.

0,1g/lcasaminocidosDifco.

200l(10x)oligoelementos(Kieseretal.,2000)

5g/lExtractodelevadura.

21g/lMOPS.

AjustarelpHa6,8conKOHdeunasolucinconcentrada.

20g/lAgar.

MedioSFM(paralaesporulacin)

20g/lHarinadeSoja.

20g/lManitol.

20g/lAgar.
38

II.MATERIALYMTODOS

b)MediosparaStreptomycestsukubaensis

MedioISP4deDifco(paralaesporulacin)

MedioMG(definidoparaelcrecimientoyproduccinenmediolquido)

50g/ldeAlmidn(Difco)

8,83g/lcidoglutmico

21g/lMOPS

0,2g/lMgSO47H2O

1ml/lCaCl29mM

1ml/lNaCl17mM

166,6mlKH2PO4+K2HPO415mM(2,5mMfinal)

0,450ml/loligoelementos10x

AjustaraPH6,5conNaOH
OligoelementosMGpara100mldeunasolucin100x;

0,39gCuSO45H2O

0,057gH3BO3

0,037g(NH4)6Mo7O244H2O

0,061gMnSO4H2O

8,8gZnSO47H2O

c)MediosparaStaphylococcus

MedioTSB:

15g/lTSBMerk.

10g/lagar.

MedioLB:Sambrooketal.,(2001).

d)MediosparaSaccharomycescerevisiae

39

II.MATERIALYMTODOS
MedioYEDPA:

20g/lBactopeptona

10g/lExtractodelevadura

20g/lGlucosa

20g/lAgar

e)MediosdecultivoparaE.coli

Medio2XTY:

5gNaCl.

15gTriptona.

10gExtractodelevadura.

Se reparte en botellas de 100 ml. En caso deque se quiera slido se aade 1,5 g de
agarporbotella.

MedioLBenriquecidoconglucosa:

5gNaCl.

5gdeextractodelevadura.

10gdetriptona.

Aadir1%deglucosaalamezcla.Sereparteenbotellasde100ml.Encasodequese
quieraslidoseaade1,5gdeagarporbotella.

II.4.3.CONDICIONESDECULTIVO.
Loscultivosenmedioslidoparaelseguimientodelciclodevidasehicieronen
placasPetride8,5cmdedimetrocon25mldemedioGLM(Novellaetal.,1992)por
placa. El medio de cultivo se cubri con discos estriles de celofn antes de la
incubacin (Mndez et al., 1985). Las placas fueron inoculadas con 100 l de una
suspensin de esporas frescas previamente obtenidas en medio de cultivo SFM/ISP4
(dependiendodelacepa)ycuantificadas(108esporas/ml).Laincubacinserealiza
Eliminado:

30C(28CparaS.cattleya).

40

II.MATERIALYMTODOS
Loscultivosenmediolquidosehicieronenmatracesde100mlcon20mlde
medio R5A/MS a 30C (28C para S. cattleya) y 200 rpm, los matraces fueron
inoculados directamente con esporas frescas (no congeladas) a diferentes
Eliminado: o

concentraciones(normalmente105107esporas/ml).
Eneste trabajo,seha desarrollado una nueva metodologadecultivoapartir
deloquehemosdenominadoinculoscondicionadosdichosinculos,consistenen
laincubacindeunmatrazconunaconcentracindeesporasfrescasdelordende6,6
x 108 esporas/ml (aprox.), durante 14 das. Estos cultivos se emplean como inculos
para iniciar nuevos cultivos que hemos denominado cultivos condicionados
(ResultadosIII.3.2a).

II.4.4.CUANTIFICACINDEANTIBITICOS.
La cuantificacin de tienamicina se ha realizado mediante bioensayo frente a
unorganismosensible:Staphylococcusaureus.Los caldos decultivofueronaadidos
directamenteadiscosdeantibiogramaestrilesde5mmdedimetro.Dichosdiscos
secolocaronsobreplacasdepetride8,5cmdedimetrocon10mldemedioTSBcon

Eliminado: .

elmicroorganismoindicadorpreviamenteinoculado.Estasplacassedejaron1horaa
4C, y posteriormente 24 horas a 37C. La concentracin de antibitico se cuantific
extrapolando el dimetro de los halos obtenidos con curvas patrn realizadas
previamente utilizando imipenem (Merck), derivado comercial de la tienamicina
(GonzlezJ.A.,2003).
La

actinorrodina

la

undecilprodigiosina

se

cuantificaron

espectrofotomtricamentesiguiendolametodologadescritaporKiesseretal.,(2000).
El tacrolimus (FK506) se cuantific mediante bioensayos frente a la levadura
sensibleSaccharomycescerevisiaeTB23(Arndtetal.,1999).Lalevaduraseresiembra
parasumantenimientoenplacasdeYEDPA,seincubaa30C23dasyseconservaa
4C. Para el bioensayo se inoculan matraces con 100 ml de YEDPA con el asa de
siembratrasrascarlalevaduradelaplacapreviamenteguardadayseponenaincubar
a30Cy300rpmhastaqueelcultivoalcanceunadensidadpticade2a600nm.Una
vezalcanzadaladensidadpticaseaaden3mldelcultivoa60mldeYEDPA(1,5%
agar) a una temperatura mxima de 42C. Posteriormente se vierte el medio con el
microorganismo en placas Petri (25 ml por placa) y se deja 15 min en campana para
41

Eliminado:
Eliminado:

II.MATERIALYMTODOS
queelagarsolidifique,enestasplacassehacenpocillosconunsacabocadosde4cm
de dimetro. En cada pocillo se colocan 50 l de muestra y las placas se dejan
bocarriba durante 2 horas a 4C para permitir la difusin del tacrolimus. Despus se
dejana30Cdurante24hparapermitirelcrecimientodelalevadura.Finalizadoeste
tiempo se mide el dimetro de los halos de inhibicin y se estima la concentracin
utilizando una recta patrn generada con tacrolimus puro (aportado por la empresa
AntibioticosS.A.,Len).

II.4.5.MEDIDADEACTIVIDADHEXOQUINASA.
Lapresenciadeactividadhexoquinasaenelmedioextracelularseanalizenlas
fracciones del micelio por el mtodo Chou y Wilson (1975). Los reactivos empleados
fuerondeSigma.

II.4.6.GELESDEACTIVIDADNUCLEOLTICA:ZIMOGRAMAS.
Las nucleasas se separaron en un gel SDSPAGE al 12% (Laemmli, 1970)
conteniendo 10 g/ml de ADN de timo de ternera (Sigma). El SDS de estos
experimentos fue de USBUS75819 de Amersham Biosciences. Despus de la
electroforesis,lasprotenasserenaturalizaronmediantelavadosrepetidosdelgelcon
untampnderenaturalizacin(TrisHCl25mMpH8.8,EDTA1mM,mercaptoetanol
7mM)durantedoshorasa4C.Laactividadnucleolticasevisualizporincubacinde
los geles durante 2 horas a 37C en tampn 20 mM TrisHCL pH 8, 7 mM,

Eliminado: .0

mercaptoetanol,10mMMgCl2,10%DMSO(Niciezaetal.,1999),seguidoportincin
conbromurodeetidioyanlisisbajoluzUV.Comocontrolespositivosseemplearon
nucleasamicrococalyDNAasaIdepncreasbovino(AmershamPharmaciaBiotech).

II.4.7.CUANTIFICACINDELOSRIBODESOXIRRIBONUCLETIDOSLIBRES.
Losribonucletidosydesoxirribonucletidoslibresfueroncuantificadosenlos
extractos celulares despus de la extraccin con cido perclrico. Para ello, las
protenasyloscidosnucleicosseprecipitaronen0,625Ndecidoperclricodurante
30minutosenhielo.Lossedimentosconteniendoloscidosnucleicossedescartaron
por centrifugacin a 10000 rpm y los sobrenadantes conteniendo los ribo y
desoxirribonucletidos libres se usaron para calcular las cantidades de estos
42

Eliminado: .

II.MATERIALYMTODOS
monmeros.Loribonucletidosydesoxirribonucletidosfueronanalizadosdeacuerdo
con los mtodos de Schneider (1957) y Burton (1956) respectivamente. Las
determinaciones fueron repetidas tres veces. Los valores se estandarizaron con
respectoalpesofresco.

II.4.8.TCNICASDEFLUORESCENCIA.
a)Tincindeviabilidadcelular.
Se utiliz el ensayo descrito con anterioridad en Streptomyces (Fernndez y
Snchez, 2001; Fernndez y Snchez, 2002). ste ensayo implica la tincin de las
clulas con un ioduro de propidio (IP), y con SYTO 9, colorantes fluorescentes que
tien cidos nucleicos (LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Invitrogen, L
13152). El SYTO 9 (flouorescencia verde) tie el ADN de todas las clulas estn sus
membranasdaadaso no. El IP(fluorescencia roja)porel contrario, penetrasloen
lasbacteriasconlasmembranasdaadas,yenlasproporcionesempleadasdesplazaal
SYTO 9, causando una reduccin en la fluorescencia verde cuando ambos colorantes
estn presentes. As, en la presencia de ambos, las bacterias con las membranas
intactasaparecenconfluorescenciaverde,mientrasquelasquetienensumembrana
comprometida aparecen rojas (Haugland, 2002). La mezcla de colorantes se prepar
comorecomiendalafirmacomercial(Invitrogen),yseaadidirectamentesobrela
muestramicelial.Lasmuestrassetierondurante10minutos,yseobservaronenun
microscopio de fluorescencia lser confocal (Leica TCSSP2AOBS) a una longitud de
ondade488nmy568nmdeexcitacin,y530nm(verde)y630nm(rojo)emisin.Las
imgenes se combinaron usando el programa Leica Confocal Software. En algunos
casos las muestras tambin fueron observadas en el microscopio de contraste de
interferenciadeNormanskiqueestaccesibleenelmismoequipamiento.
b)Tincindemembranas.
Se emple el colorante fluorescente N(3triethylammoniumpropyl)4(p
diethylaminophenylhexatrienyl) pyridinium dibromide (FM 464), que tie la
membranaplasmticadelasclulas(VidayEmr,1995)yqueyahabasidousadocon
anterioridad en Streptomyces (Grantcharova et al., 2003; Manteca et al., 2005a). El
coloranteseaadidirectamentealmediodecultivo,aunaconcentracinfinalde1
g/ml,condicionesquenoafectaronalcrecimiento(FishovyWoldringh,1999).Enlos
43

II.MATERIALYMTODOS
tiempos apropiados, se tomaron muestras de cultivo que se procesaron para
microscopa del mismo modo descrito arriba para los ensayos de viabilidad. Las
seccionesseobservaronalmicroscopiolserconfocalaunalongituddeondade550
deexcitaciny700deemisin.
c)Tincindeparedescelulares.
Lasclulassefijaronen2.8%deparaformaildehido,0,0045%deglutaraldehido
enPBS(0,14MNaCl,2,6mMKCl,1,8mMKH2PO4)durante15minutosatemperatura
ambiente, posteriormente se lavaron dosveces con PBS,y se bloquearon con 2%de

Eliminado: .
Eliminado: .
Eliminado: .
Eliminado: .

seroalbminabovina(BSA,Sigma)enPBSdurante5minutos.LavancomicinaBODIPY
FL(Invitrogen,V34850)seutilizaunaconcentracinde0,5gml1enPBSdurante
15minutos.DespuslasmuestrasfueronlavadasdosvecesconPBSyobservadasenel
microscopioconfocalaunalongituddeondadelaexcitacinde505nanmetrosyde
laemisinde513nanmetros.
d)ExpresindelaProtenaverdefluorescente.
SeutilizlacepaS.coelicolorM600conelpromotordelgenredDfusionadoa
laprotenaverdefluorescente(GFP)(Sunetal.,1999),analizndoseloscultivosalas
90henelmicroscopioconfocalLeicaTCSSP2AOBS(480nm).

II.4.9.

ANLISIS

FLUORIMTRICOS

DE

LA

DIFERENCIACIN

EN

FERMENTACIONES
La medida de los procesos de diferenciacin en cultivos lquidos
(fermentaciones) se ha automatizado mediante el empleo de los colorantes
fluorescentes de viabilidad comentados arriba unidos a medidas de intensidad de
fluorescencia mediante el empleo de un fluormetro (PerkinElmer LS 50B)
(Longitudes de onda de excitacin 480 nm para el IP y 545 nm para el SYTO9;
longitudes de onda de emisin 500 y 610 nm respectivamente). Utilizando 1 ml de
cultivodeStreptomycescoelicolorencadacubetadefluormetromezcladoscon1ml
demezclade colorantesvitales (0,5mlIP y0,5 mlSYTO9). Serealizaron cultivospor
duplicado (dos rplicas biolgicas) y 3 medidas de cada cultivo (rplicas
metodolgicas).Lasmedidassetomaroncada10horasdecultivodesdelas10hhasta
las 100 h y cada 20 h hasta las 160 h. (Yage et al., 2010). El uso de volmenes de
medida relativamente grandes (2 ml) fue importante para conseguir medidas
44

Eliminado: .

II.MATERIALYMTODOS
reproducibles,yaqueloscultivosdeStreptomycesnosonhomogneos:Streptomyces
forma pellets de gran tamao que al usar volmenes de medida pequeos generan
granvariabilidad.

45

Selman Waksman

Alexander Fleming

III. RESULTADOS

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

III.RESULTADOS

III.1.ANLISISMEDIANTETCNICASDEBIOLOGADESISTEMAS(TRANSCRIPTMICA
YPROTEMICA)DELOSPROCESOSDEDIFERENCIACINDESTREPTOMYCES
Talcomosehacomentadoenlaintroduccin,nuestrogrupodeinvestigacin
ha realizado recientemente experimentos de protemica cuantitativa sobre las
diferenciasenlaexpresindeproteicadurantelasfasesdeMIyMIIencultivosslidos
(Manteca et al., 2010), con el objetivo ltimo de descubrir las protenas que estn
regulando las fases del ciclo de desarrollo descrito inicialmente desde un punto de
vistafundamentalmentemorfolgico.Enestatesisdoctoralhemoscontinuadoconel
desarrollo de estos experimentos, aplicando esta vez transcriptmica en lugar de
protemicaparaelestudiodelasfasesdeMIyMII,ytambinhemosextendidoestos
experimentos al estudio de los procesos de muerte celular programada, mediante el
empleodeambastcnicas(protemicaytranscriptmica).
III.1.1. TRANSCRIPTMICA DE LOS GENES DIFERENCIALMENTE EXPRESADOS
DURANTELASFASESDEMIYMIIENCULTIVOSSLIDOSDES.COELICOLOR
a)FraccionamientodelasfasesdeMIyMIIencultivosslidosdeS.coelicolorM145
Unodelosprincipalesproblemasalahoradehacerexperimentosdebiologa
de sistemas en una bacteria micelial como es Streptomyces, es el hecho de que las
distintas fases de diferenciacin, as como los procesos de MCP coexisten durante el
ciclo de desarrollo. En un trabajo previo de protemica, hemos solventado este
problema desarrollando una tcnica de fraccionamiento celular del MI viable,
mediante la obtencin de protoplastos a las 16 horas de cultivo (las clulas muertas
del MI tienen sus membranas daadas y forman protoplastos inestables); y del MII
mediante lavados repetidos con tampones salinos para eliminar la protena
extracelularliberadadurantelalisisdelMI(Mantecaetal.,2010)(Fig.III.1.).Siguiendo
estametodologa,seprepararoncuatromuestrasdiferentes:unamuestradeMIviable
(protoplastosobtenidosalas16horas,MI16h);ytresmuestrasdeMIIobtenidasalas
24 horas (sin cubiertas hidrofbicas, micelio sustrato del ciclo de desarrollo
tradicional), a las 48 horas (con cubiertas hidrofbicas, micelio areo del ciclo
tradicional),yalas72horas(micelioesporulante)(Fig.III.1)
49

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.1.Arriba,representacingrficadelasfasesdeldesarrolloenlasquehemosestudiado
laexpresindiferencialdegenes.Abajo,fotografasdemicroscopalserconfocal(colorantes
de viabilidad IP y SYTO9) de las muestras recogidas para el estudio despus de su
fraccionamiento.Nteselaausenciademiceliomuerto(tincinrojaconIP)entodasellas.

b)IdentificacinycuantificacindelosgenesdeS.coelicolor M145diferencialmente
expresadosduranteeldesarrollo
Tal como se ha indicado en el apartado anterior, en este experimento se
analizaron 4 muestras (MI16h, MII24h, MII48h y MII72h), de las cuales se tomaron tres
rplicas biolgicas (12 muestras en total). Se usaron tres micromatrices
independientes para cada rplica biolgica, normalizando los valores de abundancia
frente a ADN genmico (Fig.III.2). Los datos se normalizaron utilizando una
normalizacin tipo clm, y se seleccionaron los valores de abundancia de los genes
con un valor p menor o igual de 0,05. Posteriormente se filtraron los valores
seleccionados en funcin de su reproducibilidad entre rplicas biolgicas. Se
seleccionaron los valores de abundancia de aquellos genes con un coeficiente de
variacin menor o igual de 0,25 entre las tres rplicas biolgicas analizadas,
seleccionndose un total de 1901 genes (24% de todas las ORFs de S. coelicolor). La
reproducibilidad de los valores da abundancia de estos genes se ilustra en la figura
III.3.
Eliminado:

50

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.2. Representacin esquemtica del diseo experimental de los anlisis de


transcriptmicadelasfasMIMII.

Una vez que filtramos por los valores reproducibles entre rplicas biolgicas
(Fig.III.3a), hemos ordenado los valores de abundancia de cada gen (log2 MII/MI) en
orden creciente (Fig.III.3b). Como era de esperar, los valores de abundancia de la
mayora de los 1901 genes cuantificados no presentan grandes variaciones entre los
MIyMII(valoreslogartmicosdeabundanciacercanosa0),mientrasqueunospocos
genes estn claramente regulados al alza en el MII (valores positivos) o en el MI
(valores negativos) (Fig.III.3b). En consecuencia, los valores obtenidos son
reproducibles entre rplicas biolgicas (Fig.III.3a), y adems tienen significado
biolgico(Fig.III.3b).

51

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.3.a)Valoresdeabundanciarelativadelas3rplicasbiolgicasdecadamuestrafrenteel
ADNgenmico.b)Valoresdeabundanciarelativamediosdelastresrplicasbiolgicas(Log2
MII/MI)paracadaunodelos1901genescuyaabundanciasecuantificenestetrabajo.Los
genesconvalorescercanosacero(lamayora)varanpocoentreMIMII.Losgenesconvalores
positivos estn regulados al alza en MII. Los genes con valores negativos estn regulados al
alzaenMI.

A continuacin, se agruparon los valores de abundancia de estos 1901 genes,


identificadosycuantificadosdeformafiableencategorasfuncionales(Figs.III.4yIII.5).
EntodosloscasossetomcomoreferenciaelMI16h,ysemostraronloscocientesde
los MII24h/MI16h, MII48h/MI16h y MII72h/MI16h en valor logartmico. En consecuencia,
valoresnegativosindicangenesreguladosalalzaenelMI,yvalorespositivosindican
genesreguladosalalzaenelMII(Figs.III.4yIII.5).Aligualquesucedaconelproteoma
52

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

(Manteca et al., 2010a, b), con muy pocas excepciones, los mismos genes estn
reguladosalalzaolabajaentodoslasfasesdeMIIanalizadas(MII24h,sustrato;MII48h,
areo; MII72h, esporas). Adems, la inmensa mayora de los genes codificando
protenas implicadas en el metabolismo primario estn reguladas al alza en el MI,
mientrasquelosdemetabolismosecundarioloestnenelMII(Fig.III.4).Tambinse
ha visto que la mayora de los genes que codifican transposones y secuencias de
insercinestnreguladosalalzaenelMII,mientrasquelosgenesrelacionadosconla
conjugacin, recombinacin y mutagnesis lo estn en el MI (Fig.III.5). El posible
significadodetodosestosdatossediscutirenlaDiscusin.

Fig.III.4. Agrupacin de los genes diferencialmente expresados en las fases MIMII en


categoras funcionales. La categora de metabolismo primario incluye: Genes codificando
protenas de replicacin de ADN/ARN, cadena respiratoria y ciclo de Krebs, gluclisis y
gluconeognesis, ruta de laspentosasfosfato, metabolismo de aminocidos y del nitrgeno,
metabolismo de nucletidos, otros enzimas anablicos, traduccin y plegamiento de
protenas, nucleasas y metilasas; la de metabolismo secundario incluye tanto genes
codificando protenas de sntesis de metabolitos secundarios, como de diferenciacin,
septacindelashifasyesporulacin.

53

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.5. Continuacin de la figura III.20. La categora funcional de protenas reguladoras


incluyereguladorestranscripcionales,kinasas/fosfatasasyotrasprotenasreguladoras.

Talcomosediscutirendetallemsadelante,estosresultadoscorroboranlos
datosquenuestrogrupodeinvestigacinhaobtenidodurantelosltimos10aos:el
MI compartimentalizado es el micelio vegetativo de Streptomyces y tiene mayor
expresindelosgenesdelmetabolismoprimario;mientrasqueelMIImultinucleado
es el micelio diferenciado productor de metabolitos secundarios, destinado a la
esporulacin y con mayor expresin de los genes implicados en la sntesis de
antibiticos (ActVA, SCO5077; actII4, SCO5085; redF, SCO5898 etc.), formacin de
cubiertas hidrofbicas (rdlA, SCO2718; chpE, SCO1800; ramS, SCO6682, etc) y
esporulacin (divIVA, SCO2077; Sfr, SCO2607; partitioning or sporulating protein,

54

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

SCO1772; etc.) desde tiempos tan tempranos como las 24 horas (micelio sustrato)
(Tablasuplementaria1).
Cuando se compara la abundancia de los genes identificados en esta tesis
mediante transcriptmica, con las abundancias de las protenas identificadas
previamenteennuestrogrupodeinvestigacinmedianteprotemica(Mantecaetal.,
2010a, b), podemos ver que de las 53 ORFs identificadas en ambos casos, 30 tienen
unosvaloresdeabundanciasimilares(protenas/genesdeMIIoMIenamboscasos);
mientrasque23tienenvaloresdeabundanciadiferentesenfuncindesianalizamos
genesoprotenas,olasdistintasfasesdeMII(Fig.III.6).Adems,deestasltimas23
ORFsslo10tenandiscrepanciasensusvaloresdeabundanciasignificativos(mayores
de 2; log2 1), lo que nos deja con una correlacin muy buena entre los datos de
protemicaytranscriptmica.

Fig.III.6. Valores de abundancia de los 53 ORFs que encontrados por protemica y


transcriptmica.30valorescoincidenenambosanlisismientrasque23sondiferentes.

55

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

III.1.2. PROTEMICA Y TRANSCRIPTMICA DE LAS PROTENAS Y GENES


DIFERENCIALMENTEEXPRESADOSDURANTELOSPROCESOSDEMCP
a) Fraccionamiento de clulas vivas y muertas durante los procesos de MCP en
StreptomycescoelicolorM145
Tal y como se ha comentado varias veces a lo largo de esta tesis doctoral,
Streptomycesesunabacteriamicelialconunciclodedesarrolloenelqueseproducen
fenmenos de MCP. Los segmentos vivos y muertos coexisten en la misma hifa
durante la MCP del MI que precede a la diferenciacin del MII (Fig.III.7), y su
separacinesunodelosprincipalesretosmetodolgicosalahoradehacerunestudio
debiologadesistemasdeesteproceso.

Fig.III.7.MicroscopalserconfocaldeunahifajovendeMI(S.coelicolor)durantelafasede
MCP.Seaprecianlossegmentosvivos(verde)ymuertos(rojo)enlamismahifadeMI.Ntese
laesporadelaqueseoriginlahifaenelextremoderechodelaimagen.

Paraello,enuntrabajopreviodenuestrogrupodeinvestigacinsedesarroll
unametodologaconsistenteenlaobtencindeprotoplastosdurantelafasedeMCP
del primer micelio compartimentalizado (MI) (Manteca et al., 2006a). En tiempos
tempranos (9 horas) se pueden obtener muestras de protoplastos enriquecidos en
clulasqueseestnmuriendo(tincinrojaconIP);entiemposmstardos(13horas)
se obtienen muestras de protoplastos enriquecidas en clulas viables (tincin verde
conSYTO9)(Fig.III.8b),loquesedebeaquelasmembranasdelossegmentosmuertos
56

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

del MI ya estn demasiado daadas pera permitir la formacin de protoplastos


estables.Apesardequeelfraccionamientodeclulasvivasymuertasnofueeficiente
al100%,unanlisisdelestadodeintegridaddelADNcromosmico(Fig.III.8c),delas
actividades nucleolticas inducidas durante la MCP (Nicieza et al. 1999) (Fig.III.8d), el
estadodelARN(Fig.III.8e)ylascantidadesdenucletidoslibres(Fig.III.8f)demostraron
que las muestras estaban lo suficientemente enriquecidas en protoplastos vivos y
muertosparadetectarladegradacindelADNyARN,ascomolasbandasdeactividad
caractersticasdelanucleasade29kDaselectivadesecuenciasricasenGC(Caletal.
1995; Manteca et al. 2006b), y grandes cantidades de nucletidos libres (sobre todo
ribonucletidos)enlamuestradeclulasmuertas(9horas),peronoenladeclulas
vivas(13horas).

Fig.III.8. a) Esquema del ciclo de desarrollo de Streptomyces. b) Fotografas con microscopio


lserconfocalycolorantesvitales(IP/SYTO9)delasfasesdemuerteenlasqueserecogieron
las muestras (paneles superiores), y de las muestras despus de su procesamiento
(protoplastos;panelesinferiores).c)Geldeacrilamidaenelqueseobservaladegradacindel
ADNcromosmicoalas9hylaausenciadedegradacinalas13h.d)GelSDSPAGEenelque
seobservalaexistenciadeactividadnucleasaalas9hylaausenciaalas13h.e)Electroforesis
ennanochipdeARNenlaqueseobservaladegradacindelARNalas9hylaintegridaddel
ARNalas13h.f)Cantidaddenucletidoslibresexistentesenlamuestras9y13h.

57

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Conestametodologasencilla,ademsdesepararclulasvivasdemuertas,se
estseleccionandoporlasclulasqueestnenlosestadosmstempranosdelaMCP,
aquellosenquelamembranaestdaada(tincinconIP),peroquetienenestabilidad
suficienteparaformarprotoplastos.Estosprotoplastosmuertossuponenunestado
muytransitorio,ysepuedenobtenerentiempostempranosdelaMCP(9horas),pero
no en tiempos ms tardos (13 horas). De hecho, los protoplastos muertos son muy
inestables, y deben ser procesados rpidamente ya que de lo contrario se lisan y
desaparecen.
b) Identificacin y cuantificacin de las protenas de Streptomyces coelicolor M145
diferencialmenteexpresadasdurantelaMCP
Talcomosedetallaenmaterialymtodos,seusarondosrplicasbiolgicasde
clulas vivas y muertas que a su vez se fraccionaron en citosol y membranas. Las
protenas se procesaron para su anlisis protemico mediante la tcnica de marcaje
isobrico(iTRAQ)seguidodeunanlisisdeLCMS/MS(Fig.III.9).

Fig.III.9. Diseo experimental del anlisis protemico de las fases de muerte celular
programada.

Usando los criterios de identificacin detallados en material y mtodos, se


identificaron de forma fiable un total de 542 protenas (7% del proteoma de S.
coelicolor) (Fig.III.10a). La mayora de las protenas identificadas (301), se localizaban
58

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

en la fraccin de membrana; 132 se localizaban en la fraccin citoslica; y 109 se


detectaronenambasfracciones(Fig.III.10a).Losvaloresdeabundanciarelativa(ratio
vivo/muerto)fueronreproduciblesentrelasrplicasbiolgicas(Fig.III.10b).Adems,y
como es esperable, los valores de abundancia fueron menos variables entre rplicas
metodolgicasdelamismamuestra(log2ratiosmuerto/muertoylog2ratiosvivo/vivo
cercanosa0;puntosrojosenFig.III.10b)queentrelasclulasvivasymuertas(puntos

azulesenlaFig.III.10b).
Fig.III.10. a) Izquierda, diagrama de Venn ilustrando las protenas identificadas en las
fracciones citoslica y de membrana; derecha, nmero de protenas sin pptido seal ni
dominios transmembrana (0), con al menos un dominio transmembrana (TM), o con un
pptido seal (S) en las distintas fracciones (citosol, membrana, citosol y membrana) b)
Grfica de reproducibilidad entre rplicas metodolgicas (puntos rojos) y biolgicas (puntos
azules).

A continuacin, y usando los datos de abundancia relativa de estas 542


protenas, se compararon las diferencias entre los proteomas de las clulas vivas y
muertas(Fig.III.11).Ambosproteomaseranmuysimilares(log2iTRAQratioscercanos
a0).Lasnicasprotenasconvariacionessignificativas(log2iTRAQratiosmayoresque
1omenoresque1;talcomosedescribeenmaterialymtodos)fueronprotenasde
metabolismoprimario:protenaribosomal50SL9(SCO3909,log2Muerto/Vivo1,49),
factor de elongacin Ts (SCO5625, log2 Muerto/Vivo 1,49), protena ribosomal 50S
L7/L12 (SCO4653, log2 Muerto/Vivo 1,59), factor Rho terminador de la transcripcin
(SCO5357,log2Muerto/Vivo1,15),ADNligasa(SCO7522,log2Muerto/Vivo1,06);una
59

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

protena de estrs como scoF2, protena de estrs por fro (SCO4505, log2
Muerto/Vivo 2,05); y una protena reguladora, nagE2 (SCO2907, log2 Muerto/Vivo
1,01), que es una permeasa clave en la captacin de Nacetilglucosamina, un
importante regulador de la diferenciacin de Streptomyces (Nothaft et al., 2010)
(Fig.III.11yTablaSuplementaria1).

Fig.III.11. Diferencias entre los proteomas (paneles superiores) y transcriptomas (paneles


inferiores)delasclulasvivasymuertasagrupadosencategorasfuncionales.Lascategoras
funcionalessonlasmismasdescritasenlasfigurasIII.4yIII.5.

c) Identificacin y cuantificacin delos genes de S. coelicolor M145 diferencialmente


expresadosdurantelaMCP
TalycomosecomentaenMaterialyMtodos(apartadoII.1.1),enelcasode
losexperimentosdetranscriptmicaseanalizaron4rplicasbiolgicasysusARNsse
procesaroncomoseilustraenlafigura.III.12. Paralacuantificacindelaabundancia
deexpresingnica,sloseusaronlassondasdelarrayconsecuenciasnicasycon
valores de abundancia con buena reproducibilidad entre rplicas biolgicas
(coeficiente de variacin menor de 0,25, 28.255 sondas en total). Las sondas tienen
una media de 60 nucletidos, y en consecuencia, la mayora de los genes estn
representadospormsdeunasonda,yestefueelsiguientefiltroempleadoeneste
trabajo: de las 28.255 sondas con buena reproducibilidad entre rplicas biolgicas,

60

Eliminado:

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

slo mantuvimos aquellas con buena reproducibilidad dentro del mismo gen
(utilizandouncoeficientedevariacinmenorde0,25)(Fig.III.13).
Eliminado:

Con formato: Sangra:


Primera lnea: 0 pto

Fig.III.12. Diseo experimental del anlisis transcriptmico de las fases de muerte celular
programada.

61

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.13. a) Reproducibilidad de los valores de abundancia entre rplicas biolgicas. b)


Comparacindelosvaloresdeabundanciadelas30ORFscuyaabundanciasecuantificenlos
experimentosdeprotemica(barrasverdes)ytranscriptmica(barrasazules).

Slo 302 genes pasaron los filtros descritos arriba, una pequea fraccin del
genomadeS.coelicolor(7825pautasabiertasdelectura),loquenoessorprendentesi
tenemos en cuenta el alto grado de degradacin del ARN en las clulas muertas
descrito arriba (Fig.III.8e). A continuacin, y de la misma forma que se hizo para los
datos de protemica, se analizaron los valores de abundancia relativa de estos 302
genes agrupados en categoras funcionales (Fig.III.13). Al contrario de lo que suceda
con los proteomas, los transcriptomas de las clulas vivas y muertas fueron muy
diferentes, siendo el cambio de la mayora de ellos superior a 2 (log2muerto/vivo
mayoromenorde1).Estomismoseobservaalcompararlosvaloresdeabundancia
delas30ORFsdetectadasporprotemicaytranscriptmica(Fig.III.13b).

d) Diferencias ms importantes entre los proteomas/transcriptomas de las clulas


vivasymuertas

A continuacin nos centramos en el anlisis de aquellas protenas y genes

expresados ms diferencialmente entre las clulas vivas y muertas, y cuya funcin


biolgica era conocida, o se poda atribuir por homologas a funciones relacionadas
62

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

conladiferenciacincelularydegeneracindevariabilidadgentica(transformacin,
conjugacin, recombinacin, estrs, divisin celular y esporulacin, detencin del
crecimiento, regulacin transcripcional) (Fig.III.14). Estos genes y protenas incluan
BldH (AdpA, SCO2792), una protena de tipo AraC considerada como el regulador
maestro a travs del cual el gen bldA ejerce sus efectos en la regulacin de la
diferenciacin y la activacin del metabolismo secundario (Chater KF. y Chandra G.
2008), as como la protena RecA (SCO5769) implicada en los procesos de
recombinacin gnica. Tambin hay protenas y genes de funcin desconocida pero
que portan dominios proteicos con homologas con dominios de funcin conocida:
SCO4885 una protena de funcin desconocida que porta un dominio tipo Med
(protenadecompetenciadeBacillus;Oguraetal.,2002);SCO1395portaundominio
tipoMutTconfuncindeproteccinmutagnica (Setoyamaetal.,2011);SCO0172y
SCO0937 portan un dominio tipo Usp que se ha implicado en la detencin del
crecimientocelular(Liuetal.,2007)(Fig.III.14).

63

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.14. a) Esquema de abundancia relativa de los genes expresados al alza en las clulas vivas (izquierda) y muertas (derecha). b) Representacin
esquemticadelasposiblesfuncionesenlasqueestaranimplicadoslosgenesdiferencialmenteexpresadosencadaetapa.

64

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

III.2.ANLISISFUNCIONAL:MUTAGNESIS
La informacin obtenida por nuestro grupo de investigacin con los
experimentos de biologa de sistemas descritos en los apartados anteriores, ser la
base para el diseo de futuros experimentos destinados a caracterizar las rutas
molecularesregulandolasetapasdediferenciacindelasfasespreesporulantes(MCP,
transicinMI/MII)nocontempladasenelciclodedesarrollotradicional(vaseFig.I.3.
en la introduccin). Para ello, haremos mutagnesis sistemtica de las protenas y
genes diferencialmente expresados durante el desarrollo, seguidos de anlisis
fenotpicos y anlisis de interaccin protenaprotena. Todos estos experimentos se
encuentranreflejadosenelproyectodeinvestigacinenelqueestimplicadonuestro
grupo de investigacin (ERC Starting Grant, Strpdifferentiation 280304; 20122016).
Durante la parte final de esta tesis doctoral hemos empezado a desarrollar este
trabajo,escogiendolosgenesyprotenasindicadosenlaTabla1parasumutagnesis
y caracterizacin fenotpica. Tal y como se ha descrito en el apartado Material y
Mtodos,paralamutagnesis,hemosutilizadolacoleccindecsmidoscreadaenel
grupodelProf.Dyson(UniversidaddeSwansie)(FernandezMartnezetal.,2011),en
la que se han interrumpido un 83 % de los genes de S. coelicolor M145 mediante el
trasposnTn5062(verMaterialyMtodosapartadoII.3).
En primer lugar, comenzamos analizando los genes diferencialmente
expresadosdurantelosprocesosdeMCP.Hemoscomenzadohaciendolamutagnesis
de8delosgenesmostradosenlaFig.III.14:genesreguladosalalzaenlasclulasque
estncomenzandoamorir(SCO4885,SCO0633,SCO2954,SCO4505,SCO5946)yotros
en las clulas que permanecan viables (SCO0172, SCO0937, SCO1395). De forma
interesante,las8cepasmutantesanalizadastenanunaesporulacintremendamente
acelerada(39horasenlugardelas63horasnecesariasparalaesporulacindelacepa
salvaje; Fig.III.15). Adems, los mutantes de 4 de estos genes tenan una produccin
acelerada de antibiticos (undecilprodigiosina y actinorodina). Estos fenotipos nos
permitieron postular la existencia de puntos de bloqueo de la esporulacin
controladosalmenosenparteporestosgenes(vasediscusin).

65

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.15.a)Fotografasdecultivosenmedioslido,placas(izquierda)ymicroscopaconfocal(colorantesvitales)(derecha)demutantesdeS.coelicolor.b)
EsquemadelciclodevidadeStreptomycesindicandolafaseenlaquepodranestarimplicadoslosgenesmutados.

66

III.RESULTADOS
Tambin hemos comenzado a hacer mutagnesis de los genes y protenas
detectadosdiferencialmenteexpresadosdurantelasfasesdeMIyMII(17genes;Tabla
1). La mayora de los mutantes analizados tenan fenotipos claros en cuanto a un
adelanto del crecimiento, la produccin de antibiticos o la esporulacin, y en estos
momentosestamostrabajandoenlacaracterizacindetalladadesusfenotipos(vase
discusin).

67

III.RESULTADOS

SCO0937
SCO4885
SCO4505
SCO0633
SCO2954
SCO5946
SCO0148
SCO0517
SCO1119
SCO1358
SCO1490
SCO1504
SCO2168
SCO2567
SCO3033
SCO3042
SCO3043
SCO3067
SCO4117
SCO4920

Esporulacin

SCO0172

MutT
Usp

Usp

Med

Choquetrmico
Protenahipotetica
FactorsigmaARNpol
membraneprotein
putativetranscriptionalregulatoryprotein
hypotheticalprotein
putativeasnCfamilytranscriptional
regulatoryprotein
putativeLysRfamilytranscriptional
regulator
putativeNusBfamilyprotein
putativeregulator
hypotheticalprotein
putativeintegralmembraneprotein
putativeintegralmembraneregulatory
protein
putativetranscriptionalregulator
conservedhypotheticalprotein
putativeantiantisigmafactor
putativemembraneprotein
putativedeoRfamilytranscriptional
regulator

Produccin

SCO1395

FUNCIN

Crecimiento

GEN

Conservacin
(%)

Tabla 1. En la siguiente tabla se describen de forma general 26 mutantes (en genes que se
expresanalalzaenlasdiferentesfasesdelciclodedesarrollo;MCP,MIyMII),especificndose
su funcin, su porcentaje de conservacin medio dentro de algunas de las cepas de
Streptomyces cuyo genoma est secuenciado (S. avermitillis, S. griseus, S. scabies) y las
diferencias en crecimiento, produccin y esporulacin respecto a la cepa salvaje. + Fenotipo
acelerado;Fenotiporetrasado.

90,2

++

++

67,2

++

++

95

++

++

84,6

++

+++

97
64
85
48,6
94.5
69,6

+++
+++

95,6

87,6 +++

+++

+++

92
57,3
93,6
75

++
=
+
=

+
++
+++

+++
+++

80,6

76
76,6
89,6
60

+
+
++
+

+
+

89,3

++

+++
+
++

++

+++
+

SCO5249

putativenucleotidebindingprotein

92,3

SCO6020
SCO4505
SCO0527

putativetranscriptionalregulator
coldshockprotein
coldshockprotein

79
97
95,3

68

III.RESULTADOS
III.3. OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN DE ANTIBITICOS EN CULTIVOS LQUIDOS
DESTREPTOMYCES.
III.3.1.DESARROLLOYDIFERENCIACINDESTREPTOMYCESCOELICOLORM145
ENCULTIVOSLQUIDOS.
Tal y como se describe en la introduccin (apartado I.2.2), nuestro grupo de
investigacinhaestadotrabajandoalolargodelosltimosaosenelestudiodelos
procesos de MCP y diferenciacin de Streptomyces. Estos estudios condujeron a la
elaboraciondeunnuevomodelodedesarrolloparaestabacteriaencultivosenmedio
slido(esporulantes),ascomoaldesarrollodeunaseriedemetodologasyprotocolos
para el anlisis de los procesos de diferenciacin de esta bacteria: microscopa
confocal para el estudio de la viabilidad y la tabicacin de las hifas (Manteca et al.,
2005a,b); marcadores de lisis celular como la medida de la actividad del enzima
hexoquinasaenelmedioextracelular(Mantecaetal.,2006b);marcadoresdemuerte
celular programada como son las actividades nucleolticas implicadas en la
degradacindelADNcromosmico(Niciezaetal.,1999,Mantecaetal.,2006a,b);etc
En esta tesis doctoral, hemos aplicado estas metodologas al estudio de los
procesosdedesarrolloydiferenciacinencultivoslquidos,condicionesenlascuales
nohayesporulacinyseasumaquenohabadiferenciacin.

a) Estudio mediante microscopa lser confocal de los procesos de muerte y


diferenciacin.
TalcomosedescribeenelaparatadoMaterialyMtodos,seanalizelciclo
de desarrollo en dos condiciones experimentales: cultivos con un inculo inicial de
esporas de 107 esporas/ml (Fig.III.16); y cultivos con un inculo de 105 esporas/ml
(Fig.III.17).Enelcasodelinculoconcentrado,seobserventiempostempranos(8h)
la existencia de un micelio viable compartimentalizado (MI, Fig.III.16a). Las hifas de
este micelio comienzan a agruparse formando masas (pellets) que sufren procesos
de muerte en su interior (Fig.III.16b). Las hifas viables de la periferia de estas masas
continancreciendodeformaquehayunaumentodeldimetrode las mismas (Fig.
III.16b, c). Entre las 24 y las 36 horas se produce una detencin en el aumento del
dimetro de estas masas (Fig.III.16c, d), y alrededor de las 48 horas, comienza a
apreciarse en el centro de las mismas el desarrollo de hifas en forma de islotes que
69

III.RESULTADOS
surgenapartirdelossegmentosdemicelioquepermanecanviables(Fig.III.16e).El
desarrollodeestosislotesdehifas,ascomodelashifasquepermanecanviablesenla
periferiadelos"pellets"contribuyeaunanuevafasedecrecimientoquesereflejade
nuevo en el aumento del dimetro de las masas (Fig.III.16f, g). Adems, a grandes
aumentos(Fig.III.16h,i)seobservaqueestashifas,adiferenciadelasinicialesdeMI
(Fig.III.16a),prcticamentecarecendetabiques,siendoportantohifasmultinucleadas
(MII).

Fig.III.16. Desarrollo de S. coelicolor a partir de un inculo de esporas concentrado (107


esporas/ml).LoscultivosfueronteidosconloscolorantesfluorescentesdeviabilidadIPy
SYTO9.LasflechasindicanlosseptosdelmicelioI.Seindicaneldimetrodelasmasasde
micelioylostiemposdedesarrollo.MI:MicelioI;MII:MicelioII.

70

III.RESULTADOS
En la figura III.17 se muestra un anlisis del ciclo de desarrollo mediante el
empleodeuninculodeesporasmsdiluido(105esporas/ml).Agrandesrasgos,se
observaelmismociclodedesarrolloconlassiguientespeculiaridades:seretrasanlos
tiemposdedetencindelcrecimientoysurgimientodelsegundomicelio(comprese
Fig.III.16deconFig.III.17de);lasmasassedesarrollanconundimetromuysuperior
aldelinculoconcentrado(compreseFig.III.16gconIII.17h).

Fig.III.17.DesarrollodeS.coelicolorapartirdeuninculodeesporasdiluido(105esporas/ml).
Los cultivos fueron teidos con los colorantes fluorescentes de viabilidad IP y SYTO 9. Las
flechas indicanlosseptos del micelio I. Se indicanel dimetrode lasmasasde micelio y los
tiemposdedesarrollo.MI:MicelioI;MII:MicelioII.

71

III.RESULTADOS
b)EstudiodelacompartimentalizacindelashifasencultivoslquidosdeS.coelicolor.
Encultivosenplaca(medioslido)deStreptomyces,sehadescritolaexistencia
de dos estructuras miceliales: una compartimentalizada (Micelio I) y la otra
multinucleada (Micelio II) (Manteca et al. 2005a). Tal como se ha indicado en el
apartado anterior, el mismo tipo de estructuras son visibles en cultivos lquidos con
tincionesdeviabilidad.Noobstante,lastincionesdeviabilidadtiencidosnucleicos,
y en consecuencia, hemos realizado un estudio detallado de la tabicacin de estas
hifas mediante el uso de colorantes especficos de pared (vancomicina) y membrana
(FM464) celulares (Fig.III.18). Lo que observamos es que en tiempos tempranos hay
un micelio compartimentalizado (MI) en el que se alternan clulas (Fig. III.18ef)
separadas por tabiques compuestos por membranas celulares (Fig.III.18j), pero con
escasa pared celular (Fig.III.18k). Este micelio, predomina hasta la fase de MCP y
detencindelcrecimiento.Elmicelioquesurgeposteriormenteenelcentroyperiferia
de los "pellets" tras la detencin del crecimiento (ver apartado anterior) es
multinucleado con tabiques espordicos (Fig.III.18d, h, i) formados por membranas
(Fig.III.18j,l),yparedesgruesasvisiblestraslatincinconvancomicina(Fig.III.18k,m).
En la Figura III.18g, h se muestra la fase de transicin entre el micelio I
compartimentalizado que forma la periferia de las masas (antes de la detencin del
crecimiento) y el micelio II multinucleado posterior: los segmentos de micelio I
comienzanacrecerasincrnicamentecomounmicelioII multinucleado(Fig.III.3g),el
cual ser el micelio predominante en tiempos posteriores (Fig.III.18gh). Resultados
similaresseobtienenalanalizarelinculodiluido(105 esporas/ml),conlasalvedadde
unretrasoenlostiemposdeaparicindelsegundomicelio(datosnomostrados).

72

III.RESULTADOS

Fig.III.18.Presencia/ausenciadetabicacinenlashifasalolargodeldesarrolloenS.coelicolor(inculode107esporas/ml).Lasimgenes(ai)secorrespondencon
tincionesdeviabilidadSYTO9/IP;lasimgenes(j)y(l)secorrespondencontincionesdeFM464(membranas),lasimgenes(k)y(m)secorrespondencontincin
de vancomicina (pared celular). Las flechas indican los septos del micelio I. Las puntas de flecha indican septos que se tien simultneamente con FM464 y
vancomicina.Seindicaneldimetrodelasmasasdemicelioylostiemposdedesarrollo.MI:MicelioI;MII:MicelioII.

73

III.RESULTADOS
c) Los procesos de muerte/diferenciacin en cultivos lquidos de S. coelicolor se
reflejanenlascurvasdecrecimiento.
La Figura III.19muestra lascurvasdecrecimiento (pesosecoyprotenatotal)
de cultivos en medio lquido de S. coelicolor a partir de un inculo diluido (105
esporas/ml)yuninculoconcentrado(107esporas/ml).Talycomosehacomentado
en los apartados anteriores, el crecimiento est claramente retrasado en el inculo
diluido respecto al concentrado. En ambos casos se evidencian dos fases de
crecimiento exponencial que se corresponden con el desarrollo del micelio I
compartimentalizado y el micelio II multinucleado respectivamente. Ambas fases de
desarrolloestnseparadasporunadetencintransitoriadelcrecimiento(Fig.III.19).

Fig.III.19. Curvas de crecimiento de S. coelicolor en cultivos lquidos. a) Peso seco (mg/ml) frente al
tiempo(horas).Enlapartesuperiordelasfigurasseindicanlasfasesdeldesarrollo(micelioI,detencin

decrecimientoymicelioII).Lasbarrasindicanelerrorestndardetresmuestrasindependientes.

74

III.RESULTADOS

Fig.III.19.CurvasdecrecimientodeS.coelicolorencultivoslquidos.b)Protena(mg/ml)frente
altiempo(horas).Enlapartesuperiordelasfigurasseindicanlasfasesdeldesarrollo(micelio
I,detencindecrecimientoymicelioII).Lasbarrasindicanelerrorestndardetresmuestras
independientes.

75

III.RESULTADOS
d)Marcadoresbioqumicosevidencianlaexistenciadeunamuertecelularprogramada
encultivoslquidosdeS.coelicolor.
En cultivos slidos se ha descrito la existencia de una muerte celular
programada (Manteca et al., 2006b), cuya caracterstica principal es la de ser un
procesolticoduranteelcualseactivandeformaespecficayordenadaunaseriede
enzimas efectores de muerte, entre los que destacan las nucleasas encargadas de la
degradacin del ADN cromosmico de la propia bacteria (Manteca et al., 2006a,
2006b). Con el fin de analizar la existencia de estos procesos en cultivos lquidos, se
hanempleadodosmarcadoresbioqumicos:porunlado,ycomomarcadordelisis,se
haanalizadolapresenciadelenzimacitoslicohexoquinasaenelmedioextracelular;
por otro, se ha analizado mediante zimogramas la induccin de las nucleasas
inespecficas que caracterizan la muerte celular programada de Streptomyces
(Manteca et al., 2006b). Los resultados se muestran en la figura III.20. Hay una
correlacinperfectaentrelosprocesosdescritosenlosprrafosanterioresmediante
tincionesdeviabilidadymicroscopalserconfocal,ylacinticadeestosmarcadores
bioqumicos. La liberacin de hexoquinasa y la induccin de actividad nucleoltica se
ponendemanifiestoenelmomentoenelquevemosprocesosdemuerteenelcentro
delasmasasdemicelio(Fig.III.20yapartadosanteriores).Adems,seapreciaunclaro
retrasoenlosprocesosdemuerteenelinculodiluido(105esporas/ml)conrespecto
alinculoconcentrado(107esporas/ml).

76

III.RESULTADOS

Fig.III.20. Marcadores bioqumicos de lisis y muerte celular programada. (a) aparicin del enzima citoslico hexoquinasa en el medio
extracelular.Enlapartesuperiordelagrficaseindicanlasfasesdeldesarrollo(micelioI,detencindecrecimientoymicelioII).Lasbarras
indicanelerrorestndar.(b)y(c)zimogramasmostrandolavariacindelaactividadnucleoltica.Eltiempodedesarrolloseindicaenhoras.p
correspondealafraccincelular("pellet");scorrespondealafraccinextracelular("sobrenadante").

77

III.RESULTADOS
e)LaproduccindeantibiticoencultivoslquidosdeStreptomycescoelicolorM145se
correlacionaconlosprocesosdedesarrollo/diferenciacin.
Streptomyces

coelicolor

produce,

entre

otros,

los

antibiticos

undecilprodigiosinayactinorrodina(Hopwoodetal.,1995).Unanlisisdetalladodela
cintica de produccin de ambos antibiticos ha demostrado la correlacin entre la
aparicindelmiceliomultinucleado(MII),ylaproduccindeantibitico(Fig.III.21a,b).
De hecho, esta es la primera vez en que la produccin de antibitico pudo
correlacionarse con la diferenciacin de Streptomyces (Manteca et al., 2008). De
nuevo, hay un retraso en la fase de produccin en el inculo diluido respecto al
concentrado, ydichoretrasoesexactamenteel mismoquese produceenlafasede
detencin del crecimiento y desarrollo posterior del segundo micelio. Estos datos
sugieren,aunquenolodemuestran,queelMIIeselmicelioproductordeantibitico.
Con el fin de ver fsicamente que estructura/micelio est produciendo el
antibitico,seanalizmediantemicroscopalserconfocalenunacepadeS.coelicolor
M600laexpresindelaprotenaverdefluorescentebajoelcontroldelpromotorde
unodelosgenesimplicadosenlasntesisdeundecilprodigiosina(redD)(Fig.III.21c,d;
verMaterialyMtodosapartadoII.4.9d).EnlafiguraIII.21csemuestraunafotografa
de la fase de mxima produccin para la condicin de inculo concentrado (107
esporas/ml),quecoincideconlafaseenqueelMIIocupaelcentroyperiferiadelos
"pellets"(compreselaFig.III.16gconFig.III.21c).EnlafiguraIII.21dsepuedeobservar
directamente la produccin del antibitico bajo microscopa de contraste de fases
(colorrojo).Resultadossimilaresseobtienenencondicionesdeinculodiluido,conla
salvedaddeunretrasoapreciableenlostiemposdedesarrollo.

78

III.RESULTADOS

Fig.III.21. CinticadeproduccindeantibiticoencultivoslquidosdeS.coelicolor.(a)Actinorrodina;(b)Undecilprodigiosina.Enlaparte
superior de las grficas se indican las fases del desarrollo (micelio I, detencin de crecimiento y micelio II). Las barras indican el error
estndarde tres muestrasindependientes. (c) fotografas fluorescencia que muestra la expresin dela protena verde fluorescente. (d)
mismocampobajocontrasteinterferencial.(e)fotografadecontrastedefasesilustrandolaproduccindeantibitico(colorrojo)enel
centrodelasmasasdemicelio.

79

III.RESULTADOS
III.3.2. OPTIMIZACIN DE LA PRODUCCIN DE ANTIBITICO EN DISTINTAS
ESPECIESDESTREPTOMYCESMEDIANTELAMODIFICACINDELOSPARMETROSDE
DESARROLLO/DIFERENCIACINENMEDIOLQUIDO.

a) Streptomycescattleya:produccindetienamicina.
Con el fin de optimizar la produccin de antibitico en cepas de inters
industrialbajoelpuntodevistadelciclodedesarrollo(mejoradeladiferenciacindel
micelioproductor:MII)comenzamosaanalizarfermentacionesenmediolquidodeS.
cattleya(cepacedidaporAsturpharmaS.A).Scattleya,eslacepadeStreptomycesde
laqueseaisllatienamicinaporprimeravez.Latienamicina,fueelprimercompuesto
tipo carbapenema descubierto (Espaa, 1976). Actualmente se conocen ms de 50
antibiticosquecontienenelanillocarbapenemaaunquelamayorasonderivadosde
latienamicina.Esunantibiticolactmicodenaturalezainestable,raznporlacual
nose utiliza enclnica comotal,sinoqueseusanderivadoscomo la imipenemayla
meropenema en infecciones severas en las que el microorganismo patgeno es
resistentealosantibiticoshabituales,apesardequehaceunadcadahanempezado
aaparecercepasresistentes(NordmannyPoeirel,2002).
LafiguraIII.22ilustraelciclodedesarrollodeS.cattleyaencultivossumergidos
partiendodeuninculodeesporas(6,6x108esporas/ml).AligualquesucedaenS.
coelicolor,traslagerminacindelasesporasapareceunmiceliocompartimentalizado
(MI; Fig.III.22ac), pero en este caso, el micelio se agrupa muy poco, permaneciendo
viable durante ms tiempo (comprese la figura III.22 con III.16). A las 24 horas
(Fig.III.22de) comienza la MCP, observndose segmentos vivos y muertos
alternndose en la misma hifa (Fig.III.22e). Posteriormente, y en tiempos tardos, se
observaunmicelioenelquesepuedenversegmentosvacos(porladegradacindel
ADN debida a la actividad de las nucleasas, ya no se tien con IP), alternando con
largossegmentosmultinucleados(MII;compreseFig.III.22acon22f).Portodoello,la
diferenciamsclaraentreS.cattleyayS.coelicolorresideenlamenoragrupacinen
S.cattleya,ascomoelmenordesarrollodelMII.

80

III.RESULTADOS

Fig.III.22.DesarrolloencultivossumergidosdeS.cattleyaapartirdeuninculodeesporas
(6,6 x108 esporas/ml). Lasflechasindican los septos delmicelio I. Las puntasde flecha enf
indicansegmentosmuertosdemicelioIquehanperdidosufluorescenciaporaccindelas
actividadesnucleolticas.Seindicanlostiemposdedesarrollo.MI:MicelioI;MII:MicelioII.

Tal y como se ha apuntado en el apartado anterior, y se ha demostrado


posteriormentemedianteestudiosdebiologadesistemas(apartadoIII.1),elMIIesel
productordeantibitico,ydichomiceliosurgetrasunamuertecelularprogramaday
una detencin transitoria del crecimiento. Puesto que conocemos que el
agrupamiento de las hifas de MI y su MCP son crticos para el desarrollo del MII
productor de antibiticos, la aproximacin experimental que se sigui fue fomentar
estos procesos. Con este fin, se preincub una suspensin de esporas en medio de
cultivo (R5A) durante 14 das (en las condiciones de cultivo indicadas en Material y
Mtodos, 200 rpm y 30C). Con ello, se consiguieron provocar fenmenos de MCP
intensos, as como una detencin del crecimiento de gran parte de las hifas/esporas
que permanecen viables, pero sin crecimiento (Fig.III.23, fotos superiores). Segn
nuestra hiptesis, esta MCP liberara seales de diferenciacin a las hifas vivas
condicionndolas a desarrollarse en forma de MII. Posteriormente, este precultivo
que hemos denominado inculo condicionado se us para iniciar nuevos cultivos
(cultivoscondicionados).Deestaformaobservamosunmiceliocompartimentalizado
inicial (Fig.III.23a) que pronto comenz a desarrollarse como un MII multinucleado
(Fig.III.23c). La tasa de crecimiento inicial se aceler mucho con respecto al cultivo
iniciadoapartirdeesporas,consiguiendounmayoragrupamiento(Fig.III.23d,e),yuna
mayorproporcindemicelioII(compreseFig.III.22fconIII.23f).
81

III.RESULTADOS

Fig.III.23. Desarrollo de S. cattleya en cultivos lquidos iniciados a partir de un inculo


condicionado.Imgenessuperiores;estadodelinculodeesporascondicionadotrassu
incubacindurante14das(detallesenelapartadoIII.2a).Imgenesinferiores;ciclode
desarrollodeuncultivoinoculadoapartirdelinculocondicionado.Loscultivosfueron
teidos con los colorantes fluorescentes de viabilidad IP y SYTO 9. La imagen (b) fue
obtenidamediantemicroscopadecontrasteinterferencial.

Enlafigura.III.24asemuestralaproduccindetienamicina(mg/ml)respectoal
tiempo(horas)deuncultivocontrol,inoculadoapartirdeesporas,ydeuncultivoque
ha crecido a partir de un inculo condicionado. En el cultivo control la produccin
rondalos0,8g/mlmientrasqueenelcultivocondicionadosellegaaunaproduccin
de 2,5 g/ml, consiguindose por tanto aumentar unas 3 veces la produccin. En la
Figura.III.24bsemuestranlosmximosdeproduccinenfuncindelaconcentracin
de inculo en los dos cultivos, observndose como la produccin es mayor cuanto
mayoreslaconcentracindelinculo,ysiempreesmayorenelcultivocondicionado
queenelcultivocontrolrealizadoapartirdeesporas(nocondicionado).

82

III.RESULTADOS

Fig.III.24.a)Cinticadeproduccindetienamicinaencultivoslquidoscontrolycondicionado
deS.cattleya.

Fig.III.24.b)Mximosdeproduccindetienamicinadeloscultivoscontrolycondicionados
respectoalaconcentracinfinaldeesporas.

83

III.RESULTADOS
b)Streptomycestsukubaensis:productordetacrolimus.
UnodelosmicroorganismosmsimportantesanivelindustrialhoyendaesS.
tsukubaensis productor del inmunosupresor tacrolimus, tambin conocido como
FK506 o Fujimycin. Este compuesto fue aislado por primera vez en 1984 por la
empresa farmacetica japonesa Fujisawa Pharmaceutical Co. (Goto et al., 1987). El
tacrolimusesunmacrlidoconunanillolactonade23miembros,ypertenecealgrupo
delosinmunosupresores,utilizndosefundamentalmenteparaprevenirelrechazoen
pacientestrasplantadosdehgado,rinodecorazn.
Elsiguienteobjetivodeestatesisfueanalizarelciclodedesarrolloyproduccin
detacrolimusen Streptomycestsukubaensis (cedidaporelInstitutode Biotecnologa
de Len, INBIOTEC), aplicando los mismos parmetros e hiptesis previamente
estudiadas en otras especies como S. coelicolor o S. cattleya. En primer lugar
utilizamos medio de cultivo R5A (el medio rico de produccin que utilizamos de
habitualmente) y comparamos la produccin en las condiciones previamente
estudiadas; inculo de esporas e inculo condicionado (apartado II.4.4). En este
medio,yadiferenciadeloquesucedaenS.cattleya,lashifasdeMIdeS.tskubaensis
crecenyseagrupanenpelletsdiferencindoseenunMIIsiguiendoelesquemade
desarrollodescritoenS.coelicolor.ExisteunadiferenciaclaraeneldesarrollodeMII
entre las fermentaciones que partan de esporas y las que partan de un inculo
condicionado,puestoqueenestasltimasalas24hdeincubacinyaseveMII,no
asenlasfermentacionesquepartendeesporas(figuraIII.25).Apesardequeenestas
condiciones se forma MII, en este medio de cultivo no se consigue produccin de
tacrolimus.Noobstante,squeseobservalaproduccindeunantibiticodelafamilia
delasprodigiosinas(datosnomostrados).

84

Eliminado:
Eliminado:

III.RESULTADOS

Fig.III.25. Fotografas con microscopio lser confocal (hifas teidas con los colorantes vitales
SYTO9,IP)deS.tsukubaensiscreciendoenmedioR5A.Arriba;dostiposdeinculo,a)inculo
condicionadoyb)inculodeesporas(108 esporas/ml).Abajo;a)desarrolloalas24henR5A
partiendodelinculocondicionado(detalledehifasmultinucleadas;MII),b)desarrollodeS.
tsukubaensisalas24henR5Apartiendodeesporas(detalledehifastabicadas;MI).

En anlisis posteriores, cambiamos el medio R5A por el medio definido MG


(descritoenMaterialyMtodos,apartadoII.4.3b)yaqueestemediohabasidousado
con xito para la produccin de tacrolimus por cientficos del Instituto de
Biotecnologa de Len (INBIOTEC). Comparamos la produccin de un cultivo con un
inculo diluido (105 esporas/ml) con la produccin de un cultivo inoculado con un
inculoconcentrado(107 esporas/ml).ComosucedaenS.coelicolor (Mantecaet al.,
2008) y S. cattleya, en cultivos lquidos de S. tsukubaensis existe un micelio joven
compartimentalizado (MI), que sufre un proceso de MCP que precede a la
diferenciacin de un micelio multinucleado preesporulante (MII) (Fig.III.26 y 27). En
estas condiciones se observa produccin de tacrolimus, y como era esperable, la
85

III.RESULTADOS
produccinesmstemprana(72h)conelinculoconcentrado(107esporas/ml)que
con el diluido (105 esporas/ml) (96 h) (Fig.III.27). Sin embargo, la produccin de
tacrolimus es muy baja en el medio con inculo concentrado (Fig.III.26), lo que se
relacionaconelhechodequeS.tsukubaensisesporulaenestascondicionesapartirde
las96h(Fig.III.26),loqueesincompatibleconlasntesisdemetabolitossecundarios.
Enloscultivosrealizadosconinculosdiluidosseobservatambinesporulacin,pero
a tiempos tardos (160 h) (Fig.III.27) lo que permite la sntesis de tacrolimus durante
mstiempo,alcanzndosenivelesmayoresdeproduccin(Fig.III.28).

Fig.III.26. Desarrollo de S. tsukubaensis en medio lquido MG a partir de un inculo


concentrado(107esporas/ml).Loscultivosfueronteidosconloscolorantesfluorescentesde
viabilidadIPySYTO9.LaMCPsevisualizaenrojo.LasflechasmuestranlosseptosdelmiceloI.
Laspuntasdeflechaindicanlasesporas.

86

III.RESULTADOS

Fig.III.27.DesarrollodeS.tsukubaensisenmediolquidoMGapartirdeuninculodiluido(105
esporas/ml).LoscultivossetieronconloscolorantesfluorescentesdeviabilidadIPySYTO9.
La MCP se visualiza en rojo. Las flechas indican los tabiques de MI. Las puntas de flecha
indicanlascadenasdeesporas.

Fig.III.28.Produccindetacrolimus(enfuncindelaprotena)porS.tsukubaensisen
cultivolquido(medioMG)conalta(o)ybaja()concentracindeinculo.
87

III.RESULTADOS
Porltimo,intentamosaplicarlametodologadelosinculoscondicionados
descritaenelapartadoanteriorparaS.cattleyaafermentacionesdeS.tsukubaensis
creciendo en medio MG. En este medio no pudimos reproducir esta metodologa,
puestoquelasesporasentanaltaconcentracinpermanecanenestadodelatenciay
nogerminaban(Fig.III.29).

Fig.III.29. Inculo denso de esporas de S. tsukubaensis incubado durante 14 das en


medioMG.

III.3.3. UN NUEVO MTODO DE MONITORIZACIN ON LINE DE LAS


FERMENTACIONESINDUSTRIALES.
Talycomosehacomentadoenlosapartadosanteriores,losprocesosdeMCP
son el evento clave que determina la diferenciacin en Streptomyces, y en ltima
instancialaproduccindemetabolitossecundarios(Fig.III.30).Unadelastcnicasms
tilesparaelseguimientodeestosprocesos,eselusodeloscolorantesvitalesIoduro
de propidio y SYTO 9, pero su aplicacin pasa necesariamente por el uso de un
microscopiodefluorescencia,ydependadelacorrectainterpretacindelasimgenes
obtenidas, lo que en la prctica dificulta su implantacin como un mtodo de
seguimientodelosprocesosdediferenciacinenlasfermentacionesindustriales.Con
elfindeestandarizarelusodeestoscolorantes,loshemosutilizadoencombinacin
conunfluormetro,loquenoshapermitidocrearunndicecuantificableyfiabledela
88

III.RESULTADOS
diferenciacin:elcocientedeintensidadesvivo/muerto(SYTO/IP;Yageetal.,2010).
Para ello, hemos reproducido las fermentaciones de S. coelicolor descritas arriba
(medioR5Aconuninculode107esporas/ml;Fig.III.30).

Fig.III.30. Curva de crecimiento y produccin de antibiticos (Actinorrodina y


Undecilprodigiosina)encultivoslquidosdeS.coelicolor.Encimadelasgrficassemuestran
imgenesdemicroscopaconfocaldelosprocesosclaveeneldesarrollo(colorantesIoduro
de propidio y SYTO9), hifa de micelio I compartimentalizada (las flechas indican los
tabiques), masa de micelio con procesos de MCP en su interior (rojo) e hifas de segundo
miceliomultinucleado.Seindicalacoincidenciadelafasededetencindelcrecimientocon
laMCP.

89

III.RESULTADOS
Como era de esperar, las intensidades de emisin de los colorantes SYTO9
(clulas vivas) e IP (clulas muertas) se correlacionan bien con el desarrollo de
Streptomyces: en tiempos cortos, el desarrollo del MI vegetativo se traduce en un
incrementorpidodelaintensidaddelafluorescenciadelSYTO9;laintensidaddelIP
seincrementalentamentecomounresultadodelamuertedelashifasenelinterior
delasmasascelulares (pellets)quecomienzan a formarse(Fig.III.31); la intensidad
delIPaumentaconformeelcentrodelospelletssevaincrementandoymurindose
cada vez ms; en la fase de detencin transitoria del crecimiento, se produce una
rpidacadaenlafluorescenciadelSYTO9debidoaquelatasademuertedelMIenel
centro de las masas miceliales es mayor que la tasa de crecimiento del MI viable;
posteriormenteseproduceladiferenciacinydesarrollodelMIIquesetraduceenuna
nuevafasedecrecimientoexponencial,yenunaestabilizacinyposteriorincremento
de la fluorescencia del SYTO9 (Fig.III.31a). A pesar de la correlacin entre las
intensidadesdelSYTO9yelIP,susvaloresnoeranmuyinformativos,yasporejemplo,
unvalorde4000unidadesrelativasdeintensidadSYTO9sedabaporigualdurantelas
fases de MI y MII, y lo mismo pasaba con el IP (Fig.III.31a). No obstante, cuando los
datos se normalizaron como el cociente de las intensidades del SYTO9 / IP, pudimos
obtener un ndice fiable de diferenciacin (Fig.III.31b). En el caso de S. coelicolor, el
desarrollodelMIIylaproduccindeantibiticoslosucedanconvaloresmenoresde
1(Fig.III.31b).

90

Con formato: Derecha


III.RESULTADOS

Fig.III.31.Medidasfluorimtricas.(a)IntensidadesdeemisindelSYTO9(clulasvivas)yIP(clulasmuertas)alolargodeldesarrollodeS.coelicolor,se
muestranjuntoalaconcentracincelular(mgdeprotena/ml).(b)VariacindelcocienteSYTO9/IPalolargodelciclodedesarrollo.Tambinsemuestrala
produccindeantibitico(actinorrodinayundecilprodigiosina).MI,primermiceliocompartimentalizado;MIImiceliomultinucleado.Lasflechasindicanla
intensidadmximadeSYTO9(clulasvivas)quesecorrespondeconelmicelioI(15h)yelmicelioII(100H).Semuestranlasdesviacionestpicasdedos
rplicasbiolgicasmedidastresvecescadauna(tresrplicasmetodolgicas).U.R.,unidadesrelativas.

91

Francis Crick y James Watson

IV. DISCUSIN

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

IV.DISCUSIN
Talycomosehacomentadoarribaenlaintroduccin(apartadoI.2.1),elciclo
dedesarrollotradicionaldeStreptomycesconsiderabasolamentelasfasesdemicelio
sustrato, areo y esporulacin, y en consecuencia, estas son las fases de desarrollo
mejorcaracterizadas,ycuyaregulacinbioqumicaseconocemejor:genesBald,genes
Whi,formacindelascubiertashidrofbicasdelmicelioareo,etc...Porotrolado,las
fasespreesporulantesnocontempladasenelciclodedesarrollotradicional(transicin
MIMII, MCP),hansidoignoradas(vaseFig.I.3).Enesta tesis hemostrabajadoenla
caracterizacindeestasfasesque,talcomosehacomentadoarriba,sonlaclavepara
entenderladiferenciacinenfermentacionesdeStreptomyces.
Hemos utilizado tcnicas de biologa de sistemas (transcriptmica y
protemica) con el fin de identificar los genes y protenas diferencialmente
expresados/as durante las fases clave en el desarrollo. En primer lugar comenzamos
analizando mediante transcriptmica las fases de MI y MII en medio slido,
complementando los resultados que nuestro grupo de investigacin haba obtenido
recientementemedianteprotemica(Mantecaetal.,2010a).Comoeradeesperar,la
mayora de los genes detectados se expresaban de forma similar en los MI y MII
(genes houskeeping). Sin embargo, tambin se detectaron genes cuya expresin
variaba significativamente entre las fases de MI o MII. Separados por categoras
funcionales nos encontramos con que los genes expresados al alza en el MI estn
implicados principalmente en metabolismo primario, mientras que los regulados al
alza en MII lo estn en metabolismo secundario (Figura III.4), lo que demuestra el
hechoyacomentadodequeelMIIeselmiceliodiferenciadoproductordemetabolitos
secundarios. Tambin se ha observado que la mayora de los genes que codifican
transposonesysecuenciasdeinsercinestnreguladosalalzaenelMII(FiguraIII.5),
lo que podra estar indicando la activacin de mecanismos de generacin de
variabilidadgenticapreviosalasfasesdeesporulacin(MII).Losgenesrelacionados
con la conjugacin, recombinacin y mutagnesis estn regulados al alza en el MI
(FiguraIII.5),loquepareceindicarunaactivacindeestosmecanismosdurantelafase
de MI, justo despus de la primera ronda de muerte que afecta al micelio I
compartimentalizado. Los datos de transcriptmica obtenidos en esta tesis se
correlacionabanbienconlosdatosdeprotemicaobtenidospreviamentepornuestro
95

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

grupo de investigacin (Figura III.6), lo que reafirma la validez de los datos aqu
obtenidos. Cabe destacar que esto contradice en cierto modo trabajos de otros
autores que han descrito que la correlacin entre protemica y transcriptmica en
Streptomycesnoesbuena(Jayapaletal.,2008).Actualmenteestamostrabajandoen
la aplicacin de estas tcnicas de transcriptmica, al estudio de la diferenciacin en
cultivoslquidos,conelfindecompararladiferenciacinenslidoylquido,deforma
anloga a los experimentos de protemica realizados recientemente por nuestro
grupo(Mantecaetal.,2010b).
El siguiente objetivo de esta tesis doctoral fue el de estudiar mediante
transcriptmica y protemica las diferencias en la expresin de genes y protenas
durantelosprocesosdeMCP.LamayoradelasprotenasidentificadasdurantelaMCP
estn relacionadas con el metabolismo primario, puesto que stas son las ms
abundantes. Sorprendentemente, la abundancia relativa de dichas protenas en las
clulasvivasymuertasescasiidntica, loqueindicaqueMCPStreptomycesesun
proceso muy repentino en la que las protenas housekeeping no sufren cambios
significativos.Comoeradeesperar,losdatosobtenidosenestetrabajomedianteLC
MS/MSsecorrelacionanbienconaquellosobtenidosanteriormentepornuestrogrupo
de investigacin mediante el uso de geles bidimensionales (Manteca et al., 2006b).
Slo cinco (SCO1395, SCO3996, SCO4211, SCO6208, SCO7078) mostraron
discrepanciasensusvaloresdeabundancia.Lasdiferenciasentrelasdosmetodologas
podranatribuirsealaexistenciadeisoformasquepuedendetectarsemediantegeles
2DperonomedianteLCMS/MS.Comoeslgico, elrangodinmicodelatcnica de
LCMS/MS (542 protenas) fue mucho mayor que el de los geles bidimensionales (59
protenas),aportandomuchamsinformacin.
En esta tesis hemos analizado por primera vez la MCP de Streptomyces
medianteexperimentosdetranscriptmica,loquesupusoungranreto,yaqueelARN
de las clulas que se estn muriendo estaba muy degradado (Figura III.8e). Slo un
conjuntodeARNsquecodificanpara302genesestabansuficientemententegrospara
proporcionarvaloresdeabundanciareproduciblesbajonuestrodiseoexperimental
(Fig.III.9a). En total, hemos cuantificado de forma fiable la abundancia de 814 ORFs,
542protenas,y302genes,delascuales,slo30sedetectaronmedianteprotemicay
transcriptmica,ylosvaloresdeabundanciadesusprotenasyARNmensajerostenan
96

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

unabuenacorrelacin(Fig.III.9b).Losdatosdetranscriptmicaestnenriquecidosen
genes reguladores mientras que los datos de protemica se lo estaban
mayoritariamente en protenas de metabolismo primario. Los experimentos de
protemica estn sesgados hacia las protenas ms abundantes (algo intrnseco a la
propiatcnica)yennuestrocaso,losexperimentosdetranscriptmicaestnsesgados
hacia los ARN mensajeros que permanecen estables en las clulas que se estn
muriendo.Enconsecuencia,latranscriptmicanospermiticuantificarlaabundancia
relativa de los ARN mensajeros que codifican protenas implicadas en la MCP, y la
mayoradesusgenesnoseexpresanencantidadsuficienteparaserdetectadasporlas
tcnicas de protemica utilizadas. En consecuencia, ambos experimentos nos han
proporcionado informacin independiente y complementaria sin redundancia;
cuantificamoslaabundanciarelativade542protenasy302genes(814ORFsentotal;
10,5%deltotaldeORFsdeStreptomyces).Elconocimientosobrelasdiferenciasentre

Eliminado:

el proteoma y el transcriptoma de las clulas vivas y muertas representa un gran


avance en la biologa de Streptomyces y permitir futuros anlisis dedicados a
descubrir las protenas y genes que inducen o contribuyen de alguna manera en la
MCP.
En esta tesis, hemos empezado a explorar estos aspectos, mediante la
mutagnesis de ocho de los genes/protenas ms diferencialmente expresados
durante la MCP. El fenotipo de todos ellos consisti en una aceleracin muy
importantedelaesporulacin(39horasenlugardelas69horasdelacepasalvaje).La
existencia de esporulacin en el llamado micelio sustrato (MII sin cubiertas
hidrofbicas),esunfenotipomuyinusualquesehadescritoenmuypocasocasiones,y
se le haba llamado esporulacin ectpica, o esporulacin desprogramada
(Kelemen et al., 1995; Miguelez et al., 1997; Kwak y Kendrick, 1996; Ohnishi et al.,
2002). Estefenotipoesmuysorprendentesitenemosencuentaelgranretrasoentre
lafasededesarrolloanalizada(9h)ylaesporulacin(72h).Noobstante,ladiferencia
ms importante entre las clulas vivas y muertas est en protenas y genes
relacionados con esporulacin, recombinacin/mutagnesis y protenas de estrs.
Todo ello sugiere el papel de la MCP como un mecanismo de generacin de
variabilidadgentica,yderegulacindelaentradaenlafasedeesporulacin.

97

Con formato: Sin Resaltar

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

Trabajos recientes de nuestro grupo de investigacin demostraron que el


crecimientodeStreptomycesencondicionesnaturales,(suelosinoculadosconesporas,
el crecimiento es muy lento, y el micelio que predomina es el MI siendo el MII una
fase muy transitoria que esporulara rpidamente (Manteca y Snchez 2009). Si
consideramosesteciclonatural,larelacinentrelaMCPylaesporulacinestclara:
elMI(vegetativo)eslafasepredominantehastaqueapareceelestrsdelpropiociclo
de desarrollo (agotamiento de nutrientes, alta densidad celular, etc). La MCP
desencadena la diferenciacin del MII (multinucleado) que produce antibitico y
esporula.Laesporulacinpodraretrasarseencultivosdelaboratoriodebidoaquelas
seales que la desencadenan estaran bloqueadas (probablemente por un exceso de
nutrientes).Estassealespodransermoduladas,almenosenparte,porgenescomo
SCO0172,SCO0633,SCO0937,SCO1395,SCO2954,SCO4505,SCO4885,ySCO5946,ya
que su mutacin provoc una esporulacin muy adelantada (39 horas Fig.III.15). La
existencia de estos puntos de control bloqueando la esporulacin en condiciones no
adversasesunnuevoaspectodelabiologadeStreptomycesquenosehabadescrito
conanterioridadysupondraunagranventajaecolgica;laformacindelaesporaen
condiciones favorables podra implicar la prdida de competencia contra otros
microorganismospresentesenelambiente.Lacaracterizacindetalladadelpapelde
estos yotrosgenesdiferencialmente expresadosdurantelaMCP esuno denuestros
objetivosdefuturo,ycontribuiraconocermejorlasrutasbioqumicasquecontrolan
laMCPylosprocesosdediferenciacindelMIIenStreptomyces.Estosexperimentos
podran tener repercusiones en la industria farmacutica, ya que la MCP activa la
diferenciacin del MII productor de antibiticos (Manteca et al., 2010b). Adems
SCO0172, SCO0937, SCO1395 y SCO4885 estn altamente conservados en
Streptomyces(mediadesimilitudenS.avermitilis,S.scabies,yS.griseus,conrespecto
a S. coelicolor mayor del 90%, Tabla suplementaria 1) y sus mutaciones aceleran la
produccin de antibiticos (Fig.III.15). En consecuencia, una aplicacin potencial de
estetrabajopodrasermutarestosgenesencepasdeintersindustrialparaacelerar
laproduccindeantibitico.

98

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

Es bien conocido que las cepas de Streptomyces tienen cromosomas lineales


muyinestablesquecontienenelementostransponiblesyotroselementosadquiridos
medianteprocesosdetransmisinhorizontaldegenes,localizadosprincipalmenteen
sus extremos (Chen et al., 2002). Estas regiones terminales son muy variables y
contienen repeticiones invertidas de tamaos muy heterogneos (Chen et al., 2002).
Sepostulquelarecombinacinhomlogaylatrasnposicinpodranocurrirenalgn
momento del desarrollo de Streptomyces, pero la fase especfica an est por
descubrir (Chenetal., 2002). Enestatesishemosdemostrado laexpresinde genes
implicados en recombinacin y transposicin durante la MCP (SCO1395, SCO3996,
SCO4211,SCO6208,SCO7078),porloquelaMCPtendraunpapelimportanteenestas
reorganizacionescromosomales.
Larelacinentrelamuertecelularprogramadayladiferenciacin/esporulacin
esunfenmenoyadescritoenStreptomycesyotrasbacterias:esporulacinenBacillus
(Schultzetal.,2009),yMyxobacterias(SgaardAndersenyYang2008);diferenciacin
en Caulobacter cereus (Hochman, 1997); diferencacin de heterocistes en Anabaena
(Ning et al., 2002) o la formacin de clulas no cultivables, pero viables, en varias
bacterias gramnegativas (Hochman, 1997; Bogosian et al., 2001). Sin embargo, el
papelbiolgicoespecficodelaMCPsiguesiendopococlaro.LaMCPenbacteriases
unprocesoltico,ysufuncinmsobviapodraserlageneracindenutrientesparala
subsistenciadelasclulasdelapoblacinquequedanviables,unfenmenollamado
canibalismo y propuesto con anterioridad para Streptomyces (Mendez et al., 1985;
Miguelez et al., 1999) o Bacillus (GonzlezPastor 2010). Sin embargo, nosotros
consideramosqueelcanibalismonoessuficienteparaexplicarlaexistenciadelaMCP
bacteriana.Primero,porqueapesardelhechodequealgunoscomponentescelulares
liberados por las clulas muertas, son reciclados durante la esporulacin de
Streptomyces (Mendez et al., 1985) hay un exceso de nutrientes y la mayora de
precursoresoriginadosporlalisisdelMI(aminocidos,nucletidos,fosfolpidos,etc)
nosonrecicladosporlasesporas(almenosencultivosdelaboratorio;Mantecaetal.,
2006a).Segundo,porqueelARNdelasclulasmuertasestmuydegradado,peroel
ADNcromosmico,apesardeestarfragmentadoenmolculasdediferentestamaos,
no est degradado completamente hasta nucletidos libres (Figura III.8c). Estos
fragmentosdeADNdebentenerunpapelbiolgicomsalldelanutricin.Tercero,el
99

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

canibalismononecesitaraunaMCPactivaparaocurrir;lamuertepasivapornecrosis
serasuficienteparagenerarnutrientes.Cuarto,siconsideramosqueelnicopapelde
la MCP es la generacin de nutrientes, esto no explicara la relacin entre MCP y
esporulacin (Manteca et al., 2005a, 2005b, 2006a): en cultivos en medio rico, con
exceso de nutrientes, la esporulacin debera ocurrir sin muerte celular, y lo que
ocurre es precisamente lo contrario, medios ricos (por ejemplo el GLM enriquecido
conun2%decasaminocidos)bloqueancompletamentelaesporulacin(A.Mantecay
J. Sanchez, resultados no publicados). La alternativa al canibalismo podra ser la
competencia (la habilidad de las clulas para incorporar ADN exgeno). As por
ejemplo,enBacillusyStreptococcus,lasbacteriasenlasquemejorsehacaracterizado
la competencia natural, se demostr que la MCP liberaba ADN fragmentado que
tomaban las clulas esporulantes (en el caso de Bacillus) (Shultz et al., 2009), o las
clulas vivas en el caso de Streptococcus (Guiral et al., 2005). La induccin de la
competenciaylaMCPesdiferenteenStreptococcusyBacillus(ClaverysyHvarstein,
2007), y requiere condiciones especficas, que no siempre son fciles de reproducir
(Martinetal.,2000,Duitmanetal.,2007).LaMCPinduceenBacillusunaadaptacinal
estrs en la cual la competencia por transformacin gentica no siempre se alcanza
(Berka et al., 2002). A este estado de diferenciacin se le llama estadoK, y se
correspondeconlafaseenlacualseproducenlosantibiticos(ClaverysyHvarstein
2007).Enestatesis,postulamosqueelmismotipodeprocesopodraestarocurriendo
en Streptomyces y probablemente en otras bacterias en las que se ha descrito MCP,
especialmenteaquellasconciclosdedesarrollocomplejos.Losanlisisbioinformticos
en Streptomyces no dejan duda acerca de la existencia de una gran trasmisin
horizontal de genes (THG) (Wiener et al. 1998; Ueda et al., 1999; Egan et al., 2001;
MetsKeteletal.,2002;GarciaVallveetal.,2003;Nishioetal.,2004;Kawaseetal.,
2004; Manteca et al., 2004; Doroghazi y Buckley, 2010). La THG en bacterias puede
ocurrirporconjugacin(transferenciadeplsmidosdesdeunacluladonadoraauna
receptoramediadaporuncontactodirectoclulaclula),trasnduccin(mediadapor
virus las clulas intercambian ADN), o trasnformacin/competencia (cambio de
genotipoprovocadoporlaincorporacindeADNlibre).Laconjugacin(WangyPettis
2010) y la trasnduccin (Burke et al., 2001), se describieron con anterioridad en
Streptomyces,sinembargosurelacinconeldesarrollocontinasiendodesconocida.
100

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

La conjugacin y la transduccin pueden contribuir a generar HGT en Streptomyces


pero, como ocurra con el canibalismo, no necesitan de la MCP. Por todas estas
razones, nosotros proponemos la existencia de un proceso de competencia por
trasnformacinenStreptomyces:laMCPgeneraenltimainstanciaADNfragmentado
de las clulas muertas (Manteca et al., 2006a) el cual podra usarse por las clulas
vivas/esporulantesparalarecombinacin.Enestesentido,talycomosehadiscutido
arriba,medianteexperimentosdetranscriptmicadelasfasesdeMIyMII,sepudover
que haba una activacin de los genes relacionados con la conjugacin, la
recombinacinylamutagnesisenelmicelioI,justodespusdelaMCP,loqueest
deacuerdoconlahiptesisdelacaptacindeADNporpartedelasclulasviablesdel
MIquesediferencianalMII.
La bsqueda de nuevos compuestos bioactivos de inters en biomedicina se
est convirtiendo en uno de los mayores retos actuales como consecuencia del
preocupante incremento de las resistencias a los principales antibiticos. Dicha
bsqueda se ha hecho de forma tradicional mediante el aislamiento de cepas de
actinomicetos a partir de suelos de distintos orgenes, microcultivos, y anlisis de la
actividad mediante bioensayo (inhibicin del crecimiento de bacterias tipo). Estos
procesos de bsqueda de nuevos antibiticos, han sido tremendamente productivos
durantelallamadaedaddoradadelosantibiticos(19401960),pocaenlaquese
han descubierto la mayora de los antibiticos conocidos. En la actualidad, estos
procesossonmscomplicados,dadoquelosantibiticosmscomunesyaseconocen.
La principal limitacin de la bsqueda de estos compuestos a partir de cepas de
Streptomyces, era el alto nmero de falsos negativos: cepas descartadas como
productoras, porque no se estaban diferenciando hasta la fase de produccin MII.
Nuestro grupo de investigacin est siendo pionero en enfocar este problema
mediante un proceso simple: conseguir que las bacterias procedentes del ambiente
naturalsedesarrollenhastalafasedeMIIproductivaantesderealizarelanlisis.
Enresumen,enestatesisdoctoralhemosdefinidoporprimeravezlosprocesos
de desarrollo y diferenciacin de Streptomyces en cultivos lquidos identificando
claramente el MII como el micelio productor de antibiticos. Adems, hemos
trabajado en el anlisis de las diferencias en los proteomas y transcriptomas de S.
coelicolor en las distintas fases de desarrollo en cultivos slidos y lquidos (MI, MII,
101

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

MCP). Los resultados han corroborado el cambio del metabolismo primario al


secundario entre el MI compartimentalizado y el MII multinucleado, tanto en slido
como lquido, demostrando que el MI es el autntico micelio vegetativo de
Steptomyces y el MII (tanto sustrato como areo) son el micelio reproductivo
productor de antibiticos y destinado a esporular. Adems, se han identificado
numerosas protenas y genes reguladores de funcin desconocida (reguladores
transcripcionales, quinasas, etc.) cuya caracterizacin sin duda ser la clave para
entender los mecanismos que activan la diferenciacin del MII, y lo que es ms
importante,losmecanismosqueactivanlaproduccindemetabolitossecundariosen
este MII. En definitiva, hemos creado una base de datos con las protenas y genes
diferencialmente expresados durante la diferenciacin de Streptomyces cuya
caracterizacin ser la clave para encontrar las rutas biomolecluares controlando las
fases preesporulantes de la diferenciacin (MI, MII, MCP), lo que a su vez permitir
entender, y optimizar las fermentaciones y los procesos de bsqueda de nuevos
metabolitos secundarios a partir de Streptomyces. Todos estos experimentos se
encuentranreflejadosenelproyectodeinvestigacinenelqueestimplicadonuestro
grupodeinvestigacin(ERCStartingGrant,Strpdifferentiation280304;20122016),y
durante esta tesis doctoral hemos empezado a desarrollar este trabajo, realizando
mutagnesis y anlisis fenotpicos de 26 de estos genes (Tabla 1), obteniendo
resultadosmuyprometedores.
Numerosas industrias producen antibiticos mediante fermentaciones en
cultivos lquidos (grandes biorreactores) de Streptomyces. En estas condiciones, la
mayoradelosautoresasumanquenohabadiferenciacin,conlaexcepcindelas
pocasespeciesdeStreptomycesqueesporulanencultivoslquidos(Dazaetal.,1989,
KendrickyEnsig1983).Unodelosobjetivosfundamentalesdeestatesisfueextender
el nuevo modelo de desarrollo desarrollado por nuestro grupo de investigacin en
cultivosslidosesporulantesdelgneroStreptomyces(Mantecaetal.,2005a,2005b,
2006a, 2006b) a cultivos lquidos no esporulantes, prestando especial atencin a la
relacin entre diferenciacin y produccin de antibitico. Con este fin, se analiz el
ciclo de desarrollo de S. coelicolor, la especie ms estudiada de estreptomicetos. Al
igual que suceda en cultivos slidos, en medios lquidos tambin existe un micelio
102

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

jovencompartimentalizado(micelioI),quesufreunprocesodemuertetraselcualhay
una fase de detencin del crecimiento que a su vez precede al surgimiento y
diferenciacindeunmiceliomultinucleado(micelioII).LamuertedelmicelioIesun
proceso gradual que empieza momentos antes de la detencin transitoria del
crecimiento(apartadoIII.3.1a)yalcanzasumximoduranteestafase,lacualtambin
sehadetectadoencultivosslidossiendocondicinnecesariaparaelsurgimientodel
micelio areo (Chater, 1993; Granozzi et al., 1990; Hopwood, 1999; Chater, 2001;
Manteca et al., 2005b). Adems, se ha podido demostrar la correlacin entre el
desarrollo del micelio II y la produccin de antibiticos (apartado III.3.1e). Las
principalesdiferenciasentrecultivosslidosylquidosresidenpuesenlaausencia,en
elcasodecultivoslquidos,delaformacindecubiertashidrofbicas(micelioareo)y
esporulacin(Fig.VI.1).Estaeslaprimeravezquesehapodidodemostrarlaexistencia
dediferenciacinencultivoslquidosdeStreptomyces,yloqueesmsimportante,la
primera vez que se ha podido identificar el micelio productor de metabolitos
secundarios(MII).

Fig.VI.1.ComparacindelciclodedesarrollodeStreptomycesencultivoslquidosyslidos.

En rojo se muestran las nuevas fases descritas por nuestro grupo de investigacin. MCP;

muertecelularprogramada.

103

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

La carencia de un modelo de desarrollo que explicara la diferenciacin en


cultivos lquidos, hizo que la optimizacin de los procesos de fermentacin se haya
realizado tradicionalmente de forma emprica, existiendo grandes problemas de
reproducibilidad. La mayora de los grupos de investigacin que trabajan en la
optimizacin de la produccin de metabolitos secundarios a partir de cepas de
Streptomyces,loestnhaciendomediantemutagnesisalazarodirigida.Existenmuy
pocosgruposquetrabajenenlaoptimizacindelasfermentacionesdesdeelpuntode
vistadelciclodedesarrollodelmicroorganismo:laoptimizacindeldesarrollodelMII
productor. Estos resultados tienen como aplicacin biotecnolgica monitorizar y
optimizar los procesos de produccin de antibiticos, incluyendo la bsqueda de
nuevascepasproductorasapartirdemuestrasmedioambientales,unaspectocrtico
enbiomedicinacomoconsecuenciadelalarmanteincrementodelasresistenciasalos
antimicrobianos.Encuantoalaaplicacindelnuevociclodedesarrolloalestudiode
las fermentaciones de cepas de Streptomyces de inters industrial, hemos trabajado
condosespecies:StreptomycescattleyayStreptomycestsukubaensisproductorasdel
antibitico tienamicina y el inmunosupresor tacrolimus respectivamente. La
tienamicinaesunantibiticolactmicoconungranpoderbactericidayunespectro
deaccinmuyamplio,porloquepuedeusarseenmonoterapia,siendomuytilpara
tratar infecciones hospitalarias. Debido a su inestabilidad, la tienamicina, tiene que
modificarse qumicamente para que pueda ser usada en clnica, convirtindose en
imipenemy/omeropenem(Verbistetal.,1981;Horadametal.,1980;Shadomyetal.,
1981). Actualmente la tienamicina se est produciendo mediante sntesis qumica,
debidoaquelasbajasconcentracionesalasquelaproduceStreptomycesnopueden
competir econmicamente con los procesos de sntesis qumica. Los niveles de
produccin de la cepa salvaje de S. cattleya estn en concentraciones de 0,81 mg/l
(Kahanetal.,1979,Rodrguezetal.,2008).Enestetrabajo,mediantelamodificacin
de las condiciones de cultivo, usando como gua la optimizacin de los procesos de
muerte celular programada y surgimiento del micelio II, hemos llegado a niveles de
produccinde2,5mg/l,esdecir,hemosconseguidotriplicarlaproduccindelacepa
salvaje. Aunque estos niveles de produccin siguen sin ser suficientes para competir
conlosprocesosdesntesisqumicadetienamicina,constituyenlapruebapalpablede
104

Eliminado: Nuestros
Eliminado: una
Eliminado: clarapara

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

que el ciclo de desarrollo descrito en este trabajo es aplicable a especies de


estreptomicetos de inters industrial. Tambin hemos estudiado las fermentaciones
deS.tsukubaensis,productordetacrolimus,unimportanteinmunosupresorutilizado
enclnica.Aligualqueenelrestodelascepasanalizadas,laproduccindetacrolimus
slo se produca tras la diferenciacin del MII productor, pero en este caso, nos
encontramos con la existencia de requerimientos nutricionales: el tacrolimus slo se
produca en medios de cultivo concretos. En consecuencia, la produccin de
metabolitossecundariosdepende,enalgunasocasiones,ademsdelaformacindel
MII, de condiciones nutricionales especficas. Por otro lado, y siguiendo con las
aplicacinindustrialdelciclodedesarrollodeStreptomycesalamonitorizacindelos
procesos de diferenciacin en las fermentaciones industriales, de forma rpida,
sencillayobjetiva,hemosdesarrolladounprotocoloqueconsistaenlatincindelos
cultivosmedianteloscolorantesdeviabilidadSYTO9yioudurodepropidio,seguidode
sucuantificacinmedianteelusodeunfluormetro(Yageetal.,2010).Losvaloresde
abundancia relativa (cociente de intensidades SYTO9/IP) suponen un ndice objetivo
que permite conocer el estado de diferenciacin de los cultivos sin necesidad de
disponerdeunmicroscopiodefluorescenciaoconfocal,ysintenerunconocimiento
profundodeldesarrollodeStreptomyces.EnelcasodeS.coelicolor,eldesarrollodel
MIIylaproduccindeantibiticoslosucedanconvaloresmenoresde1(Fig.III.31b).
En la actualidad estamos trabajando en un diseo experimental que permita acoplar
las tinciones y medidas fluorimtricas a un biorreactor de forma automatizada y en
lnea, con el objetivo ltimo de implantar este ndice en la monitorizacin de las
fermentacionesindustriales.

105

Con formato: Derecha


IV.DISCUSIN

106

Con formato: Derecha

Albert Einstein

V. CONCLUSIONES

Con formato: Centrado

V.CONCLUSIONES

V.CONCLUSIONES

1. Experimentos de transcriptmica de los dos tipos de micelio (MI


compartimentalizadoyMIImultinucleado)revelanqueeltranscriptomadelMI
est enriquecido en genes de metabolismo primario, mientras que el MII lo
estengenesdemetabolismosecundario.Tambinsehanencontradogenes
reguladores de funcin desconocida diferencialmente expresados durante el
desarrollo.

2. Experimentos de protemica y transcriptmica dedicados al estudio de los


procesos de muerte celular programada revelan que el proceso implica la
activacindegenesyprotenasespecficosqueincluyenORFsrelacionadascon
la transformacin, conjugacin, recombinacin, estrs, divisin celular,
esporulacin,detencindelcrecimiento,yregulacintranscripcional.

3. Hemos comenzado a analizar la funcin biolgica de los genes y protenas


identificados en los experimentos de biologa de sistemas, mediante
mutagnesis.Actualmentetenemosuntotalde26mutantes,lamayoradelos
cuales tienen fenotipos claros relacionados con el adelanto/retraso del
crecimiento, la produccin de metabolitos secundarios y la esporulacin. La
caracterizacindetalladadelasfuncionesbiolgicasdestosyotrosgenes,as
como cual es su interaccin en la regulacin de la diferenciacin de
Streptomyces(MI/MII,MCP)sernnuestroobjetodeinvestigacindurantelos
prximosaos.

4. Streptomyces se diferencia en cultivos lquidos no esporulantes de forma


similaracomolohaceencultivosslidosesporulantes:unmiceliovegetativo
joven compartimentalizado (MI) sufre procesos de MCP y se diferencia a un
micelio multinucleado (MII) que es el micelio diferenciado responsable de la
produccindemetabolitossecundarios.

109

Con formato: Derecha

V.CONCLUSIONES
5. ElconocimientodelciclodedesarrolloencultivoslquidosdeStreptomyceses
la clave para entender y en su caso optimizar los procesos de produccin de
metabolitossecundarios encultivoslquidos deS. coelicoloryotras cepasde
intersindustrial.

6. En relacin a la muerte celular programada, como evento clave para la


diferenciacin,enestatesisdoctoralsehadescritounnuevoysencillomtodo
demonitorizacinonlinedelasfermentaciones,basadoenlaasociacinde
loscolorantesvitales;iodurodepropidioySYTO9,conmedidasfluorimtricas.
Elcocientedelasintensidadesdefluorescenciaencadafasedelciclonosdaun
ndicefiabledelestadodediferenciacinenelqueseencuentraelcultivo.

110

Con formato: Derecha

David Hopwood

Mervin Bibb

VI. BIBLIOGRAFA

VI.BIBLIOGRAFA
Aravind,L.,V.M.Dixit,etal.(1999)."Thedomainsofdeath:evolutionofthe
apoptosismachinery."TrendsBiochemSci24(2):4753.
Aravind,L.,V.M.Dixit,etal.(2001)."Apoptoticmolecularmachinery:vastlyincreased
complexityinvertebratesrevealedbygenomecomparisons."Science
291(5507):12791284.
Arndt,C.,M.C.Cruz,etal.(1999)."SecretionofFK506/FK520andrapamycinby
StreptomycesinhibitsthegrowthofcompetingSaccharomycescerevisiaeand
Cryptococcusneoformans."Microbiology145(Pt8):19892000.
Bakal,C.J.andJ.E.Davies(2000)."Nolongeranexclusiveclub:eukaryoticsignalling
domainsinbacteria."TrendsCellBiol10(1):3238.
Bao,K.andS.N.Cohen(2001)."Terminalproteinsessentialforthereplicationof
linearplasmidsandchromosomesinStreptomyces."GenesDev15(12):1518
1527.
Bao,K.andS.N.Cohen(2004)."ReversetranscriptaseactivityinnatetoDNA
polymeraseIandDNAtopoisomeraseIproteinsofStreptomycestelomere
complex."ProcNatlAcadSciUSA101(40):1436114366.
Bentley,S.D.,K.F.Chater,etal.(2002)."Completegenomesequenceofthemodel
actinomyceteStreptomycescoelicolorA3(2)."Nature417(6885):141147.
Berka,R.M.,J.Hahn,etal.(2002)."MicroarrayanalysisoftheBacillussubtilisKstate:
genomewideexpressionchangesdependentonComK."MolMicrobiol43(5):
13311345.
Bogosian,G.andE.V.Bourneuf(2001)."Amatterofbacteriallifeanddeath."EMBO
Rep2(9):770774.
Burton,C.J.(1956)."Studyoftheconditionandthemechanismofthediphenylamine
reactionforthecolorimetricestimationofDNA."Biochem.J.62,315323.
BouchekMechiche,K.,L.Gardan,etal.(2006)."Streptomycesturgidiscabiesand
Streptomycesreticuliscabiei:onegenomicspecies,twopathogenicgroups."Int
JSystEvolMicrobiol56(Pt12):27712776.
BouchekMechiche,K.,L.Gardan,etal.(2000)."DNArelatednessamongstrainsof
StreptomycespathogenictopotatoinFrance:descriptionofthreenewspecies,
S.europaeiscabieisp.nov.andS.stelliscabieisp.nov.associatedwithcommon
scab,andS.reticuliscabieisp.nov.associatedwithnettedscab."IntJSystEvol
Microbiol50Pt1:9199.
Bradford,M.M.(1976)."Arapidandsensitivemethodforthequantitationof
microgramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofproteindyebinding."
AnalBiochem72:248254.
Burke,J.,D.Schneider,etal.(2001)."GeneralizedtransductioninStreptomyces
coelicolor."ProcNatlAcadSciUSA98(11):62896294.
Cal,S.,J.F.Aparicio,etal.(1995)."Anovelexocytoplasmicendonucleasefrom
Streptomycesantibioticus."BiochemJ306(Pt1):93100.
Chandra,G.andK.F.Chater(2008)."EvolutionaryfluxofpotentiallybldAdependent
StreptomycesgenescontainingtherareleucinecodonTTA."AntonieVan
Leeuwenhoek94(1):111126.
Chang,P.C.andS.N.Cohen(1994)."Bidirectionalreplicationfromaninternalorigin
inalinearstreptomycesplasmid."Science265(5174):952954.

113

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
Chater,K.F.,in:Losick,R.(1984)."MorphologicalandPhysiologicalDifferentiationin
StreptomycesinMicrobialDevelopment".InShapiro,L.(Eds.).(Monographic
Series16),ColdSpringHarborLaboratoryPressColdSpringHarbor,pp.89115.
Chater,K.F.(1993)."GeneticsofdifferentiationinStreptomyces."AnnuRevMicrobiol
47:685713.
Chater,K.F.(2001)."RegulationofsporulationinStreptomycescoelicolorA3(2):a
checkpointmultiplex?"CurrOpinMicrobiol4(6):667673.
Chen,C.W.,C.H.Huang,etal.(2002)."Oncethecirclehasbeenbroken:dynamics
andevolutionofStreptomyceschromosomes."TrendsGenet18(10):522529.
Chou,A.C.andJ.E.Wilson(1975)."Hexikinaseofratbrain."MethodsEnzymol42:20
25.
Claessen,D.,W.deJong,etal.(2006)."RegulationofStreptomycesdevelopment:
reachforthesky!"TrendsMicrobiol14(7):313319.
Claverys,J.P.,B.Martin,etal.(2007)."Competenceinducedfratricidein
streptococci."MolMicrobiol64(6):14231433.
Cross,T.(1981)."Aquaticactinomycetes:acriticalsurveyoftheoccurrence,growth
androleofactinomycetesinaquatichabitats."JApplBacteriol50(3):397423.
DazaA,MartnJF,etal.(1989)."SporulationofseveralspeciesofStreptomycesin
submergedculturesafternutritionaldownshift." J Gen Microbiol 135(9):248391
deJong,W.,A.Manteca,etal.(2009)."NepAisastructuralcellwallproteininvolved
inmaintenanceofsporedormancyinStreptomycescoelicolor."MolMicrobiol
71(6):15911603.
DenserC.R.,GuimaraesL.M.,CandidaM.(2002)."Applicationsofimageanalysisin
thecharacterizationofStreptomycesolindensisinsubmergedculture".Braz.J.
Microbiol33,1721.
DenserC.R.,PamboukianD,CandidaM.(2004)."Productionoftheantitumoral
retamycinduringcontinuousfermentationsofStreptomycesolindensis".
ProcessBiochemistry39,22492255.
Doroghazi,J.R.andD.H.Buckley(2010)."Widespreadhomologousrecombination
withinandbetweenStreptomycesspecies."ISMEJ4(9):11361143.
Doull,J.L.andL.C.Vining(1989)."Cultureconditionspromotingdispersedgrowth
andbiphasicproductionofactinorhodininshakenculturesofStreptomyces
coelicolorA3(2)."FEMSMicrobiolLett53(3):265268.
Duitman,E.H.,D.Wyczawski,etal.(2007)."Novelmethodsforgenetic
transformationofnaturalBacillussubtilisisolatesusedtostudytheregulation
ofthemycosubtilinandsurfactinsynthetases."ApplEnvironMicrobiol73(11):
34903496.
Egan,S.,P.Wiener,etal.(2001)."PhylogenyofStreptomycesspeciesandevidencefor
horizontaltransferofentireandpartialantibioticgeneclusters."AntonieVan
Leeuwenhoek79(2):127133.
Eichinger,A.,H.G.Beisel,etal.(1999)."CrystalstructureofgingipainR:anArg
specificbacterialcysteineproteinasewithacaspaselikefold."EMBOJ18(20):
54535462.
Elizarov,S.M.andV.N.Danilenko(2001)."Multiplephosphorylationofmembrane
associatedcalciumdependentproteinserine/threoninekinasein
Streptomycesfradiae."FEMSMicrobiolLett202(1):135138.
114

Con formato: Derecha

Eliminado:

VI.BIBLIOGRAFA
Fernandez,M.andJ.Sanchez(2001)."Viabilitystainingandterminal
deoxyribonucleotidetransferasemediateddUTPnickendlabellingofthe
myceliuminsubmergedculturesofStreptomycesantibioticusETH7451."J
MicrobiolMethods47(3):293298.
Fernandez,M.andJ.Sanchez(2002)."Nucleaseactivitiesandcelldeathprocesses
associatedwiththedevelopmentofsurfaceculturesofStreptomyces
antibioticusETH7451."Microbiology148(Pt2):405412.
FernandezMartinez,L.T.,R.DelSol,etal.(2011)."Atransposoninsertionsinglegene
knockoutlibraryandneworderedcosmidlibraryforthemodelorganism
StreptomycescoelicolorA3(2)."AntonieVanLeeuwenhoek99(3):515522.
Fishov,I.andC.L.Woldringh(1999)."Visualizationofmembranedomainsin
Escherichiacoli."MolMicrobiol32(6):11661172.
Flardh,K.andM.J.Buttner(2009)."Streptomycesmorphogenetics:dissecting
differentiationinafilamentousbacterium."NatRevMicrobiol7(1):3649.
GadgilM,LianW,etal.(2005)."AnanalysisoftheuseofgenomicDNAasauniversal
referenceintwochannelDNAmicroarrays."BMCGenomics8;6:66.
GarciaVallve,S.,E.Guzman,etal.(2003)."HGTDB:adatabaseofputative
horizontallytransferredgenesinprokaryoticcompletegenomes."Nucleic
AcidsRes31(1):187189.
GarrityGM,LilburnTG,etal.(2007).TaxonomicOutlineoftheBacteriaandArchaea.
Part10TheBacteria:Phylum"Actinobacteria":ClassActinobacteria.Release
7.7:399539.
GonzalezJ.A.(2003)."ProduccindelantibiticolactmicoTienamicinaporS.
cattleya".TesisdoctoralUniversidaddeOviedo.
GonzalezPastor,J.E.(2011)."Cannibalism:asocialbehaviorinsporulatingBacillus
subtilis."FEMSMicrobiolRev35(3):415424.
Goranovic,D.,G.Kosec,etal.(2010)."OriginoftheallylgroupinFK506biosynthesis."
JBiolChem285(19):1429214300.
Goto,T.,T.Kino,etal.(1987)."DiscoveryofFK506,anovelimmunosuppressant
isolatedfromStreptomycestsukubaensis."TransplantProc19(5Suppl6):48.
Granozzi,C.,R.Billetta,etal.(1990)."Abreakdowninmacromolecularsynthesis
precedingdifferentiationinStreptomycescoelicolorA3(2)."JGenMicrobiol
136(4):713716.
Grantcharova,N.,W.Ubhayasekera,etal.(2003)."AmissensemutationinftsZ
differentiallyaffectsvegetativeanddevelopmentallycontrolledcelldivisionin
StreptomycescoelicolorA3(2)."MolMicrobiol47(3):645656.
Gronewold,T.M.andD.Kaiser(2001)."Theactoperoncontrolsthelevelandtimeof
CsignalproductionforMyxococcusxanthusdevelopment."MolMicrobiol
40(3):744756.
Guiral,S.,T.J.Mitchell,etal.(2005)."Competenceprogrammedpredationof
noncompetentcellsinthehumanpathogenStreptococcuspneumoniae:
geneticrequirements."ProcNatlAcadSciUSA102(24):87108715.
Hagedorn,C.(1976)."InfluencesofsoilacidityonStreptomycespopulationsinhabiting
forestsoils."ApplEnvironMicrobiol32(3):368375.

115

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
Haugland,R.P.(2002).Nucleoticaciddetectionandgenomicstechnology.In
HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals,Chapter8.Ninth
Edition.J.Gregory,editor.MolecularProbes,Inc.Eugene,OR.

Henderson,G.,P.Krygsman,etal. (1987)."Characterizationandstructureofgenesfor
proteasesAandBfromStreptomycesgriseus."JBacteriol169(8):37783784.
HeskethA,BuccaG,etal. (2007)."NewpleiotropiceffectsofeliminatingararetRNA
fromStreptomycescoelicolor,revealedbycombinedproteomicand
transcriptomicanalysisofliquidcultures".BMCGenomics2;8:261.
HobbsG.,FrazerC.M.,etal.(1989)."DispersedgrowthofStreptomycesinliquid
culture."AppliedMicrobiologyandBiotechnology.31,272277.
Hochman,A.(1997)."Programmedcelldeathinprokaryotes."CritRevMicrobiol
23(3):207214.
Hopwood,D.A.,K.F.Chater,etal.(1995)."Geneticsofantibioticproductionin
StreptomycescoelicolorA3(2),amodelstreptomycete."Biotechnology28:65
102.
Hopwood,D.A.(2007)."StreptomycesinNatureandMedicine:TheAntibiotic
Makers.NewYork,OxfordUniversityPress.
Horadam,V.W.,J.D.Smilack,etal.(1980)."InvitroactivityofNformimidoyl
thienamycin(MK0787),acrystallinederivativeofthienamycin."Antimicrob
AgentsChemother18(4):557561.
Ikeda,H.,J.Ishikawa,etal.(2003)."Completegenomesequenceandcomparative
analysisoftheindustrialmicroorganismStreptomycesavermitilis."Nat
Biotechnol21(5):526531.
Jakimowicz,D.,J.Majka,etal.(1998)."StructuralelementsoftheStreptomycesoriC
regionandtheirinteractionswiththeDnaAprotein."Microbiology144(Pt5):
12811290.
Jayapal,K.P.,R.J.Philp,etal.(2008)."UncoveringgeneswithdivergentmRNA
proteindynamicsinStreptomycescoelicolor."PLoSOne3(5):e2097.
Jimnez,A.,M.Zalacan,etal.(1987)."Clonacinyanlisisdegenesimplicadosenla
biosntesisdeantibiticos."Nuevastendencias.Ingenieragentica(Renard,J.y
Vicente,M.,ed.):496502.
Jonsbu,E.,M.McIntyre,etal.(2002)."Theinfluenceofcarbonsourcesand
morphologyonnystatinproductionbyStreptomycesnoursei."JBiotechnol
95(2):133144.
Kahan,J.S.,F.M.Kahan,etal.(1979)."Thienamycin,anewbetalactamantibiotic.I.
Discovery,taxonomy,isolationandphysicalproperties."JAntibiot(Tokyo)
32(1):112.
Kawase,T.,A.Saito,etal.(2004)."Distributionandphylogeneticanalysisoffamily19
chitinasesinActinobacteria."ApplEnvironMicrobiol70(2):11351144.
Kwak,J.andK.E.Kendrick(1996)."BaldmutantsofStreptomycesgriseusthat
prematurelyundergokeyeventsofsporulation."JBacteriol178(15):4643
4650.
Kelemen,G.H.,K.A.Plaskitt,etal.(1995)."DeletionofDNAlyingclosetotheglkA
locusinducesectopicsporulationinStreptomycescoelicolorA3(2)."Mol
Microbiol17(2):221230.
116

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
KendrickKE,EnsignJC.(1983)."SporulationofStreptomycesgriseusinsubmerged
culture."JBacteriol155(1):35766.
Kieser,H.M.,T.Kieser,etal.(1992)."Acombinedgeneticandphysicalmapofthe
StreptomycescoelicolorA3(2)chromosome."JBacteriol174(17):54965507.
KieserT,BibbMJ,ButtnerMJ,ChaterKF,HopwoodDA.(2000)."Practical
StreptomycesGenetics".Norwich,UK.:TheJohnInnesFoundation.
Kim,D.W.,K.F.Chater,etal.(2005)."Effectsofgrowthphaseandthe
developmentallysignificantbldAspecifiedtRNAonthemembraneassociated
proteomeofStreptomycescoelicolor."Microbiology151(Pt8):27072720.
Kim,Y.M.andJ.H.Kim(2004)."Formationanddispersionofmycelialpelletsof
StreptomycescoelicolorA3(2)."JMicrobiol42(1):6467.
Kino,T.andT.Goto(1993)."DiscoveryofFK506andupdate."AnnNYAcadSci685:
1321.
Kino,T.,H.Hatanaka,etal.(1987)."FK506,anovelimmunosuppressantisolated
fromaStreptomyces.II.ImmunosuppressiveeffectofFK506invitro."J
Antibiot(Tokyo)40(9):12561265.
Koonin,E.V.andL.Aravind(2002)."Originandevolutionofeukaryoticapoptosis:the
bacterialconnection."CellDeathDiffer9(4):394404.
Laemmli,U.K.(1970)."Cleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyofthe
headofbacteriophageT4."Nature227(5259):680685.
Leblond,P.,F.X.Francou,etal.(1990)."Pulsedfieldgelelectrophoresisanalysisof
thegenomeofStreptomycesambofaciensstrains."FEMSMicrobiolLett60(1
2):7988.
Leblond,P.,M.Redenbach,etal.(1993)."PhysicalmapoftheStreptomyceslividans
66genomeandcomparisonwiththatoftherelatedstrainStreptomyces
coelicolorA3(2)."JBacteriol175(11):34223429.
LewisRA,ShahiSK,etal.(2011)."Genomewidetranscriptomicanalysisofthe
responsetonitrogenlimitationinStreptomycescoelicolorA3(2)".BMCRes
Notes23;4:78.
Lezhava,A.,T.Mizukami,etal.(1995)."Physicalmapofthelinearchromosomeof
Streptomycesgriseus."JBacteriol177(22):64926498.
Lilburn,T.G.andG.M.Garrity(2004)."Exploringprokaryotictaxonomy."IntJSyst
EvolMicrobiol54(Pt1):713.
Lin,Y.S.,H.M.Kieser,etal.(1993)."ThechromosomalDNAofStreptomyceslividans
66islinear."MolMicrobiol10(5):923933.
LiuWT,KaravolosMH,etal.(2007)."RoleoftheuniversalstressproteinUspAof
Salmonellaingrowtharrest,stressandvirulence".MicrobPathog42:210.
Lloyd,A.B.(1969)."DispersalofStreptomycetesinair."JGenMicrobiol57(1):3540.
Long,C.M.,M.J.Virolle,etal.(1987)."alphaAmylasegeneofStreptomyceslimosus:
nucleotidesequence,expressionmotifs,andaminoacidsequencehomology
tomammalianandinvertebratealphaamylases."JBacteriol169(12):5745
5754.
Manteca,A.,T.Kamphausen,etal.(2004)."Cloningandcharacterizationofa
StreptomycesantibioticusATCC11891cyclophilinrelatedtoGramnegative
bacteriacyclophilins."FEBSLett572(13):1926.

117

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
Manteca,A.,M.Fernandez,etal.(2005a)."Adeathroundaffectingayoung
compartmentalizedmyceliumprecedesaerialmyceliumdismantlingin
confluentsurfaceculturesofStreptomycesantibioticus."Microbiology151(Pt
11):36893697.
Manteca,A.,M.Fernandez,etal.(2005b)."MyceliumdevelopmentinStreptomyces
antibioticusATCC11891occursinanorderlypatternwhichdetermines
multiphasegrowthcurves."BMCMicrobiol5:51.
Manteca,A.,M.Fernandez,etal.(2006a)."Cytologicalandbiochemicalevidencefor
anearlycelldismantlingeventinsurfaceculturesofStreptomyces
antibioticus."ResMicrobiol157(2):143152.
Manteca,A.,U.Mder,etal.(2006b)."AproteomicanalysisofStreptomyces
coelicolorprogrammedcelldeath."Proteomics6(22):60086022.
Manteca,A.,A.I.Pelaez,etal.(2006c)."Actinobacteriacyclophilins:phylogenetic
relationshipsanddescriptionofnewclassandorderspecificparalogues."J
MolEvol63(6):719732.
Manteca,A.,D.Claessen,etal.(2007)."Aerialhyphaeinsurfaceculturesof
StreptomyceslividansandStreptomycescoelicolororiginatefromviable
segmentssurvivinganearlyprogrammedcelldeathevent."FEMSMicrobiol
Lett274(1):118125.
Manteca,A.,A.I.Pelaez,etal.(2008a)."Ararecaseoflungcoinfectionby
StreptomycescinereoruberandHaemophilusinfluenzaeinapatientwith
severechronicobstructivepulmonarydisease:characterizationatspecieslevel
usingmoleculartechniques."DiagnMicrobiolInfectDis60(3):307311.
Manteca,A.,R.Alvarez,etal.(2008b)."Myceliumdifferentiationandantibiotic
productioninsubmergedculturesofStreptomycescoelicolor."ApplEnviron
Microbiol74(12):38773886.
Manteca,A.,A.I.Pelaez,etal.(2009a)."Ararecaseofsiliconemammaryimplant
infectionbyStreptomycesspp.inapatientwithbreastreconstructionafter
mastectomy:taxonomiccharacterizationusingmoleculartechniques."Diagn
MicrobiolInfectDis63(4):390393.
Manteca,A.andJ.Sanchez(2009b)."Streptomycesdevelopmentincoloniesand
soils."ApplEnvironMicrobiol75(9):29202924.
Manteca,A.,J.Sanchez,etal.(2010a)."Quantitativeproteomicsanalysisof
Streptomycescoelicolordevelopmentdemonstratesthatonsetofsecondary
metabolismcoincideswithhyphadifferentiation."MolCellProteomics9(7):
14231436.
Manteca,A.,H.R.Jung,etal.(2010b)."Quantitativeproteomeanalysisof
Streptomycescoelicolornonsporulatingliquidculturesdemonstratesa
complexdifferentiationprocesscomparabletothatoccurringinsporulating
solidcultures."JProteomeRes9(9):48014811.
Martin,B.,M.Prudhomme,etal.(2000)."Crossregulationofcompetence
pheromoneproductionandexportintheearlycontroloftransformationin
Streptococcuspneumoniae."MolMicrobiol38(4):867878.
MartnezCastro,M.(2010)."Controlporfosfatoenlabiosntesisdelinmunosupresor
tacrolimusendosespeciesdelgneroStreptomyces".Tesisdoctoral
UniversiadaddeLen.

118

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
Matsumoto,A.,S.K.Hong,etal.(1994)."PhosphorylationoftheAfsRprotein
involvedinsecondarymetabolisminStreptomycesspeciesbyaeukaryotic
typeproteinkinase."Gene146(1):4756.
Mendez,C.,A.F.Brana,etal.(1985)."Roleofsubstratemyceliumincolony
developmentinStreptomyces."CanJMicrobiol31(5):446450.
MetsaKetela,M.,L.Halo,etal.(2002)."Molecularevolutionofaromaticpolyketides
andcomparativesequenceanalysisofpolyketideketosynthaseand16S
ribosomalDNAgenesfromvariousStreptomycesspecies."ApplEnviron
Microbiol68(9):44724479.
Miguelez,E.M.,RuedaB.,etal.(1997).ColonydevelopmentinStreptomyces
carpinensis:astreptomycetewithsubstratemyceliumspores.FEMSmicrobiol
lett157:103107.
Miguelez,E.M.,C.Hardisson,etal.(1999)."Hyphaldeathduringcolonydevelopment
inStreptomycesantibioticus:morphologicalevidencefortheexistenceofa
processofcelldeletioninamulticellularprokaryote."JCellBiol145(3):515
525.
Morosoli,R.,J.L.Bertrand,etal.(1986)."Purificationandpropertiesofaxylanase
fromStreptomyceslividans."BiochemJ239(3):587592.
Musialowski,M.S.,F.Flett,etal.(1994)."FunctionalevidencethattheprincipalDNA
replicationoriginoftheStreptomycescoelicolorchromosomeisclosetothe
dnaAgyrBregion."JBacteriol176(16):51235125.
Nadvornik,R.,T.Vomastek,etal.(1999)."Pkg2,anoveltransmembraneprotein
Ser/ThrkinaseofStreptomycesgranaticolor."JBacteriol181(1):1523.
Nicholson,D.W.andN.A.Thornberry(1997).Caspases:killerproteases.Trends
BiochemSci.England.22:299306.
Nicieza,R.G.,J.Huergo,etal.(1999)."Purification,characterization,androleof
nucleasesandserineproteasesinStreptomycesdifferentiation.Analogieswith
thebiochemicalprocessesdescribedinlatestepsofeukaryoticapoptosis."J
BiolChem274(29):2036620375.
Ning,S.B.,H.L.Guo,etal.(2002)."Saltstressinducesprogrammedcelldeathin
prokaryoticorganismAnabaena."JApplMicrobiol93(1):1528.
Nishio,Y.,Y.Nakamura,etal.(2004)."Evolutionaryprocessofaminoacid
biosynthesisinCorynebacteriumatthewholegenomelevel."MolBiolEvol
21(9):16831691.
Noens,E.E.,V.Mersinias,etal.(2007)."Lossofthecontrolledlocalizationofgrowth
stagespecificcellwallsynthesispleiotropicallyaffectsdevelopmentalgene
expressioninanssgAmutantofStreptomycescoelicolor."MolMicrobiol64(5):
12441259.
Nordmann,P.andL.Poirel(2002)."EmergingcarbapenemasesinGramnegative
aerobes."ClinMicrobiolInfect8(6):321331.
Nothaft,H.,S.Rigali,etal.(2010)."ThepermeasegenenagE2isthekeytoN
acetylglucosaminesensingandutilizationinStreptomycescoelicolorandis
subjecttomultilevelcontrol."MolMicrobiol75(5):11331144.
Novella,I.S.,C.Barbes,etal.(1992)."SporulationofStreptomycesantibioticusETHZ
7451insubmergedculture."CanJMicrobiol38(8):769773.

119

Con formato: Derecha

Con formato: Sangra:


Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch
Con formato: Fuente: Negrita
Con formato: Sangra:
Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch
Con formato: Fuente: Negrita
Con formato: Fuente: Negrita
Con formato: Fuente: Negrita
Con formato: Espaol
(Espaa - alfab. internacional)
Con formato: Fuente: Negrita
Con formato: Fuente: Cursiva
Con formato: Ingls (Estados
Unidos)
Con formato: Fuente:
Negrita, Ingls (Estados
Unidos)
Con formato: Ingls (Estados
Unidos)
Con formato: Fuente: Sin
Cursiva, Subrayado
Eliminado:
Con formato: Ingls (Reino
Unido)
Con formato: Espaol
(Espaa - alfab. internacional)
Con formato: Sangra:
Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch

VI.BIBLIOGRAFA
Ogura,M.,H.Hashimoto,etal.(2002)."Med,acellsurfacelocalizedprotein
regulatingacompetencetranscriptionfactorgene,comK,inBacillussubtilis."
BiosciBiotechnolBiochem66(4):892896.
Ohnishi,Y.,J.W.Seo,etal.(2002)."DeprogrammedsporulationinStreptomyces."
FEMSMicrobiolLett216(1):17.
Ohnishi,Y.,J.Ishikawa,etal.(2008)."Genomesequenceofthestreptomycin
producingmicroorganismStreptomycesgriseusIFO13350."JBacteriol190(11):
40504060.
Ohnuki,T.,T.Imanaka,etal.(1985)."SelfcloninginStreptomycesgriseusofanstr
geneclusterforstreptomycinbiosynthesisandstreptomycinresistance."J
Bacteriol164(1):8594.
Omura,S.,H.Ikeda,etal.(2001)."Genomesequenceofanindustrialmicroorganism
Streptomycesavermitilis:deducingtheabilityofproducingsecondary
metabolites."ProcNatlAcadSciUSA98(21):1221512220.
Paget,M.S.,L.Chamberlin,etal.(1999)."Evidencethattheextracytoplasmicfunction
sigmafactorsigmaEisrequiredfornormalcellwallstructureinStreptomyces
coelicolorA3(2)."JBacteriol181(1):204211.
Pandza,K.,G.Pfalzer,etal.(1997)."Physicalmappingshowsthattheunstable
oxytetracyclinegeneclusterofStreptomycesrimosusliesclosetooneendof
thelinearchromosome."Microbiology143(Pt5):14931501.
Park,Y.,Tamura,S.,etal(1997)."Micelialpelletintrastucturevisualizationand
viabilitypredictioninacultureofStreptomycesfradiaeusingconfocalscanning
lasermicroscopy."Journaloffermentationandbioengineering84,483486.
Petrickova,K.andM.Petricek(2003)."Eukaryotictypeproteinkinasesin
Streptomycescoelicolor:variationsonacommontheme."Microbiology149(Pt
7):16091621.
Quintana,E.T.,K.Wierzbicka,etal.(2008)."Streptomycessudanensissp.nov.,anew
pathogenisolatedfrompatientswithactinomycetoma."AntonieVan
Leeuwenhoek93(3):305313.
Quiros,L.M.,C.Hardisson,etal.(1986)."IsolationandpropertiesofStreptomyces
sporemembranes."JBacteriol165(3):923928.
Redenbach,M.,H.M.Kieser,etal.(1996)."Asetoforderedcosmidsandadetailed
geneticandphysicalmapforthe8MbStreptomycescoelicolorA3(2)
chromosome."MolMicrobiol21(1):7796.
Robinson,M.,E.Lewis,etal.(1981)."OccurrenceofreiteratedDNAsequencesin
strainsofStreptomycesproducedbyaninterspecificprotoplastfusion."Mol
GenGenet182(2):336340.
Rodriguez,M.,L.E.Nunez,etal.(2008)."Identificationoftranscriptionalactivatorsfor
thienamycinandcephamycinCbiosyntheticgeneswithinthethienamycin
geneclusterfromStreptomycescattleya."MolMicrobiol69(3):633645.
RodriguezGarcia,A.,C.Barreiro,etal.(2007)."Genomewidetranscriptomicand
proteomicanalysisoftheprimaryresponsetophosphatelimitationin
StreptomycescoelicolorM145andinaDeltaphoPmutant."Proteomics7(14):
24102429.

120

Con formato: Derecha

Con formato: Espaol


(Espaa - alfab. internacional)
Con formato: Sangra:
Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch
Con formato: Sangra:
Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch
Con formato: Fuente: Cursiva
Con formato: Sangra:
Izquierda: 0 pto, Sangra
francesa: 2,95 ch, Primera
lnea: -2,95 ch
Eliminado:

VI.BIBLIOGRAFA
Rozas,D.,S.Gullon,etal.(2012)."Anoveltwocomponentsysteminvolvedinthe
transitiontosecondarymetabolisminStreptomycescoelicolor."PLoSOne7(2):
e31760.
Sarra,M.,C.Casas,etal.(1997)."Continuousproductionofahybridantibioticby
StreptomyceslividansTK21pelletsinathreephasefluidizedbedbioreactor."
BiotechnolBioeng53(6):601610.
SambrookJ,RussellDW.(2001).MolecularCloning.ALaboratoryManual.NewYork,:
ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor.
Schena,M.,D.Shalon,etal.(1995)."Quantitativemonitoringofgeneexpression
patternswithacomplementaryDNAmicroarray."Science270(5235):467470.
Schneider,N.C.(1957)."Determinationofnucleidacidsintissuesbypentose
analysis."MethEnzimol3,680689.
Schultz,D.,P.G.Wolynes,etal.(2009)."Decidingfateinadversetimes:sporulation
andcompetenceinBacillussubtilis."ProcNatlAcadSciUSA106(50):21027
21034.
Setoyama,D.,R.Ito,etal.(2011)."MolecularactionsofEscherichiacoliMutTfor
controlofspontaneousmutagenesis."MutatRes707(12):914.
Shadomy,S.andR.S.May(1981)."Nformimidoylthienamycin(MK0787):invitro
study."AntimicrobAgentsChemother19(1):201204.
Shrempf,H.(1985)."Geneticinstability:amplification,deletionandrearrangement
withinStreptomycesDNA."Microbiology.AmericanSocietyforMicrobiology.
SogaardAndersen,L.andZ.Yang(2008)."Programmedcelldeath:roleforMazFand
MrpCinMyxococcusmulticellulardevelopment."CurrBiol18(8):R337339.
Song,J.Y.,H.Jeong,etal.(2010)."DraftgenomesequenceofStreptomyces
clavuligerusNRRL3585,aproducerofdiversesecondarymetabolites."J
Bacteriol192(23):63176318.
Stocks,S.M.andC.R.Thomas(2001)."Viability,strength,andfragmentationof
Saccharopolysporaerythraeainsubmergedfermentation."BiotechnolBioeng
75(6):702709.
Sun,J.,G.H.Kelemen,etal.(1999)."Greenfluorescentproteinasareporterfor
spatialandtemporalgeneexpressioninStreptomycescoelicolorA3(2)."
Microbiology145(Pt9):22212227.
Tohyama,H.,Y.Okami,etal.(1987)."Nucleotidesequenceofthe
streptomycinphosphotransferaseandamidinotransferasegenesfrom
Streptomycesgriseus."NucleicAcidsRes15(4):18191833.
Turlo,J.,B.Gutkowska,etal.(2006)."SubmergedcultivationofStreptomyces
tsukubaensisinmediacomposedofwasteproductsoffoodindustry."ActaPol
Pharm63(5):463465.
Ueda,K.,K.Matsuda,etal.(1999)."Aputativeregulatoryelementforcarbonsource
dependentdifferentiationinStreptomycesgriseus."Microbiology145(Pt9):
22652271.
Umeyama,T.,P.C.Lee,etal.(1999)."AnAfsK/AfsRsysteminvolvedintheresponse
ofaerialmyceliumformationtoglucoseinStreptomycesgriseus."
Microbiology145(Pt9):22812292.
VechtLifshitz,S.E.,S.Magdassi,etal.(1990)."Pelletformationandcellular
aggregationinStreptomycestendae."BiotechnolBioeng35(9):890896.

121

Con formato: Derecha

VI.BIBLIOGRAFA
VechtLifshitz,S.E.,Y.Sasson,etal.(1992)."Nikkomycinproductioninpelletsof
Streptomycestendae."JApplBacteriol72(3):195200.
Verbist,L.andJ.Verhaegen(1981)."InvitroactivityofNformimidoylthienamycinin
comparisonwithcefotaxime,moxalactam,andceftazidime."Antimicrob
AgentsChemother19(3):402406.
Vida,T.A.andS.D.Emr(1995)."Anewvitalstainforvisualizingvacuolarmembrane
dynamicsandendocytosisinyeast."JCellBiol128(5):779792.
Volff,J.N.andJ.Altenbuchner(1998)."GeneticinstabilityoftheStreptomyces
chromosome."MolMicrobiol27(2):239246.
Waksman,S.A.andA.T.Henrici(1943)."TheNomenclatureandClassificationofthe
Actinomycetes."JBacteriol46(4):337341.
Wang,J.andG.S.Pettis(2010)."ThetralocusofstreptomyceteplasmidpIJ101
mediatesefficienttransferofacircularbutnotalinearversionofthesame
replicon."Microbiology156(Pt9):27232733.
Wiener,P.,S.Egan,etal.(1998)."Evidencefortransferofantibioticresistancegenes
insoilpopulationsofstreptomycetes."MolEcol7(9):12051216.
Williams,S.T.,M.Goodfellow,etal.(1983)."Aprobabilitymatrixforidentificationof
someStreptomycetes."JGenMicrobiol129(6):18151830.
Woese,D.(1987)."Bacterialevolution."MicrobiolRev.51:221271.
Yage,P.,A.Manteca,etal.(2010)."Newmethodformonitoringprogrammedcell
deathanddifferentiationinsubmergedStreptomycescultures."ApplEnviron
Microbiol76(10):34013404.
Yang,Y.K.,M.Morikawa,etal.(1996)."Maximumvirginiamycinproductionby
optimizationofcultivationconditionsinbatchculturewithautoregulator
addition."BiotechnolBioeng49(4):437444.
YunSI,YahyaAR,etal.(2001).Peptidasesaffectingrecombinantproteinproduction
byStreptomyceslividans.CanJMircobiol.Dec;47(12):113740.
Zhang,C.C.(1996)."Bacterialsignallinginvolvingeukaryotictypeproteinkinases."
MolMicrobiol20(1):915.

122

Con formato: Derecha