Objetivos:
1. Aislar cepas fngicas capaces de producir amilasas.
2. Producir extractos enzimticos con actividad amilasa.
3. Inmovilizar los extractos enzimticos conservando su actividad.
4. Determinar la actividad hidroltica del almidn en los extractos de cada cepa.
5. Evaluar el rendimiento del proceso de inmovilizacin
Introduccin:
La molcula de almidn puede ser degradada por un conjunto de enzimas que incluyen: amilasa, -amilasa, glucoamilasa y enzimas desramificadoras. Cada una de dichas enzimas posee
una actividad caracterstica, generando diferentes productos como se muestra en la figura.
Las amilasas, tanto de origen fngico como bacteriano, son producidas a gran escala para
su utilizacin en la industria alimenticia y de la produccin de combustibles. Sus usos ms
importantes incluyen:
Hidrlisis parcial del almidn para generar dextrinas utilizadas como espesantes;
Obtencin de jarabe de alta maltosa (Glu-Glu) utilizado en la fabricacin de numerosas
confituras (dulces, helados y tortas entre otros);
Obtencin de jarabes de alta glucosa utilizados en la fabricacin de cerveza, panes y
repostera, confituras y bebidas no alcohlicas;
Remocin del almidn utilizado como apresto en la industria textil;
Hidrlisis parcial del almidn en la industria panadera para la liberacin de glucosa, sustrato
de fermentacin de las levaduras para producir el leudamiento de la masa;
Hidrlisis del almidn para ser utilizado como fuente de carbono en diversas fermentaciones, entre
ellas la produccin de etanol para uso alimenticio y combustible.
Diseo Experimental
Parte I: Aislamiento y Screening de los hongos productores de amilasas
Da 1: Aislamiento
Se colocan semillas en placas de Petri sconteniendo medio de agar slido (YPD) conteniendo
5 % NaCl (para evitar el desarrollo de especies del grupo Mucorales) y 0.01 % tetraciclina (antibitico
que inhibe el crecimiento bacteriano). Se colocan 4 semillas por caja de Petri. Se incuba a 28C
durante 7 das.
Da 2: Screening de cepas productoras de amilasas
Las colonias de hongos (preferentemente las verdes sobre las negras o blancas) se repican
con un escarbadiente o ansa estril en paralelo por un lado en cajas de Petri con agar YPD y por otro
en cajas de Petri con medio slido de almidn 1 % y gar 2%. Se incuba a 28C durante 4-7 das.
Da 3: Screening de cepas productoras de amilasas (2 parte)
Las cepas productoras de enzimas hidrolticas del almidn se detectan observando el halo de
degradacin del almidn (crculo claro alrededor de la colonia). Para facilitar la deteccin, se revela la
presencia de almidn en el medio por el agregado de solucin de I2/KI (0.026 % I2 + 0.26 % KI) que se
acompleja con el polisacrido dando una coloracin azul.
2)
3)
Repetir paso 4) a los 5, 10, 20, y 40 con los tubos eppendorf respectivos (5, 10, 20 y 40).
6)
%
Almidn mg/ml
mg
1
Abs.
2
640 nm
prom.
0,1
1
25
0
0
0
A partir de estos datos se determinar la constante que vincula Abs con [Almidn]
Datos Extractos:
Abs 640nm
Cepa
#
Tipo extracto
10 20 40
mg Almidn
0
10 20 40
SOLUBLE
promedio
INMOVILIZADO
promedio