DIVISIN DE BIOTECNOLOGA

HPLC (High Performance Liquid

Chromatography).
Anlisis instrumental
Profesora:
M. en C. Fanny Sandoval Rodrguez.
Alumno:

CONTENIDO

II

Introduccin. ............................................................................................................................... 3

III

El proceso cromatogrfico. ........................................................................................................ 4

3.2

Clasificacin de la cromatografa liquida. ........................................................................... 4

3.2.1

Cromatografa de reparto/adsorcin (fases ligadas

qumicamente)...................... 5

3.2.2

Cromatografa de intercambio inico. ........................................................................ 5

3.2.3

Cromatografa de exclusin molecular. ...................................................................... 5

IV

Cromatografa de fase normal .................................................................................................... 5

Cromatografa de fase reversa (inversa): .................................................................................... 5

VI

INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS ...................................................... 6

6.1

Recipientes para la fase mvil y sistema para el tratamiento de los disolventes............... 6

6.2

Bombas. ............................................................................................................................... 7

6.2.1
6.3

Tipos de bombas. ........................................................................................................ 8

Sistema de mezcla de fase mvil......................................................................................... 9

6.3.1

Mezclado de alta presin. ........................................................................................... 9

6.3.2

Mezclado de baja presin. ........................................................................................ 10

6.4

Sistemas de inyeccin de muestra. ................................................................................... 10

6.4.1

Inyector de jeringa. ................................................................................................... 11

6.4.2

Inyector de vlvula. ................................................................................................... 12

6.5

Columnas para cromatografa de lquidos. ....................................................................... 13

5.5.1.

Precolumnas. ............................................................................................................. 13

6.5.2

Tipos de rellenos de la columna. ............................................................................... 14

6.6

Detectores. ........................................................................................................................ 15

6.6.2

Detectores de absorbancia. ...................................................................................... 15

6.6.3

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. .................................................. 15

6.6.4

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores. .............................. 16

6.6.5

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. ............................................................. 16

6.6.6

Detectores de fluorescencia...................................................................................... 16

6.6.7

Detectores de ndice de refraccin. .......................................................................... 17

6.7

Cromatografa de adsorcin. ............................................................................................. 17

6.7.2
6.8

Cromatografa inica. ........................................................................................................ 18

6.8.2
6.9

VII

II

Aplicaciones de la cromatografa de adsorcin. ....................................................... 17

Rellenos de intercambio inico. ................................................................................ 19

Cromatografa de reparto. ................................................................................................ 19

6.9.2

Columnas para cromatografa con fases unidas qumicamente. .............................. 20

6.9.3

Empaquetamiento en fase normal y fase reversa. ................................................... 20

6.9.4

Establecimiento del mtodo en cromatografa de reparto. ..................................... 21

6.9.5

Seleccin de la columna en las separaciones cromatogrficas de reparto............... 21

Referencias. ........................................................................................................................... 21

INTRODUCCIN.

Las primeras separaciones, con resultados positivos, por medio de mtodos

cromatgrafos fueron llevadas a cabo por Tswett en el ao 1906; este botnico ruso
consigui separar algunos pigmentos coloreados de hojas de plantas utilizando una
columna.
El desarrollo total de estas tcnicas se produjo, no obstante, a partir del ao 1931,
en que Kuhn y Lederer comenzaron a utilizarlas de manera sistemtica. La
cromatografa de lquidos (CL) sufri un relativo estancamiento a partir del ao 1952
en que Martin y James impulsaron el desarrollo de la cromatografa de gases (CG),
que acaparo los esfuerzos tericos encaminados al conocimiento profundo de la
cromatografa. No obstante, las limitaciones de la CG en cuanto al tipo de muestras
analizables (voltiles o derivados voltiles de las mismas). Origino, en la segunda
dcada de los sesenta, una vuelta a considerar la CL cuyas limitaciones, en este
sentido, se reduce a la posibilidad de disolver la muestra, lo que le confiere un rango
mucho ms rpido mucho ms amplio de aplicaciones. Este hecho, junto con la
aparicin de fases estacionarias con dimetros de partcula mucho menores que los
utilizados hasta entonces (3 a 25 m) que permiten obtener columnas de mayor
eficiencia, llevo a una utilizacin cada vez ms extensa de este tipo de
cromatografa.
La experiencia acumulada en el desarrollo de la CG permiti tambin aplicar nuevos
puntos de vista a la CL, para la que pronto se disearon sistemas de inyeccin,
circulacin del eluyente y deteccin, de eficacia comparable a la de los utilizados
en CG, dando lugar a la moderna tcnica de cromatografa liquida de alta eficiencia
(CLAE).

Es incuestionable que la cromatografa de lquidos de alta resolucin es la tcnica

de separacin ms ampliamente utilizada. Las razones de la popularidad de esta
tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas
exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y,
sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial inters en la
industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos
ejemplos de estos materiales incluyen los aminocidos, protenas, cidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, drogas, terpenoides, plaguicidas, antibiticos
esteroides, especies organometlicas y una cierta variedad de sustancias
inorgnicas.

Figura 1.- aplicaciones de la cromatografa liquida.

III

EL PROCESO CROMATOGRFICO.

La cromatografa liquida de alta eficiencia se encuadra dentro de la cromatografa

de elucin. En esta, un lquido (fase mvil) circula en ntimo contacto con un slido
u otro liquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de sustancias
(analitos) en la corriente de fase mvil, cada analito avanzar a lo largo del sistema
con una velocidad diferente que depender de su afinidad por cada una de las fases.
Esto supone que despus de terminado el recorrido de la muestra por la columna,
cada una de las sustancias introducidas en el sistema eluir con un tiempo diferente,
es decir, estarn separadas.

3.2

Clasificacin de la cromatografa liquida.

Los diferentes y tipos de cromatografa liquida se pueden clasificar de diferentes

maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la realizada en base a la

naturaleza de la fase estacionaria, ya que esta la que impone fundamentalmente el

mecanismo de separacin; de este modo se puede enumerar tipos de tcnicas:
Cromatografa de adsorcin (liquido-solido).
La fase en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil y la fase
estacionaria.
3.2.1 Cromatografa
qumicamente).

de

reparto/adsorcin

(fases

ligadas

La separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil y
la fase estacionaria.
3.2.2 Cromatografa de intercambio inico.
Este tipo de cromatografa se da cuando la fase estacionaria presenta en su
superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo
contrario que circulan en la fase mvil.
3.2.3 Cromatografa de exclusin molecular.
La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamao del poro
controlado, que permite la entrada de ciertas molculas de manera selectiva
dejando fuera otras de mayor tamao.
El mecanismo de retencin en los dos primeros casos es similar, variando
nicamente el tipo de interacciones que se producen y el cul de ellas es la
predominante, por esta razn, en la prctica se realiza otra divisin de los dos
primeros tipos de cromatografa atendiendo a polaridad de la fase estacionaria.

IV

CROMATOGRAFA DE FASE NORMAL

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones

que se producen con el soluto son especficas del grupo activo. La fase estacionaria
puede ser un slido absorbente (slice o almina), o bien, un soporte al que se unen
qumicamente molculas orgnicas que presentan grupos funcionales de alta
polaridad (ciano, amino, etc).

CROMATOGRAFA DE FASE REVERSA (INVERSA):

La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos

fenilo) y las interacciones que se producen son inespecficas (efectos solvfobo).

VI

INSTRUMENTACIN PARA CROMATOGRAFA DE

LQUIDOS

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamao de

partcula entre 3 y 10 m, que, por otra parte, son comunes en la moderna
cromatografa de lquidos, se requieren presiones de algunos cientos de kilos por
centmetro cuadrado. Como consecuencia de estas elevadas presiones, el equipo
necesario para la HPLC tiende a ser ms sofisticado y caro que el que se utiliza en
otros tipos de cromatografa. La Figura 2 muestra un esquema de los componentes
fundamentales de un cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno
de los componentes se trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Figura 2.- Esquema de un equipo de HPLC.

Los componentes bsicos de cromatgrafo de lquidos son:

Dispositivos de recipientes para fase mvil.
Dispositivos de suministros de eluyentes (bombas y dispositivos de mezclado
de eluyentes).
Dispositivos de inyeccin.
Dispositivos de deteccin.
Dispositivos de columnas.

6.1

Recipientes para la fase mvil y sistema para el

tratamiento de los disolventes.

Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o ms recipientes de vidrio o de

acero inoxidable, cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente
(tabla 1). Los recipientes a menudo se equipan con un sistema para eliminar los
gases disueltos en general oxgeno y nitrgeno- que interfieren formando burbujas
en los sistemas de deteccin. Un desgasificador puede consistir en un sistema de

bombeo por vaco, un sistema de destilacin, dispositivos para calentar y agitar los
disolventes o, como se muestra en la Figura 2, sistemas de difusin que permiten
arrastrar los gases disueltos fuera de la solucin mediante finas burbujas de un gas
inerte de baja solubilidad.
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se
denomina una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se
aumenta notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos
(y a veces ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez
comienza la elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a
veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas.
Tabla 1.- tipos de disolventes

6.2

Bombas.

La misin de la bomba e la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de

la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por la presin n
cabeza de columna, ya que esta puede variar por obstruccin de las lneas
conduccin, del filtro de la cabeza la columna, etc.
Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes caractersticas:
Estar construido con materiales qumicamente inertes frente a la fase mvil.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociados un amortiguador de
estas. Ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separacin en s, pueden
construir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.

Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columna. El rango de

caudales para las columnas que se utilizan habitualmente vara desde los 10l/min
hasta los 10 ml/min (columna microbore, analtica y semipreparativas).
El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de l
depende la reproducibilidad de os tiempos de retencin.
6.2.1 Tipos de bombas.
Una primera clasificacin de las bombas utilizadas en CLAE, se puede realizar
atendiendo a la fuerza, as se tendrn:
Bombas neumticas.
bombas de desplazamiento (figura 4).
bombas amplificadoras de aire (figura 3).
Bombas de motor elctrico.
bombas de jeringa.(figura 5).
bombas de alternantes (pistn o membrana) (figura 6).

Figura 3.- Bomba de amplificador a de aire.

Figura 4.-Bomba de desplazamiento.

Figura 5.- Bomba de jeringa.

Figura 6.- Bomba de alternante

6.3

Sistema de mezcla de fase mvil.

En cromatografa de lquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrtico,

cuando la fase mvil mantiene la misma composicin durante, y en gradiente,
cuando la composicin de la fase mvil cambia segn una funcin dependiente del
tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo
cromatogrfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes con
un control preciso y reproducible.
6.3.1 Mezclado de alta presin.
Este sistema de mezclado utiliza una bomba para cada uno de los disolventes que
se van a mezclar, estando la salida de cada bomba conectada a una conexin en
T o a una pequea cmara de mezcla- la denominacin de mezcla en alta presin
es debida a que mezcla se realiza una vez que los disolventes han pasado la bomba
y, por lo tanto, han adquirido la presin de trabajo (figura7).

Figura 7.- sistema de alta presin.

6.3.2 Mezclado de baja presin.

En los equipos de mezcla en baja presin, el mezclado de los diferentes compuestos
se lleva a cabo antes de estos entren en la bomba (en la zona de baja presin del
sistema), controlndose el caudal del sistema cromatogrfico por medio de una sola
bomba. El mezclado de los componentes se realiza por medio de vlvulas
porcentuales controladas por rels, que estn calibradas para dar la mezcla
adecuada. El dispositivo de control simplemente abre cada vlvula durante un
periodo de tiempo adecuado, que ser funcin del porcentaje que se precise en la
mezcla (figura8).

Figura 8.- sistema de baja presin.

6.4

Sistemas de inyeccin de muestra.

A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de

lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna.
El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la
sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser
muy pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se
ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
En cromatografa de lquidos el mtodo ms ampliamente utilizado para la
introduccin de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la
Figura Estos dispositivos estn normalmente integrados en el equipo
cromatogrfico y hay bucles intercambiables que permiten la eleccin de tamaos
de muestra desde 5 a 500 L. Con bucles de este tipo se puede introducir la muestra
a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisin relativa de unas dcimas por
ciento.
Tambin existen vlvulas de inyeccin de micromuestras, con bucles con
volmenes de 0,5 a 5 l.
6.4.1 Inyector de jeringa.
En este tipo e inyectores, la introduccin de la muestra en la columna se realiza por
medio de una jeringa entra en el sistema cromatogrfico travs de una membrana
(septum), lo que permite depositar la muestra en la cabeza de la columna (figura).
Las ventajas de este tipo de inyector en su facilidad de construccin y en que
permite sacar todo el partido a la eficacia por la columna; por el contrario, son
inyectores que presentan u8na gran falta de reproducibilidad, tienen una presin de
trabajo limitada y son gran dificultad de manejo.

Figura 9.- inyectores de jeringas con o sin cmara.

6.4.2 Inyector de vlvula.

Este sistema de inyeccin consiste en una vlvula de seis vas, dos de las cuales
estn conectadas entre si por medio de una espira (loop). Esta espira es un tubo
de volumen conocido, cuya misin es la de contener la muestra antes de efectuarse
la inyeccin.
La introduccin de la muestra se lleva a cabo en dos etapas:

La primera se realiza a presin atmosfrica y consiste en cargar la muestra

con ayuda de una jeringa.

La segunda mediante un giro de la vlvula, se hace pasar el eluyente a travs

de la espira hacia la columna.

Figura 10.- inyector de vlvula.

6.5

Columnas para cromatografa de lquidos.

Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo

de acero inoxidable de dimetro interno uniforme.
5.5.1. Precolumnas.
En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analtica, se coloca
delante una precolumna que elimina la materia en suspensin y los contaminantes
de los disolventes. Adems, en cromatografa lquido-lquido, la precolumna sirve
para saturar la fase mvil con la fase estacionaria y as minimizar las prdidas de
sta en la columna analtica. La composicin del relleno de la precolumna debe ser
semejante al de la columna analtica; sin embargo, el tamao de partcula es por lo
comn mayor para minimizar la cada de presin (figura).

Figura 11.- Precolumnas.

Tabla 2.- tipos de columnas.

6.5.2 Tipos de rellenos de la columna.

En cromatografa de lquidos se han utilizado dos tipos bsicos de rellenos, pelicular
y de partcula porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polmero, no
porosas y esfricas con unos dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la
superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina
o de una resina de intercambio inico. Para algunas aplicaciones se aplica un
recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria lquida que se
mantiene fija por adsorcin. Las bolas tambin se pueden tratar qumicamente para
obtener una capa superficial orgnica. Por lo general, los rellenos peliculares se
utilizan ampliamente en las precolumnas y no en las columnas analticas.
Los tpicos rellenos de partculas porosas de cromatografa de lquidos estn
formados por micropartculas porosas con dimetros entre 3 y 10 m y con la menor
dispersin posible para un tamao determinado. Las partculas son de slice,
almina o resinas de intercambio inico, aunque la slice es el material ms comn.
Las partculas de slice se sintetizan aglomerando partculas de slice de tamaos
inferiores al micrn en unas condiciones tales que se forman partculas mayores
con dimetros muy uniformes.
Las partculas que resultan se recubren muchas veces con pelculas orgnicas, que
se unen qumica o fsicamente a la superficie.

6.6

Detectores.

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las

propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin
de que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible
en un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe
tener un volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.
Los detectores en cromatografia de lquidos son de dos tipos bsicos. Los
detectores basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad
de la fase mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la
densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los
detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las
propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de
difusin, que no son propias de la fase mvil. En la Tabla 4.1 se indican los
detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms
importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos publicados en los que tena un
papel importante la cromatografia de lquidos, revel que el 71 % se utilizaban en la
deteccin de la absorcin UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el ndice de
refraccin, el 4,3% empleaba medidas electroqumicas y el 4,3% restante otras
medidas.
6.6.2 Detectores de absorbancia.
La Figura 4.5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la
medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de
minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas
ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de
1 a 10 L y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de
este tipo est restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.
6.6.3 Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros.
Los detectores de absorcin UV ms simples son los fotmetros de filtros con una
lmpara de mercurio como fuente. Lo ms comn en estos casos es aislar la lnea
intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos tambin se pueden utilizar
las lneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros. Resulta obvio que este
tipo de detector se utiliza de forma restringida para aquellos solutos que absorben
a alguna de estas longitudes de onda. Algunos grupos funcionales orgnicos y
diversas especies inorgnicas exhiben una banda ancha de absorcin a una o ms
de esas longitudes de onda.

6.6.4 Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores.

La mayora de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que
consisten en un espectrofotmetro de barrido con ptica de red. Algunos se limitan
a la radiacin ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiacin ultravioleta y la
visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por ejemplo, se puede
obtener el cromatograma completo a una sola longitud de onda o alternativamente,
cuando los picos que eluyen estn suficientemente separados, se puede elegir
distinta longitud de onda para cada pico. En este caso, debe emplearse el control
por ordenador para elegir la mejor longitud de onda en cada caso. Cuando se
desean los espectros completos con fines de identificacin, se puede parar el flujo
del eluyente durante un tiempo suficiente que permita el barrido de la regin de
longitud de onda que interesa.
6.6.5 Detectores de absorbancia en el infrarrojo.
Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con
barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro
semicirculares. El segundo, mucho ms sofisticado, es un tipo de detector infrarrojo
que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier.
Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiacin
ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de
fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los
volmenes de 1.5 a 10 L. Los instrumentos de infrarrojo ms sencillos pueden
trabajar a una o ms longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener los
espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elucin. Los instrumentos
con transformada de Fourier se utilizan de manera anloga a los instrumentos de
series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta que se han descrito
en la seccin anterior.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la
baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las
bandas anchas de absorcin infrarroja del agua y de los alcoholes impiden
prcticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.
6.6.6 Detectores de fluorescencia.
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseo a los
fluormetros y espectrofluormetros. En la mayora de ellos, la fluorescencia se
detecta por medio de un detector fotoelctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitacin. Los detectores ms sencillos utilizan una fuente de
excitacin de mercurio, y uno o ms filtros para aislar la radiacin fluorescente. Los
futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarn en

el uso de fuentes de lser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad
y selectividad.
Una ventaja inherente a los mtodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que
resulta ser ms de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de
absorbancia. En cromatografa de lquidos se ha aprovechado esta ventaja para la
separacin y determinacin de los componentes fluorescentes de las muestras.
6.6.7 Detectores de ndice de refraccin.
Estos detectores miden la diferencia de ndice de refraccin, entre el disolvente que
en su camino hacia la columna pasa a travs de una mitad de la cubeta y el efluente
de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos estn separados
por una placa de vidrio montada a un ngulo de modo que si las dos disoluciones
difieren en el ndice de refraccin se produce una desviacin de un haz de luz
incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie fotosensible del
detector provoca una variacin de la seal de salida, la cual, una vez amplificada y
registrada, proporciona el cromatograma.
Los detectores de ndice de refraccin tienen la ventaja de que responden a casi
todos los solutos. Es decir, son detectores universales anlogos a los detectores de
llama en cromatografia de gases. Adems, son fiables y no dependen del caudal.
Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han de
mantener a una temperatura constante en unas pocas milsimas de grado
centgrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayora de los otros
detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elucin con gradiente.

6.7

Cromatografa de adsorcin.

La cromatografa de adsorcin, o lquido-slido, es la forma clsica de cromatografa

de lquidos que introdujo Tswett por vez primera a principios de este siglo. Ms
recientemente, se ha convertido en un mtodo importante de HPLC.
Las nicas fases que se utilizan en HPLC lquido-slido son la slice y la almina,
siendo la primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su
mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con pocas
excepciones, las caractersticas de adsorcin de los dos adsorbentes son similares.
Con ambos, el orden de tiempos de retencin es: olefinas < hidrocarburos
aromticos < haluros = sulfuros < teres < nitrocompuestos < esteres = aldehdos =
cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas < sulfxidos < amidas < cidos
carboxlicos.
6.7.2 Aplicaciones de la cromatografa de adsorcin.

La cromatogrfia de adsorcin es ms adecuada para compuestos no polares

probablemente con masas moleculares inferiores a 5000. Los mtodos de
cromatografa de adsorcin y los de reparto, aunque en algn caso se superponen,
tienden a ser complementarios.
En general, la cromatografa lquido-slido es ms adecuada para muestras que son
solubles en disolventes no polares, y que por tanto tienen una solubilidad limitada
en los disolventes acuosos que son los que se utilizan en los procedimientos de
reparto en fase inversa. Como en cromatografa de reparto, los compuestos que
tienen distintos grupos funcionales por lo general se pueden separar, Una
caracterstica particular de la cromatogrfa de adsorcin, que no es compartida por
otros mtodos, es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros. La Figura
ilustra una aplicacin caracterstica de la cromatogrfia de adsorcin.

Figura 12.- aplicacin tpica de cromatografa de adsorcin.

6.8

Cromatografa inica.

La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para
la separacin y determinacin de iones que se basan en el uso de las resinas de
intercambio inico. La cromatografa inica empez a desarrollarse a mediados de
los aos setenta, cuando se demostr que mediante las columnas de HPLC rellenas
con resinas de intercambio catinico o aninico, se podan resolver fcilmente
mezclas de cationes o aniones. Por entonces, la deteccin se realizaba por lo
general con medidas de conductividad.
La cromatogrfia inica se desarroll durante el proyecto Manhattan que optimizaba
la separacin con resinas de intercambio catinico de los cationes de las tierras
raras estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el cual se basa la
teora de las separaciones por intercambio inico, se extendi tras la 2 Guerra

Mundial a muchos otros tipos de materiales y al final condujo a los mtodos

automatizados para la separacin y deteccin de aminocidos y otras especies
inicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empez a finales
de los aos sesenta, pero su aplicacin a la separacin por intercambio inico se
retras debido a la inexistencia de un mtodo general y sensible para la deteccin
de especies como los cationes alcalinos y alcalinotrreos, y aniones como los
haluros, acetato y nitrato. Esta situacin se remedi en 1975 al desarrollarse por
tcnicos de Dow Chemical Company la tcnica de supresin del efluente, la cual
hace posible la deteccin conductimtrica de los iones eluidos.
6.8.2 Rellenos de intercambio inico.
Histricamente, en cromatografa de intercambio inico se han empleado pequeas
partculas esfricas porosas que se forman en la copolimerizacin del estireno y del
divinilbenceno emulsionados. La presencia de divinilbenceno (normalmente en un
8%) origina una polimerizacin entrecruzada que imparte estabilidad mecnica a las
bolitas. Con objeto de activar el polmero frente a los iones, a la estructura se le
unen qumicamente grupos funcionales cidos o bsicos. Los grupos ms comunes
son el cido sulfnico y las aminas cuaternarias.
Las partculas polimricas porosas no resultan del todo adecuadas como rellenos
cromatogrficos debido a la baja velocidad de difusin de las molculas de los
analitos a travs de los microporos de la matriz polimrica, y tambin debido a la
compresibilidad de la matriz. Para solventar este problema, se han desarrollado dos
nuevos tipos de rellenos que se utilizan ms que el tipo de polmero poroso. Uno es
el relleno de partcula pelicular en el que la superficie relativamente grande (de 30
a 40m) de una partcula, esfrica y no porosa, de vidrio o polimrica se recubre
con una resina sinttica de intercambio inico. Un segundo tipo de relleno se
prepara recubriendo micropartculas porosas de slice, tal como las que se utilizan
en la cromatografia de adsorcin, con una delgada pelcula del intercambiador. Con
cualquiera de ellas, se obtiene un aumento de la eficacia debido a que la difusin
en el polmero es ms rpida. Por otra parte, la capacidad de carga de estos rellenos
es menor, especialmente los de tipo pelicular.

6.9

Cromatografa de reparto.

La cromatografa de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografa de lquidos

ms ampliamente utilizado. En el pasado, la mayora de las aplicaciones se han
referido a compuestos polares no inicos de baja a moderada masa molecular <
3000).en la cromatografa de reparto, la fase estacionaria es un segundo liquido
inmiscible con la fase mvil lquida
La cromatografa de reparto se puede subdividir en cromatografa lquido-lquido y
cromatografa con fases unidas qumicamente (enlazadas). La diferencia entre

estas tcnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las
partculas soporte del relleno.
En lquido-lquido, la fase estacionaria lquida se retiene sobre la superficie del
soporte por adsorcin fsica. En fase unida qumicamente, la fase estacionaria se
une qumicamente a la superficie del soporte.
6.9.2 Columnas para cromatografa con fases unidas
qumicamente.
Los soportes para casi todos los rellenos con fases unidas qumicamente se
preparan con slice rgida o composiciones constituidas bsicamente por slice.
Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y
uniformes, con dimetros de 3, 5 o 10 m. La superficie de la slice totalmente
hidrolizada est constituida por grupos SiOH qumicamente reactivos. Las
superficies de slice caractersticas contienen cerca de 8 mol/m2 de grupos SiOH.
Los recubrimientos de fase enlazada ms utilizados son los siloxanos, que se
forman por reaccin de la superficie hidrolizada con un organoclorosilano.
6.9.3 Empaquetamiento en fase normal y fase reversa.
Es posible distinguir dos tipos de cromatografa segn, la polaridad relativa de las
fases mvil y estacionaria.
La fase normal ocupa como fases estacionarias, compuestos relativamente no
polares como el agua o el trietilenglicol, con un disolvente no polar, como el nhexano o i-propil ter como fase mvil. En la cromatografa de fase reversa, la fase
estacionaria es polar, en muchos casos hidrocarburos, mientras que la fase mvil
es un disolvente relativamente polar (como el agua, metanol, acetonotrilo o
tetrahidrofurano).
En la cromatografa de fase normal, el componente menos polar eluye primero; al
aumentar la polaridad de la fase mvil disminuye el tiempo de la elucin.
Contrariamente, en la cromatografa en fase reversa ocurre primero la elucin del
componente ms polar, e incrementa la polaridad de la fase mvil aumenta el
tiempo de elucin.
Los rellenos de fase enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el
recubrimiento unido qumicamente tiene un carcter no polar, y de fase normal
cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Tal vez las tres
cuartas partes de toda la cromatogrfla de lquidos de alta resolucin se llevan a
cabo normalmente con rellenos de fase inversa. Por lo general, el grupo R del
siloxano en estos recubrimientos es una cadena C8 (n-octilo) o una cadena C18 (noctadecilo). En estas preparaciones, los grupos de hidrocarburo de cadena larga se
alinean el uno junto al otro y en perpendicular a la superficie de la partcula.

6.9.4 Establecimiento del mtodo en cromatografa de reparto.

En cromatografa de lquidos, el establecimiento del mtodo tiende a ser ms
complejo que en cromatografa de gases, debido a que cuando la fase mvil es
lquida, los componentes de la muestra interaccionan con ambas fases, la
estacionaria y la mvil. Por el contrario, en la cromatografa de gases, la fase mvil
se comporta como un gas ideal y no contribuye al proceso de separacin; slo sirve
como portador de los componentes de la muestra a travs de la fase estacionaria.
Es decir, en cromatografa de gases, el que la fase mvil sea helio, nitrgeno o
hidrgeno no afecta significativamente a la separacin. Muy al contrario, el xito de
una separacin cromatogrfico de reparto depende de que la fase mvil sea
acetonitrilo, hexano o bien dioxano.

6.9.5 Seleccin de la columna en las separaciones

cromatogrficas de reparto.
Al elegir una columna para una separacin cromatogrfico de reparto, la polaridad
de la fase estacionaria ha de ser bastante similar a la de los analitos, y para la
elucin se utiliza entonces una fase mvil con una polaridad considerablemente
distinta. Este procedimiento por lo general resulta ms adecuado que si las
polaridades del soluto y de la fase mvil son parecidas pero difieren mucho con
respecto a la fase estacionaria. En este caso, la fase estacionaria a menudo no
puede competir efectivamente por los componentes de la muestra, y los tiempos de
retencin se hacen demasiado cortos para las aplicaciones prcticas. En el otro
extremo, por supuesto, se encuentra el caso de que las polaridades del soluto y de
la fase estacionaria sean demasiado parecidas y totalmente distintas de la fase
mvil; en estas circunstancias, los tiempos de retencin se hacen excesivamente
largos. En resumen pues, si se quieren obtener buenas separaciones en un tiempo
razonable, las polaridades del soluto, de la fase mvil y de la fase estacionaria se
han de armonizar cuidadosamente.

VII

REFERENCIAS.

Harris, D. C. (2003). Anlisis qumico cuantitativo. Madrid, ESPAA:

REVERT. Skooog, D. A.

Qumica Analtica (Octava edicion ed.) (2005). Ciudad de Mxico, Mxico:

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