El papel potencial de Portulaca oleracea como un agente neuroprotector en

la neurotoxicidad y la apoptosis inducida por rotenona en el cerebro de

ratas

RESUMEN
Portulaca oleraceae (verdolaga), un miembro de la familia Portulacaceae, est muy extendido
como una mala hierba y ha sido clasificada como la octava planta ms comn en el mundo.
Con el fin de evaluar la verdolaga jugo acuoso a base de hierbas como agente neuroprotector,
evaluamos los efectos anti-apoptticos y antioxidantes de la verdolaga (1,5 ml / kg BWT)
sobre la rotenona (12 mg / kg bwt) inducida por la lesin cerebral en ratas. Nuestros
resultados mostraron que la verdolaga disminuy significativamente el nmero de clulas
apoptticas en el cuerpo estriado. La deteccin inmunohistoqumica del factor nuclear kappa
B (NF-JB) y el linfoma-2 (Bcl-2) de clulas B mostraron que despus del tratamiento verdolaga
hubo un aumento en las clulas teidas positivamente para Bcl-2 y una disminucin en las
clulas teidas positivamente para NF-JB indica el efecto anti-apopttica de verdolaga por su
actividad antioxidante.
La elevacin de las especies reactivas del oxgeno, sustancias reactivas al cido
tiobarbitrico, nitrito / nitrato y lactato deshidrogenasa fueron todos redujo con el tratamiento
verdolaga. Por otra parte, la PCR Resultados para iNOS y la caspasa-3 genes mostr baja
regulacin en grupos verdolaga tratada. En general, nuestro estudio pone de relieve el papel
prosupervivencia de verdolaga en el mesencfalo y el cuerpo estriado y propone su potencial
profilctico contra el desarrollo de dao cerebral y enfermedades neurodegenerativas
asociadas con el estrs oxidativo.
INTRODUCCIN
Portulaca oleracea (la verdolaga) es un alimento vegetal muy nutritivo para el consumo
humano que se ha mencionado en los textos egipcios ya en la poca de los faraones [1].
Verdolaga ofrece una rica fuente de la planta de beneficios nutricionales [2,3]. Es una de las
fuentes vegetales verdes ricas de cidos grasos omega-3 y cido a-linolnico [4]. Verdolaga
se ha utilizado como un antisptico, y como un anti-diurtico para los trastornos urinarios.
Una variedad de la investigacin ha demostrado que presenta una amplia gama de efectos
biolgicos, incluyendo un efecto relajante del msculo esqueltico [5], efectos analgsicos y
anti-inflamatorios [6], la actividad antifngica [7] y un efecto antifertilidad [8]. Verdolaga
tambin ha mostrado otros efectos beneficiosos como antidiabtico [9] y la cicatrizacin de
heridas propiedades [10].

Aumento de la produccin de ROS durante enfermedades neurodegenerativas conduce a un rpido consumo

y el agotamiento de antioxidantes endgenos eliminadores. En este contexto y en un esfuerzo para prevenir
o disminuir el dao inducido por el estrs oxidativo, los investigadores estn evaluando frmacos
potenciales para actuar como antioxidantes exgenos as como carroeros (basureros) para contrarrestar el
ataque oxidativo en estas enfermedades. Productos naturales se han utilizado para la terapia diettica para
varios milenios y algunos de ellos supuestamente presentan actividad antioxidante significativa [11].
Estudios recientes han demostrado que un nmero de productos de plantas, incluyendo polifenoles y
flavonoides y diversos extractos de plantas, ejerce una accin antioxidante [12].
Investigaciones anteriores de nuestro propio grupo ha establecido que los polifenoles y flavonoides tienen
efectos neuroprotectores significativos contra el estrs oxidativo inducido por la rotenona, en particular, a
travs de la inhibicin de la peroxidacin lipdica inducida por rotenona [13].
Este estudio es importante porque se cree que el estrs oxidativo de estar involucrados en la patognesis de
varias enfermedades, incluyendo la aterosclerosis, la diabetes mellitus, inflamatoria y enfermedades
neurodegenerativas y cncer [14,15]. El aumento de los radicales libres produce la peroxidacin lipdica,
uno de los principales causas de dao de la membrana celular que finalmente conduce a la degeneracin de
las clulas [14].

Rotenona es una neurotoxina que se ha propuesto para inducir Parkinson-como la

degeneracin a travs del estrs oxidativo [16]. Se plante la hiptesis de que la enfermedad
de Parkinson (PD) se acompaa de varias alteraciones neuroqumicas, celulares y
moleculares. Estos incluyen una mayor generacin de radicales libres que incluyen la
produccin excesiva de xido ntrico (NO); estos, a su vez, se cree que resultar en daos a
dopaminrgicas (DA), las neuronas. Hay un nmero creciente de estudios recientes sobre el
papel del NO, una molcula que se considera como un mensajero neuronal universal en el
sistema nervioso central, en la fisiopatologa de las enfermedades neurodegenerativas [16].
En Antkiewicz-Michaluk et al. estudio, el repetido, pero no aguda, la administracin de
rotenona (durante un perodo de 7 das), en una dosis de 12 mg / kg sc, fue encontrado para
aumentar fuertemente el metabolismo de la dopamina, tal como se mide por el aumento de
la concentracin de la dopamina intraneuronal metabolitos [17]. Tales cambios neuroqumicos
no implican una accin neurotxica directa, pero el cambio en el catabolismo de la dopamina
hacia la va oxidativa, genera radicales libres, que pueden conducir a la neurodegeneracin
[18].
El xido ntrico es un tipo de molcula pleiotrpica libre efmera sealizacin implicada en
diversos procesos biolgicos incluyendo funciones neuronales. La produccin de NO a partir
de L-arginina es catalizada por la dioxigenasa, la xido ntrico sintasa (NOS), el ms tarde
tiene tres isoformas: neuronales (nNOS), inducible (iNOS), y endotelial (eNOS). NO ha sido
implicado en diversos procesos tales como la vasodilatacin o regulacin vascular, la
modulacin de la nocicepcin, la funcin inmune, la neurotransmisin y el acoplamiento
excitacin-contraccin [19].

El factor nuclear kappa B (NF-kB) ha ganado cada vez ms la atencin por su papel como regulador de la
muerte celular [20] y actuar como una respuesta citoprotector al dao neuronal. Se expresa ampliamente en
el cerebro y existe tanto en inducible y una forma constitutivamente activa. NFkB se activa en las neuronas
de la sustancia negra en el cerebro PD [21] y se controla principalmente a travs de la interaccin con la
protena inhibidora I kappa B, que inhibe la unin de su ADN, impidiendo la absorcin nuclear de los
complejos de NFkB y terminando as la actividad nuclear NFkB. La fosforilacin y degradacin de I kappa
B inicia el movimiento de NFkB en el ncleo. Actividad NFkB puede, sin embargo, ser pro- o antiapopttica, dependiendo de las condiciones experimentales y protenas diana implicados [22].
Otro regulador de la apoptosis es la familia de protenas lymphoma' de clulas B - 2 (Bcl-2) ",
que tienen un papel crucial en la sealizacin apopttica intracelular y que incluyen tanto las
protenas pro-y anti-apoptticos. Los principales miembros de esta familia son Bcl-2, Bcl-XL y
Bax. Bcl-2 y Bcl-xL se localizan en la membrana externa mitocondrial, al retculo
endoplsmico y la membrana perinuclear [23].
Para conocimiento de los autores, no hay estudios similares se han realizado para dilucidar los
efectos antioxidantes y tambin los efectos anti-apoptticos de jugo acuosa verdolaga en la
neurotoxicidad inducida por rotenona y la apoptosis en las clulas neuronales. Por lo tanto, el
propsito del estudio fue evaluar cmo verdolaga jugo acuosa protege el cerebro de las ratas
de la neurotoxicidad y la apoptosis inducida por rotenona.

2. Materiales y mtodos
2.1. Preparacin del jugo de la planta
Hierbas frescas verdolaga, libres de manchas o defectos evidentes, se recogieron desde el Delta del Nilo,
Egipto, durante agosto de 2010. Un jugo acuosa de las hierbas verdolaga fue elaborado por maceracin en
una proporcin de 1: 5 (w / v) y esto fue luego conservado por cerca de 24 horas en el refrigerador. Despus
de la maceracin y la infusin, el extracto crudo resultante se filtr y el filtrado se mantuvo a -20 C para
uso futuro.
2.2. Productos qumicos y reactivos
Rotenona, nitro azul tetrazolio, N- (1-naftil) etilendiamina y Tris-HCl se adquirieron de Sigma
(St. Louis, MO, EE.UU.). cido perclrico, cido tiobarbitrico (TBA) y cido tricloroactico
(TCA) se adquirieron de Merck. Trizol se adquiri de Life Technologies Corporation (California,
EE.UU.). Todos los dems productos qumicos y reactivos utilizados en este estudio fueron de

grado analtico. Agua bidestilada se utiliz como disolvente. Adems, lactato deshidrogenasa
(LDH), se utilizaron (DiaSys Diagnostic Systems, GmbH, Alemania) kits comerciales.

2.3. Los animales experimentales

Macho adultas Wistar ratas albinas que pesan 120-150 g se obtuvieron de la Compaa Holding de
Productos Biolgicos y Vacunas (Vacsera, El Cairo, Egipto). Despus de un perodo de aclimatacin de 1
semana, los animales se dividieron en seis grupos (12 ratas por grupo) y se alojaron en jaulas de alambre
toc fondo en una habitacin en condiciones estndar de iluminacin con un ciclo de luz-oscuridad de 12 h a
25 1? C. Se les proporcion agua y una equilibrada dieta ad libitum. Todos los animales recibieron
atencin en el cumplimiento de las normas egipcias para la proteccin de los animales.
2.4. Protocolo experimental
Animales dentro de los diferentes grupos de tratamiento se mantuvieron en sus respectivas
dietas durante 12-24 das de la siguiente manera: Grupo A, control sin tratar (Con); grupo B
(Pur), se trat por va oral con jugo de la verdolaga (1,5 ml / kg bwt); grupo C (Rot), se trat
por va oral con rotenona en dosis de 12 mg / kg bwt durante 12 das; grupo D (Rot-Pur), se
trat por va oral con rotenona (12 mg / kg BWT) durante 12 das antes de zumo de verdolaga
(1,5 ml / kg BWT) durante otros 12 das; grupo E (Pur-Rot), se trat por va oral con el jugo de
la verdolaga (1,5 ml / kg BWT) durante 12 das antes de la rotenona (12 mg / kg BWT) durante
otros 12 das y el grupo H (Rot + PUR) tratados por va oral con el zumo de verdolaga (1,5 ml /
kg BWT) ms rotenona (12 mg / kg BWT) durante 12 das.

El nivel de la dosis administrada por va oral de zumo de verdolaga (1,5 ml / kg bwt) se bas en el trabajo de
Dkhil et al. [24] y datos no publicados que demuestra el alto contenido de polifenoles y compuestos
flavonoides, en este jugo, as como sus propiedades antioxidantes. La dosis rotenona administrado por va
oral, por su parte (12 mg / kg BWT) sigue la dosis reportada por Antkiewicz- Michaluk et al. [17] como la
produccin de anomalas en el comportamiento general de ratas, tales como la bradicinesia y la alteracin de
la marcha.
Al final de los experimentos se decapitaron los animales de cada uno de los grupos. Los
cerebros de las ratas se retiraron cuidadosamente y diseccin de los cerebros se realiz en
una placa de vidrio enfriada con hielo para la separacin de las regiones del cerebro medio y
el cuerpo estriado de acuerdo con el mtodo descrito por Glowinski et al. [25]. El cerebro
medio y el cuerpo estriado de los primeros seis ratas en cada grupo se pesaron y se
homogeneizaron inmediatamente para dar un 50% (w / v) de homogeneizado en un medio
enfriado con hielo que contiene 50 mM Tris-HCl y sacarosa 300 mM. El homogeneizado se
centrifug a 3000 rpm durante 10 min a 4? C. El sobrenadante (10%) se utiliz para las
diversas determinaciones bioqumicas.
2.5. La cuantificacin de especies de oxgeno reactivas
Una versin modificada de un ensayo descrito previamente para la conversin intracelular de
nitro azul tetrazolio (NBT) a formazn por el anin superxido se utiliz para medir la
generacin de especies reactivas de oxgeno [26]. Brevemente, LL NBT (1,0 mg / ml) se
aadi 200 para el mesencfalo y el cuerpo estriado homogeneizados de cada uno de los
grupos, seguido de incubacin adicional durante 1 hora a 37 C. Las soluciones se trataron
entonces con 100 KOH ll (2 M). NBT reducido / g de tejido expresado en lmol se determin
mediante espectrofotometra. Si los compuestos de barrido de radical estaban presentes en el
tejido, se formara menos azul formazn, disminuyendo as la absorcin a 570 nm.
2.6. Determinacin de sustancias reactivas al cido tiobarbitrico
Sustancias reactivas al cido tiobarbitrico (TBARS) se ensayaron ensayos colorimtricos
mnimas de los homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado de acuerdo con el
mtodo de Ohkawa et al. [27]. En este mtodo, TBARS determinan usando 1 ml de cido
tricloroactico al 10% y 1 ml de cido tiobarbitrico 0,67% que despus se calentaron juntos
en un bao de agua hirviendo durante 30 min. TBARS A continuacin se determinaron por la
absorbancia a 535 nm y se expresaron como TBARS formado.
2.7. Determinacin de nitrito / nitrato
El ensayo de nitrito / nitrato, como una medida indirecta de la produccin de NO, el contenido

en homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado se realiz de acuerdo con el

mtodo de Berkels et al. [28]. En un medio cido y en presencia de nitrito de la sulfanilamida
diazotise cido nitroso formado se acopl con N- (1-naftil) etilendiamina. El azo-colorante
resultante tena un color prpura rojizo brillante que podra ser medido a travs de
espectrofotometra a 540 nm.

2.8. Ensayo de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa

La lactato deshidrogenasa se determin mediante espectrofotometra siguiendo la disminucin de NADH a
340 nm de acuerdo, a Bergmeyer [29], y se expres como U / g de protena, donde la protena en los
homogeneizados de cerebro medio y el cuerpo estriado se determinaron de acuerdo con Lowry et al. [30].
2.9. Anlisis RT-PCR
El ARN total se extrajo a partir de muestras congeladas cuerpo estriado siguientes el mtodo
reactivo Trizol [31]. El ARN extrado se disolvi en agua tratada con pirocarbonato de dietilo
(DEPC-agua) y se almacen a -70 C. 5 lg de RNA se utiliz como una plantilla para la
produccin de cDNA a travs de la incubacin con RevertAid H Minus transcriptasa inversa
(Fermentas, Thermo Fisher Scientific Inc, Canad) durante 1 hora a 45 C, en 10 mM
hexmeros aleatorios, 0,375 mM por dNTP, mM MgCl2 3, KCl 75 mM, Tris-HCl 50, pH 8,3,
ditiotreitol 10 mM, y 40 unidades de inhibidor de RNasa, seguido por 5 min a 70 C para
inactivar la enzima. Las muestras se incubaron a continuacin durante 30 min a 37 C con
0,1 mg / ml de RNasa. La amplificacin por PCR se realiz en presencia de 2 mM de MgCl2,
0,05 lM de cada cebador (Metabion International, Martinsried, Deutschland), dNTPs 0,2 mM, 2
U de Taq ADN polimerasa (GoTaq DNA Polimerasa, Promega Corporation) y 4 ll de producto
de RT, en un volumen final de 50 ll.
Se llev a cabo la amplificacin simultnea del invariante gen constitutivo GAPDH. Las
secuencias de los cebadores fueron como sigue:
iNOS (S): 50-GAAAGAACTCGGGCATACCT-30.
iNOS (AS): 50-GGCGAAGAACAATCCACAAC-30.
Caspasa-3 (S): 50-TTCAGAGGGGATCGTTGTAGAAGTC-30.
Caspasa-3 (AS): 50-CAAGCTTGTCGGCATACTGTTTCAG-30.
GAPDH (S): 50-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-30.
GAPDH (AS): 50-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-30.
Las Condiciones de PCR Para La iNOS were 35 ciclos de desnaturalizacin a 95 C Durante 60
s, hibridacin un C Durante 63 60 s, y la extensin A C Durante 72 60 s. La del que de
Mientras Condicin prr la caspasa-3 FUE de 30 ciclos de desnaturalizacin a 95 C de
Durante 60 s, hibridacin un C Durante 58 60 s, y la extensin A C Durante 72 60 s.
Condiciones de PCR were GAPDH prrafo 25 ciclos de desnaturalizacin a 95 C Durante 45 s,
hibridacin a 60 C Durante 45 s, y la extensin A C Durante 72 45 s. Tras el ciclo Ultimo,
extensin Una ltima se Realizo un 72 C Durante 10 min Para Todos los Anlisis de PCR. Los
Productos de PCR se visualizaron en gel de agarosa de la ONU al 2% con tincin con bromuro
de etidio. La Expresin de Todas las Enzimas analizadas se normaliz a la Expresin de GAPDH
prr Cada Muestra y s comparativamente el USO de gel de software Pro Analyser.
2.10. Histopatologa y NF-kB y Bcl-2 inmunohistoqumica
Pequeos trozos de cerebro medio y el cuerpo estriado se retiraron rpidamente, luego fij en
formalina tamponada neutra. Despus de la fijacin, las muestras se deshidrataron,
incrustado en cera, y luego se seccionaron a 5 l espesor. Para los exmenes histolgicos, las
secciones fueron teidas con hematoxilina y eosina. Tcnicas de inmunolocalizacin para NFkB y Bcl-2 se realizaron en 3-4 secciones de espesor lm segn Pedrycz y Czerny [32]. Para los
controles negativos, el anticuerpo primario se omiti. En resumen, ratn anti-NF-JB o el ratn
anti-Bcl-2 (diluted1: 200, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), se incubaron con
las secciones durante 60 minutos. Los anticuerpos primarios se diluyeron en TBS (solucin
salina tamponada con Tris) / 1% de BSA (albmina de suero bovino). A continuacin, un
anticuerpo secundario biotinilado dirigido contra inmunoglobulina de ratn (kit biotinilado
Enlace Universal-DakoCytomation, suministrado listo para usar) se aadi y se incub durante

15 min, seguido de peroxidasa de rbano picante conjugada con estreptavidina (kit

DakoCytomation, suministra listo para usar) para una mayor 15 min de incubacin. En los
sitios de inmunolocalizacin de los anticuerpos primarios, un color rojizo a marrn apareci
despus de la adicin de 3-amino-9-ethylcarbasole (AEC) (DakoCytomationkit, suministra listo
para usar) durante 15 min. Los especmenes se contratieron con hematoxilina durante 1 min
y se montaron usando el fluido Aquatex (Merck KGaA, Alemania). El porcentaje de neuronas
positivas se determin usando un sistema de anlisis de imagen. El nmero de clulas
positivas se obtuvo usando cinco categoras: <5%, negativo (categora 1); 05.25% (categora
2); 25-50% (categora 3); 50-75% (categora 4); 75-100% (categora 5). A continuacin, la
intensidad de la tincin fue de grado muy semana, semana, medio u oscuro. Todas las
secciones se incubaron en las mismas condiciones con la misma concentracin de
anticuerpos y, al mismo tiempo; por lo que la inmunotincin fue comparable entre los
diferentes grupos experimentales.

2.11. Los estudios ultraestructurales (microscopa electrnica de transmisin)

Pequeos trozos de tejido estriado (aproximadamente 2.1 mm de espesor) se fijaron inmediatamente en
helado 0,5% fijador de glutaraldehdo. Los tejidos se lavaron a continuacin en un tampn fosfato (0,1 M,
pH 7,4) y post-fijo durante 2 h en 1% de tetrxido de osmio en el mismo tampn a 4 C. Las muestras se
lavaron a continuacin en tampn fosfato, se deshidrataron con acetona graduada y luego incrustado en
Araldite CY 212 para hacer bloques de tejido. Tanto la cortes semifinos y los cortes ultrafinos (80-100 nm)
se cortaron utilizando un ultramicrtomo. Las secciones se tieron con acetato de uranilo y acetato de plomo
y se examinaron con un microscopio electrnico de transmisin (JEOL, Tokio, Japn) operado a 60 kV. Al
menos tres cerebros de cada grupo fueron examinados para cambios ultraestructurales.
2.12. El anlisis estadstico
Los resultados se expresaron como la media error estndar de la media (SEM). Los datos
para comparaciones mltiples variables se analizaron mediante anlisis unidireccional de la
varianza (ANOVA). Para la comparacin de importancia entre los grupos, se utiliz la prueba
de Duncan como una prueba post hoc de acuerdo con el programa de paquete estadstico
(SPSS versin 17.0).

3. Resultados
La administracin de la rotenona durante 12 das indujo una marcada prdida de la actividad del complejo I.
El peso corporal y la apariencia general de los animales se deterioraron hasta la muerte. La administracin
de la verdolaga, sin embargo, disminuy significativamente estas manifestaciones (datos suplementarios;
Fig. 1).
3.1. Resultados de estrs oxidativo
Rotenona significativamente (p <0,05) indujo la produccin in vivo de radicales libres de
oxgeno en los tejidos neuronales de ratas como se indica mediante el ensayo NBT (Fig. 1).
Cuando las ratas fueron tratadas con zumo de verdolaga por su cuenta, sin embargo, los
tejidos neurales fueron capaces de inhibir la reduccin de NBT. Sin embargo, el tratamiento
verdolaga despus, antes o simultneamente con rotenona no logr disminuir la reduccin de
NBT en los tejidos del cerebro medio, en comparacin con las ratas control. Adems, el
tratamiento verdolaga ya sea entregado despus o simultneamente con rotenona, redujo
significativamente la reduccin de NBT en el tejido estriatal, en comparacin con el grupo
control. La administracin de la verdolaga antes de la rotenona, sin embargo, no logr
disminuir la reduccin de NBT en el striata de ratas en comparacin con el grupo control.

Fig. 1.Reactive oxygen species (ROS) levels in midbrain and striatal brain
homogenates of male rats treated with rotenone and purslane. Con: Untreated
control; Pur: Group B treated with purslane juice; Rot: Group C treated with
rotenone;RotPur: Group D treated with rotenone prior to purslane juice; Pur
Rot: Group E treated with purslane juice prior to rotenone and Rot + Pur: Group H
treated with purslane juice plus rotenone. a, significant change at p< 0.05 with
respect to Congroup as a negative control group; b, significant change atp < 0.05
with respect to Rot group as a positive control group.

Fig. 2 resume el papel potencial de la verdolaga de TBARS en homogeneizados de tejidos neuronales.

Verdolaga fue capaz de reducir el aumento de TBARS que haba sido inducida a travs de la administracin
de la rotenona. Se observaron los efectos protectores mximos de verdolaga verdolaga cuando se coadministra con rotenona. En este caso, el nivel de TBARS inducida por la administracin rotenona se redujo
significativamente a p <0,05, tanto en el cerebro medio y el cuerpo estriado homogeneizados, en
comparacin con los de las ratas de control.
Los efectos de la rotenona y la verdolaga en los contenidos de nitrito / nitrato, tanto en el
cerebro medio y el cuerpo estriado homogeneizados se presentan en la Fig. 3. Administracin
verdolaga durante 12 das no parece causar ningn cambio significativo en el nitrito / nitrato
contenido en los tejidos del cerebro. Sin embargo, la administracin rotenona caus un
aumento significativo en el contenido de nitrito / nitrato en los homogeneizados de cerebro
medio y el cuerpo estriado (p <0,05). Pre- y post-co-tratamiento de la verdolaga en ratas
administradas con rotenona suprimieron la produccin de nitrito / nitrato en homogeneizados
de cerebro medio, pero los niveles de nitrito / nitrato todava eran significativamente ms
altos que los del grupo de control. Por otra parte, se observ el efecto protector mximo de la

verdolaga en los homogeneizados de tejido estriado cuando verdolaga se co-administra con

rotenona. En este caso, el nivel de nitrito / nitrato se redujo significativamente a p <0,05 en
comparacin con las ratas de control.
Con base en los resultados mostrados en la Fig. 5, se examin si la verdolaga podra ejercer
un efecto neuroprotector despus del tratamiento post, pre-tratamiento para el cotratamiento. Administracin verdolaga caus reduccin significativa de la LDH (p <0,05) con
la mxima proteccin que se ofrece en el grupo de tratamiento concurrente, enfatizando as
el efecto neuroprotector de la verdolaga.
3.2. Histopatologa y NF-kB inmunohistoqumica resultados estudio histopatolgico de las
muestras mostraron que la rotenona caus la degeneracin en el cerebro medio y el cuerpo
estriado se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy (Fig. 6C). Sin embargo, la
verdolaga pre-, post- y co-administracin mostr un nivel sorprendente de proteccin, sin
signos de los efectos adversos del tratamiento rotenona en las secciones del cerebro medio y
el cuerpo estriado de las ratas (Fig. 6d, e y h, respectivamente).

La ultraestructura de las neuronas de las ratas de control y tratadas verdolaga fue normal en apariencia
(datos suplementarios; Fig. 3a y b, respectivamente). En el grupo de la rotenona, el anlisis ultraestructural
demostr que la rotenona indujo una morfologa nuclear apopttica similar caracterizado por una cromatina
se condensa parcialmente marginados por la envoltura nuclear. Sin embargo, pre, post-y co-tratamiento de
los animales con el jugo de la verdolaga se asoci con proteccin estructural de las neuronas de estos
cambios ultraestructurales inducidas rotenona-(datos suplementario; Fig. 3d, E y H, respectivamente). Se
concluye, por tanto, que el jugo de la verdolaga alivi la degeneracin inducida por rotenona de las neuronas
en el cuerpo estriado de ratas.
Investigacin inmunohistoqumica para NF-kB y Bcl-2 mostr que haba algo de
inmunoreactividad en las neuronas del cerebro medio y el cuerpo estriado en el grupo de
control tanto para NF-JB y Bcl-2, lo que indica el ciclo de vida normal de las clulas (. Figs 7a y
8a, respectivamente). En el grupo de verdolaga, el nmero de NF-JB neuronas inmunotincin
positiva se disminuy, mientras que se aument el nmero de Bcl-2 neuronas positivas que
muestra la actividad anti-apopttica de zumo de verdolaga (Fig. 7b y 8b, respectivamente). La
actividad inmunotincin para NF-JB se aument en el grupo de rotenona, con menos actividad
para Bcl-2 en comparacin con el grupo control, lo que indica el efecto apopttico de la
rotenona, tanto en el cerebro medio y el cuerpo estriado (Fig. 7c y 8c, respectivamente). El
efecto beneficioso de la verdolaga se demostr cuando las ratas fueron co-tratados con la
verdolaga durante la administracin rotenona.
En este caso, los nmeros de NF-kB neuronas inmunotincin se redujeron, mientras que hubo
un aumento paralelo en el nmero de Bcl-2 neuronas de tincin positiva (datos
suplementarios; Tabla 1). Tambin se muestran Estos efectos de la verdolaga cuando se
administr ya sea antes o despus del tratamiento rotenona.
Adems, el anlisis RT-PCR sobre la apoptosis de codificacin seleccionado (caspasa-3) genes
mostr que el tratamiento verdolaga reduce los efectos de dao celular neuronal mediada por
rotenona (Fig 4 y datos suplementarios;. Fig. 2). El efecto protector mximo de verdolaga
contra la apoptosis inducida por rotenona se muestra cuando la verdolaga se administr ya
sea despus o simultneamente con el tratamiento rotenona, mientras que el gen de la
caspasa-3 era todava hasta reguladas cuando verdolaga se administr antes de la rotenona.

4. Discusin
Actualmente se cree que PD es causada no slo por la gentica, sino tambin, en gran medida, por factores
ambientales, entre los que los pesticidas pueden desempear un importante, aunque no exclusiva, papel [17].
Uno de los plaguicidas que pueden estar implicados en el desarrollo de la enfermedad de Parkinson es la
rotenona [18]. Dos lneas de razonamiento apoyan el papel de la rotenona. En primer lugar, tanto en la EP
hereditaria y espontnea, la actividad del complejo I mitocondrial est disminuida [33] y rotenona es un
potente inhibidor, soluble en lpidos de este complejo [34]. En segundo lugar, el dao oxidativo est
fuertemente implicado en la neurodegeneracin de neuronas DA en la DP [35], y como se muestra por

Antkiewicz- Michaluk et al. [17] con anterioridad y en el presente documento, la rotenona produce
potentemente el estrs oxidativo.
Rotenona es txico para las ratas cuando se aplica en dosis de 12 mg / kg bwt repetidamente
durante 12 das, causando la mortalidad considerable. Esas ratas que sobrevivieron mediante
tratamiento verdolaga mostraron anomalas claras en el comportamiento general y la prdida
de la ganancia de peso corporal.
En nuestro estudio, el nivel celular de la produccin de ROS debido a la rotenona se midi por
NBT, con los resultados que confirma que la produccin de ROS es inducida por rotenona. La
induccin de la produccin de ROS mitocondrial por rotenona con frecuencia se ha atribuido a
la capacidad de la rotenona para bloquear respiratoria mitocondrial complejo de la cadena I,
aumentando de este modo la formacin de ubisemiquinona, el donante de electrones primaria
en la generacin de superxido mitocondrial [36].

Bloques rotenona flujo de electrones a travs del complejo de la cadena respiratoria I, seguido de la mejora
de la formacin O- 2 [37]. Esto parece ser el principal mecanismo de la formacin inducida por rotenona de
O- 2, que puede evolucionar rpidamente a H2O2.
La elevacin de ROS es una indicacin de la tensin oxidativa y por rotenona inducida por citotoxicidad,
que tambin se refleja en el aumento de LDH en los homogeneizados en nuestro estudio. Nuestros
resultados muestran, sin embargo, que la produccin de ROS se redujo significativamente por la
administracin de la verdolaga en especial despus del tratamiento y co-tratamiento. Una posible
explicacin es que en el nivel celular, el efecto antioxidante de la verdolaga puede tener un impacto en los
niveles de ROS inducida por rotenona al eliminar los radicales libres de oxgeno [24].
La hiptesis de que la generacin de radicales de oxgeno y el estrs oxidativo pueden
desempear un papel importante en la patognesis de la PD se basa en dos factores. En
primer lugar, el potencial para el metabolismo oxidativo de la dopamina para producir
especies reactivas de oxgeno y, en segundo lugar, en el hecho de que el deterioro de la
funcin mitocondrial, que ha sido descrito en la EP, tambin puede dar lugar a aumento de la
formacin de especies de oxgeno reactivas que conducen a la peroxidacin de lpidos
excesiva , al dao oxidativo del ADN mitocondrial y de all a la apoptosis neuronal [38].
Estudios anteriores han demostrado que una dosis baja de rotenona (1,5 mg / kg)
administrado durante 30 das aumentan el contenido de cido tiobarbitrico en diferentes
reas del cerebro de ratas [12,16].
Nuestros resultados confirman que el tratamiento rotenona (12 mg / kg bwt) aument
significativamente los niveles de TBARS cerebrales, lo que sugiere que el aumento de la
peroxidacin lipdica podra estar asociado con el dao celular. En contraste con la
administracin rotenona, co-administracin y post-tratamiento de las ratas con verdolaga
revertido la peroxidacin de lpidos a aproximadamente los valores de control. De nuevo, esto
indica el efecto protector de la verdolaga en purgar los radicales libres.
Este efecto antioxidante de la verdolaga puede ser un resultado de su relativamente rico
contenido de vitaminas antioxidantes conocidos. La verdolaga es conocida por ser rica en
vitaminas C y E. Las vitaminas C y E son buenos antioxidantes capaces de prevenir la
peroxidacin de lpidos en plasma y tejidos [39], as como la proteccin de membranas,
orgnulos y protenas contra el dao oxidativo.
Los resultados del presente estudio indican que la rotenona a la dosis de 12 mg / kg bwt
aumenta la generacin de NO en el cerebro de las ratas. Esta elevacin en la produccin de
NO puede inhibir enzimas clave del metabolismo de energa, dao de ADN, agotar glutatin
intracelular y reaccionar con el superxido para formar la mucho ms potente oxidante
peroxinitrito (ONOO-) [16]. El peroxinitrito es un elemento clave en la resolucin de los roles
contrastantes de NO en la fisiologa y la patologa.

La generacin de peroxinitrito durante largos perodos de tiempo dar lugar a la oxidacin

sustancial y potencial destruccin de los componentes celulares del husped, que conduce a
la disfuncin de los procesos celulares crticos, la interrupcin de vas de sealizacin celular,
y la induccin de la muerte celular a travs de tanto la apoptosis y necrosis [40 ].
Tanto nNOS e iNOS se han implicado en DA muerte neuronal inducida por 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) [41]. Estos estudios han demostrado que el bloqueo o
deficiencia de nNOS o iNOS protegido neuronas DA en la sustancia negra contra la toxicidad
del MPTP. El presente estudio ha demostrado que la rotenona aumenta selectivamente la
expresin de iNOS en el cuerpo estriado.
Esto confirm la participacin de xido ntrico mediada por NOS en la neurotoxicidad inducida
por rotenona de la va nigroestriatal. Nuestros resultados tambin son consistentes con
estudios previos que han demostrado que la expresin de iNOS podra ser inducida por la
exposicin neurotoxina [42,43]. Curiosamente, el jugo de la verdolaga reduce la expresin de
iNOS y nNOS despus del tratamiento rotenona. Como muchos extractos de plantas
complejas, zumo de verdolaga contiene un nmero de compuestos biolgicamente activos,
uno de los cuales es el cido graso omega-3. Este es un compuesto altamente lipoflico que
entra fcilmente en el cerebro desde el plasma [44].
Una de sus principales efectos beneficiosos sobre el sistema nervioso central es su capacidad
para regular a la baja de NF-kB, que es en s mismo un regulador de un nmero de productos
gnicos control de la inflamacin uno de los cuales es la iNOS. Esto puede explicar la baja
regulacin de este gen en todos los grupos de verdolaga tratados [45].

Dado el papel reportado para NF-kB en el dao neuronal inducida por diversos estmulos, que tambin
investig la ocurrencia de muerte celular por apoptosis en respuesta a la lesin inducida por el cerebro
medio rotenona. Resultados inmunohistoqumicos demostraron que el mesencfalo de ratas administradas
con rotenona aument el nivel de protena NF-kB (Fig. 7).
Hemos demostrado aqu, por lo tanto, que la neuroproteccin a travs de la verdolaga est
asociada con la translocacin nuclear reducida del factor de transcripcin NF-kB. Los efectos
neuroprotectores de la verdolaga previamente se han atribuido a alteraciones de la
sealizacin intracelular, incluyendo a travs de la ruta de NF-kB. El bloqueo farmacolgico de
NF-kB podra ofrecer as una estrategia neuroprotectora interesante contra el estrs oxidativo
[46].
Otro hallazgo es el aumento en el nmero de neuronas positivas teidas con Bcl-2. Esto es
consistente con los resultados de Mukherjee et al. [47], quienes encontraron que
neuroprotectina D1, que es un metabolito de cido docosahexaenoico (DHA), ejerce
propiedades anti apoptticas prominentes por hasta la regulacin de las protenas antiapoptticas Bcl-2 y Bcl-XL y la disminucin de proapopttica Bax y Bad expresin. Estos
resultados estn soportados adicionalmente por los resultados de Shina et al. [48] que
sugiere que los actos de omega-3 directamente a nivel mitocondrial de la apoptosis mediante
la restauracin del equilibrio anti-apoptticos de las protenas Bcl-2 la familia.
Se cree que la caspasa-3 para ser el ejecutor final del dao en el ADN de apoptosis, como un
marcador de apoptosis y los estudios han asociado la muerte neuronal en la EP se ha
asociado con la activacin de la caspasa-3. Rotenona Tambin se ha demostrado que causa
acciones apoptticos de las neuronas DA travs de la activacin de las proteasas caspasa-3como en modelos experimentales. Caspasa-3 escinde ICAD (inhibidor de caspasa activado
DNasa), que conduce a la degradacin del ADN y la fragmentacin. Rotenona toxicidad
mediada en el cuerpo estriado exhibe los cambios morfolgicos de la apoptosis y aumenta las
actividades de la caspasa-3 [49].
Nuestros resultados muestran que no hay regulacin por disminucin en la expresin del gen
de la caspasa-3 en los grupos tratados verdolaga y esto se puede atribuir a una mayor
expresin de Bcl-2. Nuestros resultados, por lo tanto, son coherentes con los resultados
obtenidos por Andersen [50], que encontraron que la sobre expresin de la protena antiapopttica Bcl-2 impidi la muerte celular mediada por 6-hidroxidopamina (6-OHDA).

Inhibicin de la caspasa, por lo tanto, podra proteger a las neuronas DA contra la

degeneracin inducida por rotenona.
Un hallazgo interesante de nuestro estudio, por lo tanto, es la disminucin de la apoptosis
despus de la administracin de la verdolaga (ya sea pre-, poste o co-tratamiento). Este
resultado es similar a los resultados obtenidos por Shina et al. [48], quienes encontraron que,
en la dieta de omega-3 suplementacin de ratas embarazadas impidi la apoptosis inducida
por hipotiroidismo en el cerebelo de rata en desarrollo. Esto puede explicarse por el efecto
anti-apopttico de omega-3 mediada a travs de la activacin de seales pro-supervivencia y
la supresin de estrs celular. Omega-3 es muy abundante en las membranas neuronales,
evita que los elementos de la apoptosis y la influencia especfica de la supervivencia de
sealizacin, tales como fosfoinositol 3-quinasa (PI3K), protena activada MEK / ERK, p38quinasa mitgeno (MAPK), JNK y Bcl-2 vas [51] en condiciones neuropatolgicos.
En conclusin, se inform de que P. oleracea inhibi significativamente el estrs oxidativo
inducido por rotenona y la apoptosis. Los datos actuales apoyan fuertemente la nocin de que
P. oleracea con su potente mezcla de compuestos antioxidantes podra ser muy til en el
tratamiento de trastornos neurodegenerativos en los que est implicada la produccin de
ROS. Nuestros resultados tambin implican que la ingesta diettica de alimentos de origen
vegetal ricos en antioxidantes puede ser til en la prevencin de tales enfermedades
inhibiendo la liberacin de NF-kB.

References
[1] A.I. Mohamed, A.S. Hussein, Chemical composition of purslane (Portulaca
oleracea), Plant Foods Hum. Nutr. 45 (1994) 19.
[2] D. Sudhakar, R. Krishna Kishore, P.R. Parthasarathy, Portulaca oleracea L. extract
ameliorates the cisplatin-induced toxicity in chick embryonic liver, Indian J.
Biochem. Biophys. 47 (2010) 185189.
[3] I. Oliveira, P. Valento, R. Lopes, P.B. Andrade, A. Bento, J.A. Pereira,
Phytochemical characterization and radical scavenging activity of Portulaca
oleraceae L. leaves and stems, Microchem. J. 92 (2009) 129134.
[4] A.P. Simopoulos, Omega-3 fatty acids and antioxidants in edible wild plants,
Biol. Res. 37 (2004) 263277.
[5] O. Parry, J.A. Marks, F.K. Okwuasaba, The skeletal muscle relaxant action of
Portulaca oleracea: role of potassium ions, J. Ethnopharmacol. 40 (1993) 187
194.
[6] K. Chan, M.W. Islam, M. Kamil, R. Radhakrishnan, M.N. Zakaria, M. Habibullah,
A. Attas, The analgesic and anti-inflammatory effects of Portulaca oleracea L.
subsp. Sativa (Haw.) Celak, J. Ethnopharmacol. 73 (2000) 445451.
[7] K.B. Oh, I.M. Chang, K.J. Hwang, W. Mar, Detection of antifungal activity in
Portulaca oleracea by a single-cell bioassay system, Phytother. Res. 14 (2000)
329332.
[8] O.P. Verma, S. Kumar, S.N. Chatterjee, Antifertility effects of common edible
Portulaca oleracea on the reproductive organs of male albino mice, Indian J.
Med. Res. 75 (1982) 301310.
[9] F. Gong, F. Li, L. Zhang, J. Li, Z. Zhang, G. Wang, Hypoglycemic effects of crude
polysaccharide from purslane, Int. J. Mol. Sci. 10 (2009) 880888.