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Conteni

OBJETIVOS...2
RESUMEN.....2
INTRODUCCIN..2
MARCO TERICO...3
1. El fosforo y los microrganismo
1.1 El fosforo.....3
1.2 microorganismos4
2. Mecanismos de transformacin del fosforo.....4
2.1 Mineralizacin del fosforo orgnico....4
2.2 Enzimas que intervienen en la solubilizacin del fosforo.......5
2.2.1 Enzimas fosfatasas......5
2.2.2 Enzimas Fitasas...5
2.3 Solubilizacin del fosforo.....5
3. Actividades inoculantes basados en el fosforo...5
4. Uso de fertilizantes..6
5. Uso de biofertilizantes.....6
MATERIALES Y MTODOS...6
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Medio pikovskaya....6
Siembra de microorganismos.6
Prueba para la presencia de halo.....7
Caracterizacin microbiolgica.....7
Evaluacin cualitativa de la actividad solubilizadora de fosforo......7
Evaluacin cuantitativa de la actividad solubilizadora de fosforo....7

RESULTADOS...7
1.
2.
3.
4.
5.

Siembra de microorganismos....7
Prueba de halo hidrolisis del medio.....8
Caracterizacin microbiolgica..8
Evaluacin cualitativa..9
Evaluacin cuantitativa...9

DISCUSIN.....10
1. Prueba de halo hidrolisis del medio...10
2. Caracterizacin microbiolgica. .....10
3. Evaluacin cualitativa....10

4. Evaluacin cuantitativa. ...11


CONCLUSIONES...11
REFERENCIAS.....11-12

Aislamiento e identificacin de
microorganismos con capacidad solubilizadora
de fsforo
Gonzlez Algecira Jhonnatan, Lpez Grisales Luisa, Marn Crdoba Valentina, Torres
Garay Evelyn.

OBJETIVOS

Aislar microorganismos solubilizadores de Fosforo.


Identificar las cepas que presentan mayor ndice de solubilizacin.
Determinar la concentracin del fosforo solubilizado.

RESUMEN
El fsforo es uno de los nutrientes ms limitantes en el crecimiento de las plantas. Dentro de las
funciones que le han sido atribuidas se encuentran la captacin, almacenamiento y transferencia
de energa adems de formar parte de macromolculas tales como cidos nucleicos y fosfolpidos
presentes en la membrana citoplasmtica, Las formas inorgnicas de fsforo son solubilizadas por
un grupo de microorganismos heterotrficos que excretan cidos orgnicos, los cuales disuelven
minerales ricos en fsforo quela en cationes unidos al fsforo liberando a este a la solucin, gracias
a esta habilidad se aislaron microorganismos con capacidad de crecer en un medio selectivo
conocido como pikovskaya, aquellos microorganismos con capacidad de crecer en este medio se le
realizaron varias pruebas una de ellas fue por medio de la identificacin del halo de hidrlisis, pero
finalmente se escogieron aquellos microrganismos que tuvieron en su medio liquido un pH acido
que fuera apto para la solubilizacin del fosforo, de igual manera se determin su capacidad
gracias a un mtodo colorimtrico que con ayuda al espectrofotmetro fue posible determinar la
concentracin de fosforo soluble en el medio, durante el desarrollo del proyecto fue posible la
identificacin de 3 hongos y 1 bacterias con gran potencial para ser solubilizadora de fosforo.

Palabras Clave: Fosfatasas, Fsforo inorgnico, Pseudonomas, Aspergillus spp.,


pikovskaya, Fitasas, Mtodo Colorimtrico.

INTRODUCCIN
El suelo se refiere a un material exterior,
formado por cinco componentes principales:
materia orgnica, materia mineral, agua, aire
y organismos vivos que se desarrollan
conjuntamente en varios ciclos. La cantidad
de cada uno de estos componentes no es la
misma en todos los suelos, sino que vara
con su localizacin. Las cantidades de
materia orgnica y materia mineral que forma
parte del suelo son relativamente fijas en un
determinado lugar, las porciones de agua y
aire varan ms frecuentemente. La materia
orgnica slo ocupa del 3% al 6% y la
porcin viviente apenas el 1% siendo esta la
porcin esencial para la produccin de
cultivos y fertilidad del suelo. Para el
desarrollo de los microorganismos en el
suelo, el medio ambiente es nico en
diferentes aspectos; es uno de los sitios ms
dinmicos para la interaccin entre
microorganismos y con la naturaleza. Parte
de estos procesos son la cantidad de
reacciones bioqumicas que descomponen la
materia orgnica, la intemperizacin de las
rocas y nutricin de los cultivos agrcolas.
Tambin los compuestos inorgnicos tienen
un notable efecto sobre los microorganismos
especialmente por la influencia en la
disponibilidad de nutrientes, aireacin y
retencin de agua. (Alexander, 1987).
Para poder determinar la fertilidad de un
suelo se debe analizar la interaccin de las
caractersticas fsicas, qumicas y biolgicas
que cuando se encuentran equilibradas
proporcionan un medio adecuado para el

desarrollo y crecimiento de las plantas. No


todas las condiciones son adecuadas en los
suelos, y en nuestro pas una de las razones
de estudio de fertilidad de los suelos es la
disponibilidad del fsforo. Este elemento se
origina de la descomposicin de la roca
madre
durante
el
proceso
de
la
meteorizacin, solo representa el 0,1% de la
corteza
terrestre,
diferencindose
su
contenido en rocas primitivas o sedimentarias
en poca concentracin de las rocas
volcnicas
de
altas
concentraciones
(Navarro, 2003).
En la mayora de los suelos es el
predominante, se encuentra presente del
50% al 75% del fsforo total. Puede estar en
forma de iones fosfato H2PO4 en suelos con
niveles de pH inferiores a 7,2 (suelos cidos)
y el HPO, en suelos con pH superiores a 7,2
(suelos alcalinos), este se reparte entre la
fase acuosa y slida del suelo, donde se
encuentra adsorbido en la superficie del
complejo hmico-arcilloso, de coloides de
xido de hierro y aluminio y de algunos
carbonatos. La solubilidad de los complejos
Al-P y Fe-P disminuye al incrementar el pH,
la ms alta solubilidad a pH bajo se debe a la
accin cida de disolucin. La abundancia
relativa de cada uno de estos compuestos
variar de acuerdo al origen del suelo, a los
niveles de materia orgnica y al pH
(Sanzano, 2003).

MARCO TERICO

El

uso

qumicos

indiscriminado

de

ha

notoriamente

afectado

fertilizantes

adems de formar parte de macromolculas

el

tales como cidos nucleicos y fosfolpidos

equilibrio biogeoqumico del ecosistema del

presentes en la membrana citoplasmtica.

suelo, siendo los cultivos los que se ven

Una gran porcin de fosfatos inorgnicos

afectados principalmente, por la disminucin

aplicados al suelo como fertilizantes son

o el desbalance en la obtencin de aquellos

inmovilizados despus de su aplicacin,

nutrientes que son esenciales para su

permaneciendo de forma inasequible para la

crecimiento.(Elsy,2007)

planta (Rengel y Marschner 2005). Esto

Algunos microorganismos crean una relacin


con la planta en donde ambos se benefician,
los microorganismos que se encuentran en el
suelo son sumamente importantes para las
plantas ya que estos le proveen a la planta
aquellos

elementos

que

para

ella

son

permite

predecir

que

aquellos

microorganismos que colonicen la raz de


estas plantas y que tengan la capacidad de
solubilizar

el

fsforo,

acten

como

promotores del crecimiento vegetal (Idriss et


al. 2002).

indispensables y que a veces no puede

Es por esto que aumentar la cantidad de

obtener la cantidad necesaria por sus propios

pases productores y la produccin constituye

medios.

de

un reto para la humanidad en diversos

fertilizantes qumicos la microbiota del suelo

Sin

sentidos. Una de las alternativas que se han

se est viendo gravemente afectada y por lo

encontrado para incrementar la produccin y

tanto

a la vez proteger el medio ambiente, es el

esto

embargo

afecta

con

los

el

uso

cultivos

la

productividad de estos se reduce; esto se

empleo

debe quizs a las alteraciones que pueden

fosfatos en cultivos de inters econmico.

llegar

Segn plantean Salimpour et al. (2010).

ocasionar

esos

componentes

qumicos en la composicin normal geolgica


del suelo como su pH, humedad y porosidad.
Por este motivo se han creado lo que
conocemos como biofertilizantes que si bien
han

ayudado

un

poco

mantener

la

microbiota normal del suelo y a que la


productividad de los cultivos no se vea
afectada, no es la solucin final puesto que
estos biofertilizantes todava tienen cierto
grado de contenidos qumicos.

1.1 El fosforo
limitantes en el crecimiento de las plantas.
Dentro de las funciones que le han sido
se

solubilizadoras

de

para el crecimiento y desarrollo biolgico. Su


funcin

se

basa

principalmente

en

la

transferencia y almacenamiento de energa


que obtiene a partir de la fotosntesis y del
metabolismo de carbohidratos para luego ser
usados

en

procesos

de

crecimiento

reproduccin de la planta.
de

estos

microorganismos

encontramos los que se conocen como


bacterias fosfato solubilizadora (BPS) las
cuales son capaces de aumentar la captacin

El fsforo es uno de los nutrientes ms

atribuidas

bacterias

El fosforo es uno de los nutrientes esenciales

Dentro

1. El fosforo y los microorganismos:

de

encuentran

la

captacin,

almacenamiento y transferencia de energa

de fosforo por la planta y por ende mejorar su


rendimiento. Encontramos microorganismos
bacterianos como:
Pseudomonas spp., Bacillus spp., Rhizobium
spp., Agrobactrium spp., Mycobacterium

spp., Microccocus spp., Aerobacter spp., y


Erwinia spp., que tienen la capacidad de
solubilizar compuestos insolubles de fosfato
inorgnico, entre los cuales encontramos: el
fosfato

triclcico,

fosfato

diclcico,

roca

materia
orgnica,
pues
la
biomasa
microbiana contribuye en la formacin del
humus, la conservacin de la estructura del
suelo y la biodegradacin de contaminantes
(Hoffman et al., 2003).

fosfrica, entre otros.


Es claro tener en cuenta que existe gran
variedad
capacidad

de

microorganismos
incluyendo

con

bacterias

esta
Gram

positivas y bacterias Gram negativas, lo que


ellos hacen es solubilizar fosfatos inorgnicos
e hidrolizar fuentes organicas de fosfato
insolubles, en esta parte podemos encontrar
microorganismo como: Bacillus licheniformis,
B. amyloliquefaciens, B.atrophaceus, P.
macerans,

Pseudomonas

aureofaciens,

Pseudomonas savastanoi, entre otros.


1.2 Microrganismo
EN
COLOMBIA,
LOS
BOSQUES
ALTOANDINOS y los pramos ubicados en la
alta montaa tropical juegan un papel
importante como generadores, reguladores y
almacenadores del recurso hdrico, por su
riqueza paisajstica, el albergue de gran
nmero de especies animales y vegetales
endmicas, as como de la microbiota
asociada al suelo, que es la base del
sustento para el establecimiento y desarrollo
de
las
comunidades
vegetales
all
encontradas (Castao, 2002; Garca et al.,
2005).

Los microorganismos influyen directamente


sobre la fertilidad y productividad de suelos
agrcolas, en particular, con respecto a la
disponibilidad de nutrientes, la supresin de
enfermedades para las plantas nativas (Van
Elsas et al., 2002; Anderson, 2003), as
como
la
degradacin
de
diferentes
plaguicidas, derivando de ellos energa y
nutrientes para su metabolismo (Das et al.,
2003).
Uno de los enfoques usados para estudiar la
calidad de los suelos es medir funciones
microbianas tales como las transformaciones
especficas de carbono, nitrgeno y fsforo,
puesto que afectan directamente la
disponibilidad de nutrientes y, por tanto,
pueden reflejar mejor los cambios en el
funcionamiento del ecosistema y la calidad
de los suelos (Pankhurst y Doube, 1997).
Adems, las funciones, el tamao y la
composicin de las poblaciones microbianas
han sido usados para ver los cambios en la
biota en respuesta al uso del suelo y, por
tanto, son indicadores de su estado biolgico
(Pankhurst y Doube 1997).
2. Mecanismos de transformacin del

La comunidad microbiana es el componente


funcional ms importante de la biota del
suelo, ya que juega un papel importante en el
flujo

de

energa,

la

transformacin

de

nutrientes y el ciclaje de elementos en el


ambiente (Filip, 2002; Hoffman et al., 2003).
Las actividades de estos organismos son
irremplazables en las transformaciones de la

fosforo.
Las formas inorgnicas de fsforo son
solubilizadas

por

un

grupo

de

microorganismos heterotrficos que excretan


cidos

orgnicos,

los

cuales

disuelven

minerales ricos en fsforo quela cationes


unidos al fsforo liberando a este a la
solucin (He et al. 2002).

2.1 Mineralizacin del fsforo orgnico.


La
mineralizacin
microbiana
est
fuertemente influenciada por parmetros
como el pH, el cual depende si es alcalino o
no, teniendo en cuenta que el pH alcalino
favorece la mineralizacin del fosforo
orgnico.
La mayora de las reacciones de
mineralizacin se lleva a cabo por enzimas
como fosfatasas, lo que ellas hacen es
catalizar la hidrlisis formada por los enlaces
ester y anhdridos de H3PO4, estas enzimas
son liberadas por la membrana plasmtica
donde actan sobre componentes de alto
peso molecular como lo son el DNA, RNA y
ATP, otras enzimas son las fitasas que lo que
ellas hacen es liberar fosfatos a partir del
cido fitico o sus sales de calcio, magnesio y
fitina, extrayendo de esta forma los fosfatos
para producir penta, tetra, di y monofosfatos
y finalmente inositol libre.
La clasificacin de las fosfatasas se da segn
su pH, dividindose en dos grupos: Fosfatasa
alcalinas: que exhiben actividad optima a pH
elevado (8,3 9,4) y las Fosfatasas acidas
que presentan actividad optima a pH bajo
(4,7 5,5). Las fosfatasas acidas se localizan
especialmente en los lisosomas, mientras
que la localizacin de las fosfatasas alcalinas
no est clara. Estas enzimas pueden ser
sintetizadas tanto por las races de las
plantas, las cuales producen fosfatasas
acidas y tambin por la flora micotica y las
bacterias las cuales son capaces de producir
fosfatasas alcalinas y acidas; El contenido de
fosforo orgnico en el suelo, pH, aireacin, y
temperatura son esenciales para incrementar
o disminuir la actividad enzimtica y por tal
motivo de estos aspectos depende la accin
de las enzimas que estn encargadas de
realizar la mineralizacin de fosforo orgnico
en el suelo. La solubilizacin del fosforo

orgnico ocurre en el suelo a expensas de


resto de plantas y animales, que contienen
grandes cantidades de este compuesto.
2.2 Enzimas que interviene
solubilizacin del fosforo.
2.2.1

en

la

Enzimas fosfatas:

Las fosfatasas son enzimas que catalizan la


hidrlisis de los fosfomonoesteres que se
encuentran en los sistemas biolgicos. Segn
su localizacin celular, tienen como funcin
eliminar un fosfoester orgnico que forma
parte de componentes de alto peso
molecular,
ejemplo
RNA
o
DNA,
suministrando a las clula nutrientes
esenciales para su desarrollo.
La produccin de estas enzimas es
controlada por mecanismos regulatorios
complejos, de tal manera que la actividad de
las mismas es detectable slo bajo
condiciones ambientales especficas como se
ha nombrado anteriormente. El inters sobre
las fosfatasas ha ido incrementndose
durante las ltimas dcadas debido a su gran
aplicacin en la biotecnologa, aunque los
conocimientos en cuanto a sus propiedades,
regulacin y rol que desempean es an
escaso; incluso en E. coli y Salmonella
typhimurium, las cuales han sido las ms
investigadas con relacin a esto. Slo muy
pocos genes han sido clonados y
secuenciados.
En el proceso de solubilizacin del fsforo y
su

transformacin

asimilables

por

microorganismos

hasta

compuestos

las

plantas,

juegan

un

los
papel

fundamental mediante la produccin de


enzimas fosfatasas que hidrolizan los enlaces
ester que unen al carbono con el fosfato para

liberar el in fosfato a la solucin del suelo


(Havlin et al., 1999).

2.2.2

Enzimas fitasas:

Durante ms de 20 aos las enzimas fitasas


(myo-inositol hexofosfato hidrolasas) han
atrado la atencin de los cientficos porque
se considera que son protenas con gran
aplicacin comercial y ambiental. Estas
enzimas pertenecen a una clase especial de
fosfatasas capaces de hidrolizar el cido
ftico (myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6
hexakisfosfato), a derivados del myo-inositol
menos fosforilados y a fosfato inorgnico.
Las fitasas se encuentran ampliamente
distribuidas en la naturaleza; se encuentran
presentes en plantas, microorganismos, as
como en algunos tejidos animales. La
actividad mayor de estas enzimas est
representada en los microorganismos, debido
a que se ha reportado producin de esta
enzima en bacterias gram-positivas, como
por ejemplo las bacterias del genero Bacillus
y bacterias gram-negativas, como lo son
Echerichia. coli, Klebsiella y Pseudomonas
sp. y adems hongos filamentosos,
especficamente Aspergillus nger.
En su mayora, las fitasas producidas por
bacterias gran negativas son protenas
intracelulares y periplasmticas, a diferencia
de los microorganismos gran positivos donde
estas enzimas son extracelulares. Hasta
ahora dos tipos principales de fitasas han
sido identificadas, fitasas cidas, con un pH

ptimo entre 2,5 y 5,5, que pertenecen a la


familia de las fosfatasas histidinas cidas
(HAP) porque presentan una secuencia
modificada altamente conservada y las
fitasas alcalinas con un pH ptimo entre 6 y
8, consideradas como fitasas de nuevo tipo,
por su alta especificidad al cido fitico y la
presencia necesaria del ion calcio para su
actividad enzimtica.

2.3 Solubilizacin del fosforo.


Es
un
proceso
relacionado
fundamentalmente con la produccin y
liberacin de cido organicos por algunos
microorganismos
que
se
encuentran
presentes en el suelo, esta actividad es
caractersticas de microorganismos Gram
negativos como las Pseudomonas. La
liberacin de cidos como: el cido oxli-co,
el malnico, el succnico y el glucnico a la
rizosfera provoca su acidificacin y esto
puede
directamente
incrementar
la
solubilizacin del fsforo.

3. Actividades de inoculantes basados


en el fosforo
El Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
en la resolucin N 00375 del 27 de febrero
del 2004, defini inoculante biolgico como:
Un producto elaborado con base en una o
ms cepas de microorganismos benficos
que, al aplicarse al suelo o a las semillas,
promueve el crecimiento vegetal o favorece el
aprovechamiento

de

los

nutrientes

en

asociacin con la planta o su rizsfera.


Incluye entre otros los productos elaborados
con micorrizas, rizobacterias promotoras del
crecimiento

vegetal,

entre

los

que

se

destacan microorganismos miembros de los


gneros

Rhizobium,

Pseudomonas,

Bradyrhizobium, Azotobacter, Azospirillum,


Frankia, Beijerinckia (1).
El uso de inoculantes biolgicos en sistemas
agrcolas favorece el desarrollo de las plantas
mediante diferentes mecanismos, tales como
la

fijacin

de

nitrgeno,

induccin

de

resistencia frente a patgenos, promocin de


rizognesis

sntesis

de

fitohormonas

estimuladoras del crecimiento vegetal, como


el cido indol actico (AIA); dentro de los
gneros reportados como promotores del
crecimiento vegetal (PGPR) se encuentran
Pseudomonas fluorescens, Rhizobium sp. Y
Bradyrhizobim sp., entre otros (2-4).
Otros tipos de actividades promotoras del
crecimiento

vegetal,

asociadas

la

disponibilidad de P en el suelo, son la


solubilizacin cida del P inorgnico y la
mineralizacin

del

orgnico.

La

solubilizacin de los compuestos inorgnicos


insolubles como los fosfatos de calcio, se
llevan a cabo por la produccin de cidos
orgnicos

(cido

cetoglucnico,
malnico

glucnico,

cido

cido

gliclico,

succnico),

2-

oxlico,

productos

del

catabolismo microbiano, y la consecuente


sustitucin del Ca++ por iones H+ (5-6).
Por su parte, el proceso de mineralizacin se
lleva a cabo mediante la accin de fosfatasas
cidas y alcalinas, las cuales se producen en
funcin del pH del suelo; algunos de los
gneros
actividades

reportados
son

para

estas

Pseudomonas

dos
sp.,

Mycobacterium sp., Micrococcus sp.,Bacillus


sp. Y Flavobacterium sp. (4, 7-8).
Sin embargo, para lograr alta produccin de
biomasa microbiana y de metabolitos
especficos, a un costo razonable, es
necesario disear medios de cultivo, bien
sean definidos (constituidos por compuestos

qumicamente definidos y en una cantidad


precisa) o complejos (contiene elementos
orgnicos cuya composicin nutricional no
est completa y precisamente descrita) (10).
4. Uso de Fertilizantes
Con el transcurso del tiempo, la aplicacin de
dichos productos ha producido erosin,
prdida de nutrientes disponibles para las
plantas, salinizacin en el suelo, etc.,
dejndolo no apto para la agricultura o infrtil.
La calidad de los suelos para el cultivo de
flores se evala principalmente bajo
parmetros de fertilidad que involucra
propiedades fsicas como la textura y
propiedades qumicas ms importantes
como: pH, conductividad, bases totales,
contenido de carbono orgnico, nitrgeno
total, fsforo, acidez, alcalinidad, salinidad y
la relacin de absorcin de sodio. Adems
cuanta
tambin
la
presencia
de
microorganismos que cumplen funciones
determinantes en la transformacin de los
componentes orgnicos e inorgnicos en
elementos nutricionales que pueden absorber
las plantas (Walsh, 2010).
5. Uso de biofertilizantes
En Venezuela se adelantan acciones
institucionales e interdisciplinarias dirigidas a
redimensionar y reorientar las prcticas de
manejo convencionales basada en altos
insumos, que incluye altas aplicaciones de
fertilizantes inorgnicos en los principales
agrosistemas del pas. Manejo que ha
ocasionado degradacin en todos los
componentes del sistema (Torres et al.,
2006; Lpez et al., 2008), Asimismo,
Arrieche y Mora (2005), sealan que una de
las limitaciones en la aplicacin de los
abonos orgnicos en el campo radica en la
disponibilidad del insumo por parte de los
productores. En este sentido, enmarcados en

este nuevo modelo de desarrollo, han surgido


alternativas basadas en el aprovechamiento
de los recursos autctonos y en el ciclaje de
nutrientes como son el uso de abonos
orgnicos: como estircoles, compost, lodos
residuales y biofertilizantes entre otros, por lo
tanto, algunas investigaciones tienen como
objetivo la seleccin y aislamiento de cepas
nativas para la produccin de biofertilizantes
con la finalidad de brindar una alternativa a
los productores con un bajo costo, que
garantice un mejoramiento del suelo y aporte
nutrientes para el desarrollo de sus cultivos a
fin de garantizar una produccin agrcola
sostenible.

muestras antes tomadas para estudios


posteriores, el estudio se dividi en dos
partes debido a que la muestra se tom a
partir de dos muestras diferentes. Se tomaron
cajas de medio Picovskaya:

MATERIALES Y MTODOS

Para hongos: Se tom 4 cajas y se inocul en


ellas 4 hongos aislados a partir de estas
muestras

1. Medio Pikovskaya: El medio pikovskaya es


un medio selectivo, el cual permite el
crecimiento nicamente de microorganismos
solubilizadores
de
fosforo;
para
la
preparacin de este se utiliz:
Sulfato de amonio (0,07gr), Cloruro de
potasio (0,03gr), Sulfato de magnesio
(0,01gr), Sulfato de manganeso (0,0005gr),
Cloruro de sodio (0,01gr), D-glucosa (1.3gr),
Sulfato de hierro (0,0003gr), Extracto de
levadura (0,07gr) y Agar-Agar (2,4gr) todo
esto en 135ml de agua destilada; se aforo a
150 ml utilizando Fosfato de calcio (0,0015gr)
en 15ml de agua destilada. Todo esto para
ocho cajas, los gramos de cada uno de los
componentes vara segn el nmero de cajas
de petri.
Se llev a autoclavar el medio utilizando una
autoclave (Modelo: 2540M NB 177073)
durante 30 minutos, una vez pasados se
sirve en las cajas de petri.
2. Siembra
de
microorganismos:
Los
microorganismos se tomaron a partir de

Parte 1: muestras tomadas a partir del


estudio de viabilidad:
Para bacterias: Se tom tres cajas al reverso
de esta se les realiz una divisin vertical y
horizontal, dividiendo de esta forma la caja
en cuatro secciones. De las muestras se
tom 10 bacterias y se inocularon en cada
una de las divisiones por la tcnica de
siembra en estra.

Parte 2: las muestras se tomaron a partir de


microorganismos aislados de la columna de
Winogradsky.
Para bacterias: Se tom cuatro cajas al
reverso de estas se les realiz una divisin
vertical y horizontal, dividiendo de esta forma
la caja en cuatro secciones. En total se
tomaron 16 bacterias las cuales se
sembraron por la tcnica de siembra en
estra.
Para hongos: Se aislaron 9 hongos a partir
de las muestras de columna de Winogradsky,
se inocularon cada uno en su respectiva caja.
Las bacterias se incubaron a 37C durante 24
horas, utilizando la incubadora (Fisher
Scientific DBB R/9799OD) Los hongos se
llevaron a temperatura ambiente.
3. Prueba para la presencia de halo: Para la
identificacin de la presencia o ausencia del
halo caracterstico para deducir si el

microorganismo es solubilizador o no, se


determin en los hongos por la presencia del
halo. Los hongos se sembraron a
temperatura ambiente durante dos das,
debido a que el micelio de los hongos a
medida que crece ocupa la mayor parte del
medio fue necesario tomar un control a los
dos das de inoculacin debido a que el
micelio an no se ha extendido. Para concluir
la presencia o ausencia del halo se us una
linterna al reverso de la caja, de esta manera
se observ la presencia del halo. Los hongos
que dieron positivo para esta prueba se les
realiz
identificacin
microscpica
y
macroscpica.
4. Caracterizacin
microbiolgica:
Los
microorganismos que presentaron actividad
solubilizadora de fsforo por medio de la
evaluacin del halo de hidrlisis se les realiz
su respectiva tincin; a los hongos se les
realizo tincin con azul de lactofenol el cual
permite observar correctamente y de una
manera ms clara las estructuras fngicas
(esporas, hifas, esporangio, etc), y a las
bacterias tincin de Gram; el cual se basa en
la caracterizacin de las bacterias segn su
pared celular y la cantidad de peptidoglucano
presentes en esta, adems se les realiz la
descripcin macroscpica.
5. Evaluacin cualitativa de la actividad
solubilizadora de fsforo: Se prepar caldo
de para 32 tubos. Se tom 10ml del medio y
se aadi a cada tubo de ensayo, se rotul y
se
tom
una
muestra
de
cada
microorganismo, obteniendo de esta manera
32 tubos inoculados; se realiz adems un
control el cual solo contena 10 ml del caldo
para medir el pH inicial. Se cultivaron a
temperatura ambiente durante 8 das,
pasados los 8 das se midi el pH de cada
uno de los tubos y el pH del tubo control con
un pHmetro (Orion Modelo 410A) ; de esta
forma si el pH se ve afectado es por la

presencia de actividad solubilizadora del


medio.
6. Evaluacin cuantitativa de la actividad
solubilizadora de fsforo: La evaluacin
cuantitativa de fosforo total se realiz por el
mtodo de absorbancia:
Determinacin
espectrofotomtrica
de
fosforo: La determinacin del fosforo se
determinara mediante un procedimiento
espectrofotomtrico, el mtodo consiste en la
reaccin del ion fosfato con molibdato (

MoO 4

) que da lugar a fosfomolibdato ([

PO 412 MoO 3
3 .

Este

ltimo

por

reduccin da lugar a un compuesto cuya


estructura se desconoce, denominado azul
de molibdeno. Como reducto se us el cido
ascrbico.
Diluciones: Para ello se procedi a la
realizacin de la solucin patrn, con el
propsito de disminuir la concentracin y
tener referencias para la realizacin de la
curva patrn, es importante recalcar que el
stock contena una concentracin de 50 ppm.

RESULTADOS
1. Siembra de microorganismos:

10

Algunos de los microorganismos sembrados


presentaron buen crecimiento en el medio
selectivo (Pikovskaya) y por ende se les
realizo su respectiva tincin, las colonias de
bacterias fueron identificadas correctamente
por medio de la tcnica de tincin de Gram y
realizndoseles adems una caracterizacin
macroscpica de sus colonias. (Tabla 1). Los
hongos que crecieron en el medio selectivo,
se les realizo tincin con azul de lactofenol y
se le realiz una descripcin macroscpica
de sus colonias y una microscpica de sus
estructuras fngicas. (Tabla 2). Por otro lado
algunos de los microorganismos aislados no
presentaron ningn tipo de crecimiento, por
tal motivo los que presentaron crecimiento se
reaislaron de tal forma que se evaluara la
presencia o no del halo de hidrlisis en caso
de los hongos, en las bacterias se determin
mediante el nivel de clarificacin del medio.
Los hongos reaislados se evaluaron dos das
despus de su siembra para observar de
esta forma el halo de hidrlisis.

2. Prueba de halo e hidrlisis del medio.


De los 13 hongos aislados solo dos de ellos
dieron positivo para la prueba de halo
(Figura.1 a y b), un tercer hongo presento
crecimiento muy extensivo en la caja Petri
(Figura. 1 c) por tal motivo no fue posible
observar el halo. Este mismo hongo presento
crecimiento en otras cuatro cajas (Figura 1 d)
y en todas su crecimiento se dio de una
forma extensiva por toda la caja Petri.
Las bacterias aisladas solo cuatro de ellas
presentaron una clarificacin total de medio
en comparacin con todas las otras cajas que
presentaban el medio mucho ms turbio.
Estas cuatro bacterias se reaislaron y se
incubaron durante 48 h a 37C (Figura 2).

11

manera caracterizar una de las cuatro


bacterias.

3. Caracterizacin microbiolgica:
Se les realizo caracterizacin macroscpica y
microscpica a las cuatro bacterias aisladas
a partir de la prueba de hidrlisis del medio
(Tabla 3), a los hongos que presentaron halo
para la prueba de solubilizacin de fsforo
(Tabla 4) y a los hongos que presentaban un
crecimiento macroscpico similar en varias
cajas de Petri para concluir si se trababa del
mismo o no (Tabla 5). La identificacin de los
hongos se realiz con la ayuda de Juan
Manuel Lpez Fitopatlogo
(Fig.3) La
identificacin de las bacterias se realiz
mediante bibliografas logrando de esta

12

5. Evaluacin cuantitativa:
Los resultados de la evaluacin cuantitativa
fueron los siguientes:

Curva Patron del P.


5

AB

f(x) = 0.08x - 0.18


R 1=0 0.95
20
30

40

50

60

concentracion ppm

Grafica 1: Curva Patrn

AB / Microorganismo
0.44
0.5
0.41
0.36 0.34
0.35
0.4 0.34 0.28
0.31
0.26
0.25
0.3
0.2
0.20.24
0.18
0.2
AB 0.1
0

Microorganismos
4. Evaluacin cualitativa:
Las pruebas cualitativas se determinaron por
la acidificacin de los medios lquidos de
pikovskaya
producido
por
los
microorganismos solubilizadores de fosforo.

13

Grafica 2: Relacin de la absorbancia con respecto a los microorganismos

pH / Microorganismo
7
8
5.1 5.6 5.1 5.4
6 3.7 4.1 3.6 4.1 3.5 3.6 3.5 3.5 4
DISCUSIN
4
2
pH 0

Grafica 1.
4: Relacin
entrede
pH yhalo
concentracin
de fsforodel
soluble en el medio
Prueba
e hidrlisis
comprobando que el microorganismos H11 posee buenas caractersticas
medio:
solubilizadora.

Microorganismos

Para esta prueba, solo dos hongos


presentaron hidrlisis del medio; la cual se
observ mediante la aparicin de un halo
alrededor del microorganismo, la variacin
del dimetro de este vari siendo ms grande
en el hongo 1 (H1) que en el hongo 5 (H5)
(Figura 1) la aparicin del halo se midi a los
dos das de haberse inculado, adems se
not el crecimiento de un hongo en varias
cajas de petri el cual no presentaba halo; al
respecto, Jones et al. (1991) y Whitelaw
(1999) mencionan que la ausencia de halos
de solubilizacin en los medios de cultivo
slido no necesariamente indica que el
microorganismo
carezca
de
habilidad
Grafica 3: Resultado de los pH arrojados por los microrganismos donde
se
solubilizadora, sino que posiblemente este
comprob la acidificacin del medio por procesos enzimticos.
tipo de medios son insensibles para detectar
la actividad
Concentracion con relacion al
pH de algunos microorganismos, por
tal motivo fue necesario evaluar no solo este
7 4
8
microorganismo que presentaba crecimiento
3.39
5.6
5.4 3
5.1
6 4.1 4.1 2.95 5.12.21
2.41
en la mayora de las cajas sino tambin el de
2.11
3.72.07
3.6 3.5
3.6
3.5
3.54
1.71 2
4
1.33
1.07
1
0.85 0.78
los 32 microorganismos que presentaron
0.29-0.04 0.25
0 Fosforo solubre (ppm)
pH 2
crecimiento; a estos microorganismos se les
0
-1
realiz prueba cualitativa mediante le
medicin del pH.

Microorganismos

2. Caracterizacin microbiolgica:

14

La
caracterizacin
microscpica
y
macroscpica
de
los
respectivos
microorganismos se realiz segn la
respectiva tcnica para cada uno de ellos
descrita en la metodologa, la cual permiti
identificar los microorganismos (Tabla 3, 4 y
5)
y con la ayuda de Juan Manuel,
Fitopatlogo; se logr la identificacin de los
hongos que presentaron halo; siendo
identificado el hongo 1 (H1) como Aspergillus
spp. el hongo 5 (H5) como Beauveria sp. y el
hongo que presento crecimiento en la
mayora de cajas (H3, H7, H1, H7 T1) pero
que no present halo fue identificado como
Trichoderma sp. (Figura 3). Algunos autores
como Cunnimgham y Kuiak 1992, mencionan
que existe la actividad fosfato solubilizadora
por diferentes hongos saprofitos del suelo
tales como Aspergillus niger, Penicillium bilaii,
P. simplicissimun, Trichoderma harzianum,
Cladosporium herbarum y hongos micorrizos,
principalmente del genero Glomus; lo cual
segn los resultados obtenidos confirma que
hongos como Aspergillus spp. y Trichoderma
sp. Son hongos solubilizadores de fsforo.
Los hongos solubilizadores ms estudiados
son Penicillium y Aspergillus (ChunChao et
al., 2007; ElAzouni, 2008; Pandey et
al., 2008). Uno de los mecanismos de
solubilizacin empleado por estos hongos es
la produccin de diversos cidos orgnicos,
como el ctrico, oxlico, mlico y glucnico, y
la quelacin de los minerales que forman los
complejos insolubles con el fsforo (Alam et
al., 2002; ChunChao et al., 2007; Dighton,
2007).
Mediante la caracterizacin macroscpica y
microscpica de las bacterias se logr
identificar una cepa como Pseudomona sp.
(Bacteria 15 N 3) Tabla 3, adems mediante
el uso de una linterna al respaldo de la caja
petri se observ que la cepa 15 daba visos al
contraste con la luz lo cual es caracterstico

de dicha cepa, segn Rodrguez et al. ,1999


entre
los
gneros
bacterianos
ms
estudiados por su capacidad para solubilizar
fosfatos se encuentran: Pseudomonas,
Bacillus,
Rhizobium,
Burkholderia,
Achromobacter, Agrobacterium, Microccocus,
Aerobacter, Flavobacterium, Azotobacter y
Erwinia
observando
una
cantidad
considerablemente mayor en la rizosfera, en
comparacin con el suelo no rizosferico, lo
cual permite confirmar el resultado obtenido.
3. Prueba cualitativa:
Al ser la prueba de halo muy poco viable se
realiz la prueba cualitativa mediante la toma
de pH de 32 microorganismos. El pH inicial
fue de 6,9 segn autores uno de los
principales motivos de la disponibilidad
limitada de Fosforo se debe a la unin de
aniones de fosfato con otros elementos, con
los que forma complejos poco solubles, como
los Fosfatos de hierro (FePC4) o aluminio
(AlPO4) en suelos acidos y fosfatos de calcio
[Ca3(PO4)2] en suelos alcalinos (Lavelle y
Spain, 2001; Deubel y Merbach, 2005). En
el caso nuestro se utiliz Fosfato de calcio lo
cual proporcion un medio alcalino sin
microorganismos, la actividad se bas en
medir la disminucin del pH que segn
autores indica la aparicin de ortofosfatos
viables a un pH de 6.5 ya que la precipitacin
de los fosfatos de aluminio y calcio
disminuyen (Sylvia et al., 2005) en nuestro
caso de calcio. Ademas segn otras
referencias las fosfatasas acidas excretadas
por las races de las plantas y los
microorganismos
hidrolizan
el
fosforo
organico liberando ortofosfatos que se
quedan en la rizosfera como fosforo
disponible; juegan un papel importante en el
incremento del fosforo disponible y el pH
ptimo para la actividad de la fosfatasa acida
es aproximadamente de 3.5 a 4.5. Las
fosfatasas alcalinas con un pH ptimo de 9-

15

11, que pertenecen al grupo de las


fosfomonoestereasas y las fosfodiestereasas
que incluyen nucleasas y fosfolipasas (Pant y
Warman, 2000), En el proceso de
solubilizacin ocurre debido a la produccin
de cidos grasos, estos microrganismos
fosato-solubilizadores son capaces de
sobrevivir en medios con fosfato de calcio
(Ca3PO4)2, estos microorganismo consumen
una parte y hacen soluble una porcin que
liberan al medio. El fosforo inorgnico
insoluble es dependiente del pH, por este
motivo encontramos una acidificacin en los
medios
indicndonos
actividad
de
solubilizacin, por tal motivo se seleccionaron
las cepas que presentaron un pH entre 4-5
siendo este el ptimo para la solubilizacin
del fosforo, determinando que los mejores
microorganismos son: H1, H5, H7, B13 y
B15.

4. Prueba cuantitativa:
Los microorganismos seleccionados son
aquellos que mejor solubilizan el fosforo
insoluble en un rango de pH 4-5.1 (Grafica 3)
esto se detecta utilizando un mtodo
colorimtrico. (Rittman, 2001).
Este mtodo es el de Molibdato, se utiliza
para la determinacin de fosforo soluble en
solucin acuosa, con el principio de la
formacin del cido fosfoantimolibdeno azul
en la presencia de cido ascrbico (Murphy
y Riley, 1962); en solucin sulfrica los iones
ortofosfato (fsforo soluble) reaccionan con
los iones molibdato, dando como resultado
cido molibdofosfrico, el cual se reduce por
el cido ascrbico a fosfomolibdeno
presentando al cabo de 5 minutos una
coloracin azul en la solucin. Es con esta
solucin con la que se puede cuantificar el
fsforo solubilizado en solucin, en el

espectrofotmetro (Del Hierro, 2010); los


resultados del espectrofotmetro se pueden
observar en la grfica 2.
Una ventaja de la utilizacin de este mtodo
es que solo necesita pequeas cantidades de
analito, una desventaja es que cuando
existen concentraciones muy bajas de fsforo
en la solucin no llega a cuantificarse por la
baja sensibilidad del mismo (Simbaa,
2010).
Segn bibliografas consultadas se pude
afirmar que aquellos microorganismos que
presenten una absorbancia alta es debido a
la cantidad de fosforo soluble liberado en el
medio, esto debe a que el microorganismos
toma el fosforo inorgnico insoluble (Fosfato
de calcio) y lo convierte en fosforo soluble; si
relacionamos el pH con la absorbancia
(grafica 4) obtenemos que el H11 presenta
mayor concentracin de fosforo soluble en el
medio donde el pH se encuentra acidificado
(3.6), debido probamente a la accin de las
fosfatasas acidas que se encuentran en un
pH de 3-4.

CONCLUSIONES
Se logr identificar 13 microorganismos con
posible
capacidad
solubilizadora,
determinado por la acidificacin de los
medios.
Se logr identificar 3 hongos con
capacidades solubilizadoras los cuales
fueron: Aspergillus spp,
Beauveria sp,
Trichoderma sp. De igual manera se logr
determinar una bacteria; Pseudonoma spp.

16

Se determin la concentracin de fosforo


soluble que exista en los medios por medio
del mtodo colorimtrico.

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