LABORATORIUM FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP
KROMATOGRAFI KOLOM, KROMATOGRAFI CAIR VAKUM, DAN MPLC
(Middle Pressure Liquid Chromatography)
EKSTRAK DAUN JAMBU BIJI (Psidium guajava L.)

OLEH:
PUTRI SAKINAH
YAYU PERMATASARI
SILVA MALIKU
REZKY APRHODYTA
HUTRI ARDIYANTO
NAHDIAH W

N111 12 109
N111 13 004
N111 13 026
N111 13 312
N111 13 519
N111 13 521

KELOMPOK IV
GOLONGAN SENIN PAGI
ASISTEN: DIAN MEGAWATI AMIN PUTRI
MAKASSAR
2015

BAB I
PENDAHULUAN
I.1

Latar Belakang
Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak

berhubungan dengan sifat spesifik senyawa. Analisis meliputi pengambilan

cuplikan,

pemisahan

dimaksudkan,

senyawa

pemekatan

pengganggu,

terlebih

dahulu

isolasi

sebelum

senyawa

yang

identifikasi

dan

pengukuran. Banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik

paling banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael
Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906. Kromatografi berasal
dari bahasa Yunani Kromatos yang berarti warna dan Graphos yang berarti
menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada
perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa
tinggal pada sistem dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa
gerak,

memperkolasi

melalui

celah-celah

fasa

diam.

Gerakan

fasa

menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.

Berbagai metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling
kuat dan sering dilakukan di laboratorium. Metode kromatografi, karena
pemanfaatannya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik
dan preparatif.

Oleh karena itu untuk memisahkan komponen-komponen

yang terdapat dalam ekstrak sampel maka dilakukan dengan metode

kromatografi kolom, kromatografi cair vakum, dan MPLC (Medium Pressurre

Liquid Chromatography).

I.2

Maksud Percobaan

1. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang

terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan
metode kromatografi kolom.
2. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang
terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan
metode kromatografi cair vakum.
3. Mengetahui dan memahami cara pemisahan campuran senyawa yang
terkandung dalam ekstrak daun jambu biji (Psidium guajava L.) dengan
metode MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography).

I.3

Tujuan Percobaan

1. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak

daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi
kolom berdasarkan tingkat kepolarannya.
2. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak
daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan kromatografi
cair vakum berdasarkan tingkat kepolarannya.
3. Memisahkan dan mendapatkan senyawa yang terkandung pada ekstrak
daun jambu biji (Psidium guajava L.) dari hasil pemisahan MPLC (Middle
Pressure Liquid Chromatography) berdasarkan tingkat kepolarannya.

I.4

Prinsip Percobaan

1. Pemisahan senyawa dengan metode kromatografi kolom berdasarkan

absorbsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda
terhadap permukaan fase diam dengan cara melarutkan campuran yang
akan diuji dalam sedikit pelarut lalu dimasukan lewat puncak kolom dan
dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Karena adanya perbedaan
daya serap dari masing-masing komponen, senyawa yang lebih polar
akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non
polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. Zat yang di serap dari
larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada
kolom. Pelarut lebih lanjut/dengan tanpa tekanan udara masing-masing
zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi
pemisahan dalam kolom.
2. Pemisahan senyawa dengan

metode

kromatografi

cair

vakum

berdasarkan pemisahan secara adsorpsi dan partisi yang dipercepat

dengan bantuan pompa vakum.
3. Pemisahan senyawa dengan

metode

MPLC

pemisahan di bawah tekanan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Kromatografi

berdasarkan

prinsip

Kromatografi adalah cara pemisahan zat khasiat dan zat lain yang ada
dalam sediaan dengan jalan penyarian berfraksi, penyerapan, atau
penukaran ion pada zat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir
(2).
Kromatografi digunakan untuk memisahkan campuran dari substansinya
menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi bekerja
berdasarkan prinsip yang sama (3).
Seluruh bentuk kromatografi memiliki fase diam (berupa padatan atau
cairan yang didukung pada padatan) dan fase gerak (cairan atau gas). Fase
gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen dari
campuran

bersama-sama.

Komponen-komponen

yang

berbeda

akan

bergerak pada laju yang berbeda pula (3).

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan
perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada
kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah
fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran
sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen
yang mudah tertahan pada fase diam akan tertimggal. Sedangkan komponen
yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (4).

II. 2

Kromatografi Kolom

Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang

digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapkan pada skala
besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan
untuk pemurnian senyawa di laboratorium (5).

Gambar 1. Alat Kromatografi Kolom

Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang
dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampelsampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum
bahwa

panjang

kolom

harus

sekurang-kurangnya

10

kali

ukuran

diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan

diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti
alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam
porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan
sedikit cairan (6).

Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan

sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relatif zat terlarut
melalui sistem. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom
dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m
hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair
dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol,
ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan
silicon (5).
Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai
keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti
yang tertera pada masing-masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap
sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang
rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan
ulang senyawa yang dikromatografi.
Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan suatu campuran
senyawa. Kolom yang terbuat dari gelas diisi dengan fase diam berupa
serbuk penyerap (seperti selulosa, silika gel, poliamida). Fase diam dialiri
(dielusi) dengan fase gerak berupa pelarut.
Kromatografi kolom terdiri dari 2 fase yaitu (7):
1. Fase Diam

Fase stationer dalam kromatografi kolom adalah zat padat (adsorben).

Fase diam yang paling umum digunakan adalah silica gel yang diikuti
alumina. Fungsi dari fase diam adalah untuk menahan sampel bergerak di
sepanjang kolom.
2. Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan dalam kromatografi kolom berupa campuran
pelarut atau pelarut murni (eluent). Fungsi fase gerak adalah mengalirkan
analit (sampel) untuk bergerak di sepanjang fase diam sampai akhirnya
terelusi.
Ukuran penyerap untuk kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT.
Kemasan kolom biasanya 63-250 m, untuk kolom yang dijalankan dengan
gaya

tarik

bumi,

kolom

yang

dijalankan

dengan

tekanan, apakah

menggunakan udara atau pompa, biasanya mengandung partikel 40-63 m

atau lebih halus (8).
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang
masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan
senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan
partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60,
kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam : (7)
a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi
kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.
b. Cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan
pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk
semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat,
setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben
kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu
dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.
Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui
dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka
dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang
keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.
Pada kromatografi kolom ukuran silika 1:100 karena berdasarkan
penelitian/pengalaman itu merupakan perbandingan yang paling tepat untuk
panjang kolom dalam menghasilkan pemisahan senyawa yang baik,
mengingat pemisahan dipengaruhi oleh panjang dan diameter kolom,
semakin panjang kolom semakin baik untuk melakukan pemisahan. Pada
kromatografi cair vakum digunakan 1:10 karena kapasitas dari gelas masir
tidak mencukupi jika menggunakan perbandingan 1:100, jadi biasanya
menggunakan perbandingan 1:10, intinya pemisahan dipengaruhi oleh
panjang dan diameter dari silika, semakin panjang dan lebar diameternya,
maka pemisahan akan semakin baik. (12)
Kromatografi kolom dari larutan dibutuhkan tabung pemisah tertentu
yang diisi dengan bahan sorpsi dan juga pelarut pengembang yang berbeda.
Tabung pemisah yang diisi dengan bahan sorpsi disebut kolom pemisah.

Tergantung dari masalah bahan pemisahan dapat digunakan tabung filter

dengan gelas berpori yang pada ujung bawah menyempit (tabung Allihn) atau
tabung gelas, yang pada ujung bawah menyempit dan dilengkapi dengan
kran. Tabung bola jarang digunkan. Perbandingan panjang tabung terhadap
diameter pada umumnya adalah 40:1. Harga 20 berlaku sebagai batas
bawah (9).
Pengisisan tabung pemisah dengan adsorben, yang juga disebut
kemasan kolom, harus dilakukan secara hati-hati, harus rata. Aluminium
oksida atau silika gel dapat diisikan kering ke dalam tabung pemisah. Agar
pengisian rata, tabung setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan
lemah pada pelat kayu. Adsorben lainnya harus diisikan sebagai suspensi,
terutama jika zat ini menggelembung dengan pelarut pengembang. Yang
umum dilakukan adalah, adsorben dibuat seperti bubur dengan pelarutelusi,
kemudian dimasukkan ke dalam tabung pemisah. Sebagai bahan sorpsi
digunakan bahan yang sama dengan kromatografi lapis titpi yaitu silika gel,
aluminium oksida, poliamida, selulosa, selanjutnya juga arang aktif dan gula
tepung. Tergantung dari cara pengembangan dapat dibedakan kromatografi
elusi, kromatografi garis depan dan kromatografi pendesakan (9).
Kolom kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar
menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertical (10).
Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan dengan kromatografi
kolom adalah fase diam yang digunakan, kepolaran pelarut (fase diam),

ukuran kolom (diamter dan panjang kolom), kecepatan alir elusi membantu
mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan
kehidupan manusia secara umum (10).
Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan pada
afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu
memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian besar
kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase
gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan menjadi lebih
singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu
yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat
ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di dalam kolom dengan
mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol
keran. Laju aliran yang lebih baik dapat dicapai dengan menggunakan pompa
atau dengan menggunakan gas dengan kompresi (misalnya udara, nitrogen,
argon) untuk mendorong pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas)
diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan
adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian
diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari
atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah
(fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer).
Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan

partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat

terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.
Akhirnya,

zat

terlarut

akan

terpisahkan

membentuk

beberapa

lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok

untuk memberikan spesimen murninya. Nilai R didefinisikan untuk tiap zat
terlarut dengan persamaan berikut.
R = (jarak yang ditempuh zat terlarut)/(jarak yang ditempuh pelarut/fasa
mobil) (11).
Kromatografi kolom karena memiliki aliran konstan solusi eluted
melewati

detektor

dalam

berbagai

konsentrasi,

detektor

harus

plot

konsentrasi dari sampel eluted selama perjalanan waktu. Plot konsentrasi

sampel terhadap waktu disebut kromatogram. Resolusi mengungkapkan
tingkat pemisahan antara komponen-komponen dari campuran. Semakin
tinggi resolusi kromatogram, semakin baik tingkat pemisahan sampel kolom
memberi (12).
Faktor-faktor yang digunakan untuk evaluasi kinerja kolom yaitu (12):
1. Efisiensi Kolom Kromatografi
Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang paling sederhana
adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N). Ukuran efisiensi kolom
adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep
lempeng teoritis pada distilasi.
2. Resolusi (Daya Pisah)
Kolom yang lebih efisien akan mempunyai resolusi yang baik. Tingkat
pemisahan

komponen

dalam

suatu

campuran

dengan

metode

kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Untuk

hasil pemisahan yang baik, puncak-puncak dalam kromatogram harus
terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang
(overlapping) atau tidak ada tumpang tindih sama sekali. Resolusi
komponen-komponen dalam kromatografi tergantung pada waktu retensi
relatif pada sistem kromatografi tertentu dan tergantung pada lebar
puncak.
3. Faktor Asimetri (Faktor Pengekoran)
Suatu situasi yang menunjukkan kinerja kromatografi yang kurang baik
adalah ketika ditemukan suatu puncak yang mengalami pengekoran
(tailing) sehingga menyebabkan puncak tidak setangkup atau tidak
simetri. Jika puncak yang akan dikuantifikasi adalah asimetri (tidak
setangkup), maka suatu perhitungan asimetris merupakan cara yang
berguna untuk mengontrol atau mengkarakterisasi sistem kromatografi.
Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang
sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif,
senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek
molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam
bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekulmolekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan
molekul penting lainnya.
Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi
ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya,

dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau
dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa
bertahan lama.
Dalam bidang klinik, teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam
menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien,
dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut.
Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau
ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air
liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa
memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu
penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi
sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak
metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan
tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama
untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.
Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama
dalam.
Pada metode kromatografi kolom mempunyai keuntungan dan kerugian,
yaitu (14):
Keuntungan:
1. Dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif

2. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen campuran

3. Digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi
Kerugian:
1. Untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan teknik dan manual
2. Metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.

Kromatografi Kolom Isap :

1. Suction Colomn
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang banyak, berdasarkan absorpsi
dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan
suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia
yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. (12)
2. Rapid-Sigel
Isolasi komponen kimia dalam jumlah yang sedikit berdasarkan absorpsi
dan partisi, dimana kolom diisi dengan fase diam divakumkan dengan
suatu pompa vakum agar eluen dapat turun mengelusi komponen kimia
yang selanjutnya keluar sebagai fraksi-fraksi. . (12)
3. Press Colomn
Kromatografi kolom sederhana di mana fase gerak bergerak dengan
cepat karena penggunaan tekanan positif dari tabung nitrogren. Udara
yang ditekan mengandung O2 dan uap air yang dapat menyebabkan
peruraian produk dari ekstrak dan berubah saat pemisahan kromatografi. .
(12)

II. 3 Kromatografi Kolom Vakum

Kromatografi kolom vakum merupakan kromatografi kolom yang

dipercepat dan bekerja pada kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan
kondisi vakum sehingga prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi
dikemas

kering

dalam

keadaan

vakum

agar

diperoleh

kerapatan

maksimum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3, sumbat karet,
pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta wadah penampung
fraksi. Walaupun KCV memerlukan jumlah sampel yang lebih banyak dari
pada kromatografi lapis tipis (KLT), KCV tetap ekonomis dalam sisi biaya (9).

Gambar 2. Alat Kromatografi Vakum Cair

Kromatografi cair-vakum merupakan kromatografi kolom yang dikemas
kering biasanya dengan penyerap mutu kromatografi lapis tipis10-4 g pada
kondisi vakum, fase gerak digerakkan dengan kondisi vakum sehingga
prosesnya berlangsung cepat. Kolom kromatografi dikemas kering dalam
keadaan vakum agar diperoleh kerapatan maksimum. Setelah diperoleh

kemasan yang maksimum, kemudian vakum dihentikan dan pelarut yang

kepolarannya rendah dituangkan kedalam permukaan penjerap lalu divakum
lagi, kolom dihisap sampai keringdan kolom sekarang siap dipakai (9).
Fraksi
1

Pelarut
Heksana
Heksana-etil

2
3

asetat
Etil asetat
Etil asetat-

Komposisi
100

Volume (ml)
100

50:50

100

100

100

75:25

100

50:50

100

25:75

100

metanol
Etil asetat5
metanol
Etil asetat6

metanol
7
Metanol
100
100
Tabel 1. Urutan pelarut yang digunakan dalam Kromatografi Cair Vakum
Salah

satu

cara

pemisahan

adalah

kromatografi

cair

vakum,

kromatografi cair vakum adalah kromatografi kolom yang dipercepat dan

bekerja pada kondisi vakum. Alat yang digunakan terdiri dari corong G-3,
sumbat karet, pengisap yang dihubungkan dengan pompa vakum serta
wadah penampung fraksi. Corong G-3 diisi adsorben sampai setinggi 2,5 cm,
kemudian diketuk-ketuk dengan batang pengaduk bersalut dilarutkan dalam
pelarut organik yang cocok, kemudian ke dalam larutan ekstrak tersebut
ditambahkan adsorben dengan bobot sama dengan bobot ekstrak. Campuran
ini digenis sampai homogen, dikeringkan dandimasukkan ke dalam corong G-

3 kemudian diratakan. Permukaan lapisan adsorben ditutup dengan kertas

saring. Elusi diawali dengan pelarut nonpolar dilarutkan dengan kombinasi
pelarut dengan polaritas meningkat. Jumlah pelarut yang digunakan setiap
kali elusi adalah sebagai berikut: untuk bobot ekstrak sampai lima gram
diperlukan 25 ml pelarut, untuk 10-30 g ekstrak diperlukan 50 ml pelarut.
Dalam hal ini diameter corong dipilih sedemikian rupa sehingga lapisan
ekstrak dipermukaan kolom setipis mungkin dan rata. Masing-masing pelarut
dituangkan ke permukaan kolom kemudian dihisapkan pompa vakum.
Masing-masing

ekstrak

ditampung

dalam

wadah

terpisah

sehingga

menghasilkan sejumlah fraksi (10).

Kromatografi cair vakum dapat digunakan untuk fraksinasi dan
memurnikan fraksi. Metode KCV digunakan karena lebih efektif dan efisien
dalam pemisahan dibandingkan kromatografi kolom gravitasi. Kromatografi
cair vakum (KCV) pertama kali diperkenalkan oleh para ilmuwan dari
Australia untuk mengatasi lamanya waktu yang dibutuhkan untuk separasi
menggunakan kolom kromatografi klasik. Pada dasarnya metode ini adalah
kromatografi lapis tipis preparatif yang berbentuk kolom. Aliran fase gerak
dalam metode ini diaktifkan dengan bantuan kondisi vakum. Kromatografi cair
vakum pada awalnya digunakan untuk separasi senyawaan steroid dan
produk-produk natural dari laut. Kromatografi cair vakum terdiri dari suatu
corong Buchner yang memiliki kaca masir. Corong Buchner ini diiisi dengan

fase diam yang tingkat kehalusannya seperti yang umumnya dipakai dalam
kromatografi lapis tipis (70-230 mesh) (11).
Corong Buchner yang berisi fase diam ini digunakan dalam kondisi
vakum/bertekanan, yang berakibat pada kemampuan yang dihasilkan oleh
kromatografi cair vakum akan sama dengan kromatografi gravitasi namun
diperlukan

waktu

yang

lebih

singkat.

Cara

asli

yang

diperkenalkan oleh Coll menggunakan corong Buchner kaca masir atau

kolom pendek sedangkan target menggunakan kolom yang lebih panjang
untuk meningkatkan daya pisah (11).
Kromatografi

Vakum

Cair

mempunyai

keuntungan

yang

utama

dibandingkan kolom konvensional yaitu (12):

1

Konsumsi fase gerak KCV hanya 80% atau lebih kecil disbanding dengan
kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak
lebih lambat (10-100l/menit).

Adanya aliran fase gerak lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal
jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solute lebih pekat karenanya

jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas missal
sampel klinis.
Adapun kerugian dari KCV (Kromatografi Vakum Cair) yaitu (12):
1. Membutuhkan waktu yang cukup lama
2. Sampel yang dapat digunakan terbatas

II.4

MPLC (Middle Pressure Liquid Chromatography) (15)

Middle Pressure Liquid Chromatography (MPLC) adalah salah satu

dari berbagai jenis teknik kromatografi kolom preparatif. Pemisahan di bawah

tekanan memungkinkan penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil dan
meningkatkan keragaman fase diam yang dapat digunakan.
Pada dasarnya MPLC atau yang dikenal dengan Sepacore adalah
pemisahan yang menggabungkan keuntungan dari kromatografi kolom dan
vakum, senyawa yang dapat dipisahkan dari instrumen ini adalah senyawa
metabolit sekunder meliputi senyawa alkaloid, streoid/terpenoid, flavanoid,
tannin, fenolik, saponin dan senyawa metabolit sekunder lainnya.(2)
MPLC diperkenalkan pada tahun 1970 sebagai salah satu teknik yang
efisien untuk pemisahan preparatif senyawa organik. MPLC mampu
mengatasi salah satu kelemahan utama dari Low Pressure Liquid
Chromatography (LPLC), yaitu terbatasnya sampel yang dapat digunakan.
Metode pemisahan ini sekarang sering digunakan baik sendiri atau dalam
kombinasi dengan alat preparatif umum lainnya seperti kromatografi kolom
terbuka, kromatografi Sash, LPLC atau kromatografi cair kinerja tinggi
preparatif (HPLC). Perbedaan antara kromatografi cair tekanan rendah,
tekanan menengah, dan tekanan tinggi didasarkan pada rentang tekanan
yang diterapkan dalam teknik ini. MPLC memungkinkan pemisahan senyawa
dalam jumlah besar, dan tidak seperti kromatografi kolom terbuka dan

kromatografi Sash, MPLC dapat meningkatkan hasil pemisahan yang

diperoleh dan waktu yang diperlukan lebih singkat. Pengepakan bahan
dengan ukuran partikel yang lebih rendah di bawah tekanan meningkatkan
kualitas pemisahan serta fase padatnya dapat digunakan kembali.
Instrumen MPLC ini terdiri dari pompa untuk pelarut, sistem injeksi
sampel, dan pengemasan kolom. Pemisahan produk dapat diikuti secara
manual dengan memonitor dengan kromatografi lapis tipis (TLC) atau secara
otomatis dengan detektor dan perekam yang terhubung ke kolom outlet.
Senyawa yang dipisahkan dikumpulkan oleh kolektor fraksi.
1 Pompa
Pemisahan kromatografi 0,1-100 g sampel dalam beberapa jam
membutuhkan laju aliran 5-200 ml/menit, dengan tekanan maksimum 40
bar. Kriteria untuk memilih pompa MPLC meliputi: rentang laju aliran; ada
tidaknya peredam, yang menyediakan laju aliran dan tekanan selama
proses

pemisahan

dan

meningkatkan

reprodusibilitas

pemisahan;

keberadaan perangkat pemutus tekanan; dan adanya pembuat gradien.

2 Kolom
Kolom adalah titik pusat ketika mengoptimalkan pemisahan kromatografi
preparatif dan kriteria seperti jumlah sampel yang akan dimurnikan,
jumlah bahan kemasan, dan penjang serta diameter kolom, harus
dipertimbangkan dengan cermat. Kolom MPLC umumnya terbuat dari
kaca tebal yang dilapisi denga plastik pelindung dan dapat menahan
tekanan sampai 50 bar; Namun, beberapa kolom dari beberapa produsen

tidak bisa menahan tekanan melebihi 20 bar. Kolom juga bervariasi dalam
penjang dan diameternya (i.d.), ukuran kolom ini digambarkan sebagai
volume pengisian. Volume pengisian ini berkisar antara 63 ml (9 mm (i.d.)
x 100 mm) sampai 15000 ml (105 mm i.d. x 1760 mm). Pemilihan dimensi
kolum bergantung pada jumlah sampel yang akan dipisahkan, dengan
kisaran antara 0,1 g dengan kolom paling kecil hingga 100 g dengan
kolom yang besar.
4 Detektor dan Rekorder
Monitoring pemisahan MPLC dapat dilakukan dengan KLT dari fraksi yang
terkumpulkan. Deteksi secara online juga rutin digunakan dengan detektor
panjang gelombang tunggal

UV/Vis. Detektor UV biasanya didesain

untuk tujuan analisis dan fungsinya tidak memberi manfaat besar dalah
pemisahan preparatif. Akomodasi untuk laju aliran tinggi merupakan
prasyarat untuk detektor kromatografi preparatif.
5 Kolektor Fraksi
Pengumpulan

otomatis

dari

fraksi

dapat

dilakukan

dengan

menghubungkan kolektor fraksi dengan outlet kolom atau detektor.

Volume dari fraksi yang terkumpulkan bergantung pada diameter internal
kolom dan laju aliran. Pada standar pengaturan MPLC, kolektor frraksi
memiliki total kapasitas tube 240 x 20 ml, 120 x 50 ml, atau 48 x 250 ml.

Gambar 3. Medium Pressure Liquid Chromatography

II.2

Uraian Bahan

1.

Etil asetat (1)

Nama Resmi

: Etil asetat

Nama Lain

: Etil asetat

RM

: CH3CO.O.C2H5

Pemerian

: Cairan, tidak berwarna, bau khas

Kelarutan

: Larut dalam 15 bagian air, dapat bercampur dengan

etanol (95%)P dan dengan eter P.

Penyimpanan

: Dalam wadah tertutup baik

Kegunaan

: Sebagai eluen dan larutan partisi

2. n-Heksana (1)
Nama resmi
Nama lain
RM/BM
Pemerian

: HEXAMINUM
: Heksamina
: C6H12N4 / 140,19
: hablur mengkilap, tidak berwarna atau serbuk
hablur putih, tidak berbau, rasa membakar dan
manis kemudian agak pahit. Jika di panaskan

dalam suhu 260 menyublim.

Kelarutan

: larut dalam 1,5 bagian air, dalam 12,5 ml etanol

(95 %) P dan dalam lebih kurang 10 bagian
kloroform P

Penyimpanan
Kegunaan

: dalam wadah tertutup baik

: antiseptikum

BAB III
METODE KERJA
III. 1

Alat dan Bahan

III.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah kolom, statif,
botol vial, botol coklat, gelas ukur, dan pipet tetes.
III.1.2 Bahan

Bahan yang digunakan ekstrak jambu biji yang tidak larut heksan (non
polar), kapas, silica, n-heksan, etil asetat dan kapas.

III.2 Cara Kerja

Kromatografi Kolom
1.
2.
3.
4.

Disiapkan alat dan bahan

Dibuat gradian konsentrasi sesuai eluen terbaik yang didapatkan
Dimasukkan kapas kedalam kolom
Kemudian dimasukkan silika yang sebelumnya telah disuspensikan

dengan n-heksan dan dimampatkan

5. Dimasukkan kertas saring sesuai besar diameter kolom
6. Dimasukkan sampel sebanyak 1 gram
7. Dimasukkan gradient konsentrasi eluen dari yang paling non polar
hingga paling polar
8. Ditampung hasil dalam botol vial

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil Percobaan
No
Eluen
1
Heksan : Etil asetat = 10:1
2
Heksan : Etil asetat = 8:1
3
Heksan : Etil asetat = 6:1
4
Heksan : Etil asetat = 4:1
5
Heksan : Etil asetat = 1:3
6
Heksan : Etil asetat = 1:3
7
Heksan : Etil asetat = 1:4
8
Heksan : Etil asetat = 1:6
LABORATORIUM FITOKIMIA
9FAKULTAS
Heksan
: Etil asetat = 1:8
FARMASI
10UNIVERSITAS
Heksan HASANUDDIN
: Etil asetat = 1:10
11
Etil asetat 100%

Jumlah (ml)
Warna fraksi
50 ml
Kekuningan
50 ml
Kekuningan
50 ml
Kekuningan
50 ml
Kekuningan
50 ml
Bening
50 ml
Bening
50 ml
Kehijauan
50
ml
Kehijauan
LABORATORIUM FITOKIMIA
50
ml
Kehijauan
FAKULTAS FARMASI
50
ml
Kekuningan
UNIVERSITAS HASANUDDIN
50 ml
Bening

IV.2 Gambar Hasil Percobaan

Penimbangan ekstrak 1 gram

Penimbangan silika

LABORATORIUM FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Deret eluen yang digunakan

LABORATORIUM FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

LABORATORIUM FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Proses kromatografi kolom

LABORATORIUM FITOKIMIA
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

Penampungan fraksi hasil pemisahan

Fraksi hasil pemisahan dengan kromatograifi kolom

BAB V
PEMBAHASAN
Pada percobaan ini dilakukan pemisahan komponen senyawa pada
sampel ekstrak daun jambu biji (P. guajava) dengan menggunakan
kromatografi kolom. Alat dan bahan disiapkan, kemudian ditimbang silika
sebanyak 100 gram. Silika kemudian disuspensikan dengan n-heksan, lalu
dimasukkan ke dalam kolom melalui dinding sembari dimampatkan agar tidak
ada gelembung udara dan keran kolom dibuka. Setelah silika mencapai dua
per tiga dari tinggi kolom, dimasukkan kertas saring ke dalam kolom, lalu
dimasukkan sampel yang telah diserbukkan sebelumnya dengan silika.
Ekstrak sampel yang digunakan yaitu ekstrak hasil partisi metode ECP yaitu
ekstrak tidak larut heksan, karena senyawa yang ingin diisolasi adalah
senyawa flavanoid yang sifatnya semi polar sampai polar .
Setelah itu, dimasukkan eluen mulai dari yang paling non polar, dan
ditampung hasil fraksi yang dihasilkan dalam vial yang telah dikalibrasi 5 ml.

Dimasukkan eluen atau campuran eluen berikutnya dari yang kurang polar
hingga yang paling polar. Ditampung hasilnya dalam vial.
Eluen yang digunakan adalah heksan:etil asetat = 10:1, heksan:etil =
8:1, heksan:etil asetat = 6:1, heksan:etil asetat = 4:1, heksan:etil asetat = 1:3,
heksan:etil asetat = 1:4, heksan:etil asetat = 1:6, heksan:etil asetat = 1:8,
heksan:etil asetat = 1:10, dan etil asetat 100% masing-masing sebanyak 50
ml. Elusi yang dilakukan pada kromatografi kolom dilakukan dari eluen non
polar ke eluen polar, agar pemisahan yang terjadi dapat menghasilkan
pemisahan senyawa yang baik, dimana ketika eluen polar yang terlebih
dahulu dilewatkan, maka senyawa yang sifatnya polar maupun non polar
akan ikut terelusi, karena kemampuan yang dimiliki oleh pelarut polar dapat
melarutkan senyawa yang sifatnya polar dan non polar sehingga pemisahan
tidak terjadi, berbeda ketika eluen non polar yang dilewatkan terlebih dahulu,
kemampuan eluen non polar hanya dapat melarutkan/mengelusi senyawa
non polar. Hasil partisi yang tertampung adalah 68 vial dengan berbagai
variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.

BAB VI
PENUTUP
VI.1 Kesimpulan
Dari kromatografi kolom yang dilakukan dengan menggunakan ekstrak
daun jambu biji (Psidium guajava) di dapatkan hasil fraksi sebanyak 68 vial
dengan berbagai variasi warna yaitu bening, kekuningan, dan kehijauan.

VI.2 Saran
Semoga komunikasi antar praktikan dan asisten bisa lebih terjaga
sehingga segala hal yang berkaitan dengan praktikum dapat berjalan dengan
baik dan tidak terjadi kesalahpahaman.

DAFTAR PUSTAKA
1. Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Departemen Kesehatan RI.
1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan Republik
Indonesia: Jakarta.
2. Ibnu Gholib Gandjar. Abdul Rahman. 2008. Kimia Farmasi Analisis.
Pustaka Pelajar: Yogyakarta.
3. Roy J. Gritter, James M. Bobbit, Arthur E. S., 1991. Pengantar
Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung.
4. J. B. Harbone. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern
Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB: Bandung.
5. K. Hostettmann, M. Hostettmann, A. Marston. 1995. Cara Kromatografi
Preparatif. Penerbit ITB: Bandung.

6. Skoog DA, West DM, Holler FJ. 1996. Fundamentals of Analytical

Chemistry. 7th edition. New York: Saunders College Publishing. Hal. 1725.
7. Alam, Gemini, dkk. 2011. Penuntun Pratikum Senyawa Bioaktif. Fakultas
Farmasi Universitas Hasanuddin : Makassar
8. Kisman .Dr. Sastro ,ddk .1994. Analisis Farmasi Cet. 2 , Gadjah Mada
University Press, Yogyakarta
9. Johnson, Edward. 1991.Dasar Kromatografi Cair Penerbit ITB. Bandung
10. Soediro. I., dkk. 1986.

Kromatografi

Cepat

Sebagai

Cara

Fraksinasi Ekstrak Tanaman. Acta Pharmaceutica Indonesia

11. Adriana, Renalitha Devri. 2009. Skripsi : Aktivitas Antiplasmodium Fraksi
Non

Polar

Ekstrak

Etanol

Rimpang

Temu

Mangga.

Universitas

Muhammadiah Fakultas FarmasI. Surakarta

12. Meronda, G.Rahmah. 2008. Kromatografi, Makalah. FFUH. Dikutip dari
Kromatografi Makalah journal. Makassar
13. Anonim. 2007. Kromatografi Kolom . (Online) http://www.chem-is-try.org.
Diakses tanggal 14 November 2011
14.

Roy

J. Gritter,

James M.

Bobbit, Arthur

E. S.,

1991.

Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB. Bandung.

15. Hostettmann, K and C. Terreaux. 2000. Medium-Pressure Liquid
Chromatography.
Academic Press.

University

of

Lausanne,

Lausanne,

Switzerland:

A.

LAMPIRAN
Skema Kerja
Kromatografi Cair Vakum
Penyiapan Ekstrak
Ekstrak ditimbang

Ekstrak herba Eupatorium Oderatum dikeringkan dengan penambahan silika

Sedikit demi sedikit

Digerus hingga kering

Sisa silika disimpan

B.

Ekstrak siap digunakan

Proses Partisi
Disiapkan gelas masir dan erlenmeyer

Dirangkai alat vakum

Dimasukkan silica halus

mampatkan
Dimasukkan ekstrak kering

Dimasukkan kertas saring

Dimasukkan perbandingan eluen

Dinyalakan pompa vakum

Ditampung dimangkok

Diuapkan

Kromatografi Kolom

Penyiapan Bubur Silika

Ditimbang silika kasar dan ekstrak

Diperoleh bobot silika kasar 100x dari ekstrak

Dibagi menjadi 2 bagian

Bagian pertama dimasukkan di cawan porselen

Bagian kedua untuk penyiapan sampel

Dibasahkan dengan pelarut hexan

Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya

Diamkan beberapa saat (sekali-sekali diaduk)

Silika siap digunakan

Penyiapan Ekstrak
Ekstrak ditimbang

Ekstrak dikeringkan dengan penambahan sisa silika tadi

Sedikit demi sedikit

Digerus hingga kering

Sisa silika disimpan

Ekstrak siap digunakan

Proses Partisi
Dirangkai alat kolom

Dimasukkan kapas pada buret kolom

Dimasukkan bubur silika

mampatkan
Dimasukkan ekstrak kering

Dimasukkan kertas saring

Dimasukkan perbandingan eluen

Ditampung di vial

Diuapkan