Anda di halaman 1dari 25

LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TANAMAN


"PEMBUATAN LARUTAN STOK DAN MEDIA MS
(Murashige & Skoog )"

NOPITA SARI
D1A012072
AGRONOMI H

FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS JAMBI
2014

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kultur jaringan tanaman adalah suatu teknik isolasi bagian-bagian tanaman,
seperti jaringan, organ, ataupun embrio, lalu dikultur pada medium buatan yang steril
sehingga bagian-bagian tanaman tersebut mampu beregenerasi dan berdiferensisi
menjadi tanaman lengkap.
Keberhasilan budidaya jaringan tanaman sangat dipengaruhi oleh media
tanamnya. Selain sebagai tempat tumbuh, media tanam merupakan penyedia unsur hara
dan zat-zat lain yang diperlukan eksplan untuk tumbuh. Seperti halnya dengan tanaman
utuh, jaringan tanaman juga memerlukan unsur hara makro dan unsur hara mikro.
Karena yang ditanam adalah sepotong kecil jaringan atau sekelompok sel, media tanam
haruslah dapat menyediakan bahan-bahan lain yang dapat mendukung pertumbuhan dan
perkembangan jaringan tanaman sehingga tanaman dapat melakukan regenerasi.
Hasil yang lebih baik dapat dijangkau atau diperoleh, bila ke dalam media
tersebut ditambahkan vitamin-vitamin, asam amino solid dan zat pengatur tubuh.
Walaupun sudah diusahakan untuk menghindarkan penggunaan komponen-komponen
yang tidak jelas (komponennya) seperti juice buah-buahan dan tauge, air kelapa, yeast
exstracts dan casein hydrolysate, tetapi kadang-kadang kita bisa memperoleh hasil yang
lebih tinggi dengan penambahan tersebut. Sebagai contoh, air kelapa masih sering
digunakan di laboratorium-laboratorium penelitian, sedangkan pisang masih merupakan
komponen tambahan yang sangat popular pada media anggrek.
Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor yang dapat menentukan
tingkat keberhasilan perbanyakan tanaman secara invitro, dalam hal ini adalah kultur
jaringan. Berbagai formulasi atau komposisi media tanam telah banyak ditemukan
untuk mmengoptimalkan pertumbuhan dan perkembangan tanaman yang dikulturkan.
Media biakan adalah bahan atau campuran bahan yang dapat digunakan untuk
membiakkan mikroorganisme karena memiliki daya dukung yang tinggi terhadap
pertumbuhan dan perkembangbiakannya. Dalam media semi sintetik selain bahan hasil
pertanian, digunakan pula zat-zat kimia yang komposisinya diketahui dengan tepat.

Berdasarkan hal tersebut di atas, maka perlu diadakan praktikum mengenai cara
pembuatan media kultur jaringan. Hal ini dimaksudkan agar segala hal yang diketahui
tentang kultur jaringan bukan hanya sekedar mengetahui tentang adanya kultur jaringan,
tetapi dapat membuat bibit tanaman melalui kultur jaringan. Agar semua yang diketahui
tentang kultur jaringan bukan sekedar teori, tetapi dapat diaplikasikan dalam praktikum
untuk dijadikan pengabdian kepada masyarakat.

1.2 Tujuan Praktikum


Tujuan dari praktikum pembuatan media kultur jaringan ini yaitu untuk
mengetahui sifat dan komposisi pembuatan media, untuk mengetahui teknik aseptic
pembuatan media, untuk mengetahui dan memahami rumus perhitungan larutan stok
dan mengetahui cara pembuatan larutan stok dan media tanam dari stok-stok bahan
kimia terutama untuk media MS.
Adapun kegunaannya yaitu sebagai bahan informasi bagi mahasiswa khususnya
mengenai pembuatan media kultur jaringan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Media Tanaman


Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.
Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan
diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan
hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.
Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya
maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan.
Media yang sudah jadi ditempatkan pada tabung reaksi atau botol-botol kaca. Media
yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf
(Suryowinoto, 1991).
Sebelum membuat media, terlebih dahulu dilakukan pembuatan larutan stok.
Larutan stok dibuat dengan tujuan untuk memudahkan pengambilan bahan-bahan kimia
khususnya yang dibutuhkan dalam jumlah kecil, tak perlu sering menimbang karena hal
ini kurang praktis. Larutan stok disimpan di dalam lemari pendingin agar tidak mudah
rusak dan mencegah terdegradasinya bahan-bahan kimia oleh mikroba penyebab
kontaminasi. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan stok
yang terlalu pekat akan mengalami pengendapan di lemari es, dan larutan stok yang
terkontaminasi tidak boleh digunakan lagi (Anonim2, 2012).
Dalam kultur jaringan, unsur-unsur diberikan tidak dalam bentuk unsur murni,
tetapi berupa senyawa berbentuk garam. Sebelum dicampurkan kedalam media tumbuh,
garam-garam mineral itu haruslah lebih dahulu dilarutkan dalam konsentrasi tertentu,
sehingga dalam media tumbuh nantinya jumlah tiap gram benar sesuai dengan
ketentuan sebagai pelarut dipakai akuades (Yuwono, 2008).
Untuk memenuhi faktor pertumbuhan tanaman, media kultur jaringan yang baik
mengandung (Anonim, 2011) :
1. Hara anorganik
Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa
hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan

normal dalam kultur jaringan, unsur unsur penting ini harus dimasukkan dalam
media kultur.
2. Hara organik
Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat
mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat
mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam
jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti
ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam
nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan. Selain bahan organik tersebut,
bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate,
air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain lain. Penambahan bahan kompleks
ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup,
semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan
suatu vitamin atau asam amino.
3. Sumber karbon
Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka
tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke
dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energi bagi pertumbuhan tanaman dan
juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang
diperlukan untuk tumbuh. Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 5% digunakan
sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa
dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk
menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman
dalam kultur.
4. Agar
Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan
menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel.Konsentrasi agar
yang digunakan berkisar antara 0.7 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi
sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat
buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih
murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan.
5. pH

Media biasanya diatur pada kisaran 5.6 5.8 tapi tanaman yang berbeda
mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih
tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2,
agar tidak dapat memadat.
6. Zat Pengatur Tumbuh
Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh.
7. Air
Distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab
menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi,
menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan
organik dan non-organik pada media.
8. Pemilihan Media
Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan
Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi
dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil.
Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 5 mgL-1.
Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin,
seperti NAA pada konsentrasi yang rendah.Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi
1 2 mgL-1 ditambahkan.
Komponen media kultur yang lengkap adalah sebagai berikut :
1. Air destilasi (aquades) atau air bebas ion sebagai pelarut atau solvent
2. Hara-hara makro dan ikro
3. Gula (umumnya sukrosa) sebagai sumber energi
4. Vitamin, asam amino dan bahan organic lain
5. Zat pengatur tumbuh
6. Suplemen berupa bahan-bahan alami
7. Agar-agar atau gelrite sebagai pemadat media

2.2 Jenis-jenis Media


Menurut Suryowinoto (1991), adapun jenis-jenis media kultur jaringan adalah
sebagai berikut :
a) Media Knop

Dapat juga digunakan untuk menumbuhkan kalus wortel. Kultur kalus, biasanya
ditumbuhkan pada media dengan kosentrasi garam-garam yang rendah seperti dalam
kultur akar dengan penambahan suplemen seperti glucosa, gelatine, thiamine,
cysteine-HCl dan IAA.
b) Media White
Dikembangkan oleh Hildebrant untuk keperluan kultur jaringan tumor bunga
matahari, ditemukan bahwa unsur makro yang dibutuhkan kultur tersebut, lebih
tinggi dari pada yang dibutuhkan oleh kultur tembakau. Unsur F, Ca, Hg dan S pada
media untuk tumor bunga matahari ini, sama dengan media untuk jaringan normal
yang dikembangkan kemudian. Konsentrasi NO3- dan K+ yang digunakan
Hildebrant ini lebih tinggi dari media white, tetapi masih lebih rendah dari pada
media-media lain yang umum digunakan sekarang.
c) Media Knudson dan media Vacin and Went
Media ini dikembangkan khusus untuk kultur anggrek. Tanaman yang ditanam
di kebun dapat tumbuh dengan baik dengan pemupukan yang hanya mengandung N
dari Nitrat. Knudson pada tahun 1922, menemukan penambahan 7.6 mM NH4+
disamping 8.5 mM NO3-, sangat baik untuk perkencambahan dan pertumbuhan biji
anggrek. Penambahan NH4+ ternyata dibutuhkan untuk perkembangan protocorm.
Media Nitsch & Nitsch, menggunakan NO3- dan K+ dengan kadar yang cukup
tinggi untuk mengkulturkan jaringan tanaman artichoke Jerussalem. Penambahan
ammonium khlorida sebanyak 0.1 mM, menghasilkan pertumbuhan jaringan yang
menurun.
Pertumbuhan sel dari jaringan suatu organ dibandingkan dengan jaringan tumor
tanaman Venca rosea (Catharanthus roseus), menunjukkan bahwa penambahan
ammonium ke dalam media White yang sudah dimodifikasi, mempunyai
pertumbuhan yang lebih baik. Konsentrasi NO3-, NH4-, K+ dan H2PO4- yang
diperoleh, hampir sama dengan yang dikembangkan oleh Miller.
d) Media Murashige & Skoog (media MS)
Merupakan perbaikan komposisi media Skoog, terutama kebutuhan garam
anorganik yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau.
Media MS mengandung 40 mM N dalam bentuk NO3 dan 29 mM N dalam bentuk
NH4+. Kandungan N ini, lima kali lebih tinggi dari N total yang terdapat pada media

Miller, 15 kali lebih tinggi dari media tembakau Hildebrant, dan 19 kali lebih tinggi
dari media White. Kalium juga ditingkatkan sampai 20 mM, sedangkan P, 1.25 mM.
Unsur makro lainnya konsentrasinya dinaikkan sedikit. Pertama kali unsur-unsur
makro dalam media MS dibuat untuk kultur kalus tembakau, tetapi komposisi MS ini
sudah umum digunakan untuk kultur jaringan jenis tanaman lain. Media MS paling
banyak digunakan untuk berbagai tujuan kultur pada tahun-tahun sesudah penemuan
media MS, sehingga dikembangkan media-media lain berdasarkan media MS
tersebut, antara lain media :
1. Lin & Staba, menggunakan media dengan setengah dari komposisi unsur makro
MS, dan

memodifikasi : 9 mM ammonium nitrat yang seharusnya 10mM,

sedangkan KH2 PO4 yang dikurangi menjadi 0.5 Mm, tidak 0.625 mM. Larutan
senyawa makro dari media Lin & Staba, kemudian digunakan oleh Halperin untuk
penelitian embryogenesis kultur jaringan wortel dan juga digunakan oleh Bourgin
& Nitsch (1967 dalam Gunawan 1988) dalam penelitian kultur anther.
2. Modifikasi media MS yang lain dibuat oleh Durzan et alI (1973 dalam Gunawan
1988) untuk kultur suspensi sel white spruce dengan cara mengurangi
konsentrasi K+ dan NO3-, dan menambah konsentrasi Ca2+ nya.
3. Chaturvedi et al (1978) mengubah media MS dengan menurunkan konsentrasi
NO3-, K+, Ca2+, Mg2+ dan SO4-2 untuk keperluan kultur pucuk Bougainvillea
glabra.
Senyawa-senyawa di dalam media MS dapat terjadi pengendapan
persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan
yang mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih
sedikit adalah Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang
mengandung unsur C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Setelah tujuh hari dibiarkan,
maka kira-kira 50% dari Fe dan 13% dari PO4+, mengendap (Dalton et al, 1983).
Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak penting, karena unsur-unsur
tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh pengendapannya
belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan grupnya
menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang
tetap.
e) Media Gamborg B5 (media B5)

Pertama kali dikembangkan untuk kultur kalus kedelai dengan konsentrasi nitrat
dan amonium lebih rendah dibandingkan media MS. Untuk selanjutnya media B5
dikembangkan untuk kultur kalus dan suspensi, serta sangat baik sebagai media dasar
untuk meregenerasi seluruh bagian tanaman.. Pada masa ini media B5 juga
digunakan untuk kultur-kultur lain. Media ini dikembangkan dari komposisi PRL-4,
media ini menggunakan konsentrasi NH4+ yang rendah, karena konsentrasi yang
lebih tinggi dari 2 mM menghambat pertumbuhan sel kedelai. Fosfat yang diberikan
setelah 1 mM, Ca2+ antara 1-4 mM, sedangkan Mg2+ antara 0.5-3 mM (Gamborg et
al, 1968).
f) Media Schenk & Hildebrant (media SH)
Merupakan media yang juga cukup terkenal, untuk kultur kalus tanaman
monokotil dan dikotil. Konsentrasi ion-ion dalam komposisi media SH sangat mirip
dengan komposisi pada media Gamborg dengan perbedaan kecil yaitu level Ca2+,
Mg2+, dan PO4-3 yang lebih tinggi. Schenk & Hildebrant mempelajari pertumbuhan
jaringan dari 37 jenis tanaman dalam media SH dan mendapatkan bahwa: 32 % dari
spesies yang dicobakan, tumbuh dengan sangat baik, 19% baik, 30% sedang, 14%
kurang baik, dan 5% buruk pertumbuhannya. Tetapi karena zat tumbuh yang
diberikan pada tiap jenis tanaman tersebut berbeda. Media SH ini cukup luas
penggunaannya, terutama untuk tanaman legume.
g) Media WPM (Woody Plant Medium)
Yang dikembangkan oleh Lioyd & Mc Coen pada tahun 1981, merupakan media
dengan konsentrasi ion yang lebih rendah dari media MS. Media diperuntukkan
khusus tanaman berkayu, dan dikembangkan oleh ahli lain, tetapi sulfat yang
digunakan lebih tinggi dari sulfat pada media WPM. Saat ini WPM banyak
digunakan untuk perbanyakan tanaman hias berperawakan perdu dan pohon-pohon.
h) Media N6
Media N6 mempunyai ciri perbandingan NH dan NO yang jauh
perbandinganya. Amonium yang diberikan dalam bentuk (NH)SO hanya sebanyak
363 mg/l, sedangkan KNO 2830 mg/l.

Seperti halnya peralatan kultur, media yang digunakan juga perlu dilakukan sterilisasi
untuk menciptakan kondisi lingkungan yang aseptic bagi eksplan. Untuk media kultur

yang tidak mengandung bahan-bahan yang Heat-labile, sterilisasi dilakukan dengan


autoklaf pada temperature 121Oc, tekanan antara 15 psi atau 1 atm dengan waktu antara
20-25 menit tergantung dari volume wadah dan volume media. Untuk 15-50 ml media
dalam tabung reaksi atau botol kecil berukuran 50-100 ml, sterilisasi dilakukan pada
tekanan 15 psi dengan waktu 20 menit. Untuk 20 botol volume 1 liter membutuhkan
waktu yang lebih lama yaitu 34 menit, 10 botol volume 2 liter memerlukan waktu 37
menit, 5 botol 4 liter waktu yang digunakan 52 menit. Dengan waktu yang lebih lama.
Dalam sterilisasi aquadest dan media, setelah waktu sterilisasi yang diinginkan
sudah tercapai, autoklaf tidak boleh diturunkan tekanannya secara mendadak. Bila
tekanan diturunkan mendadak, cairan didalamnya mendidih dan meluap (bubbled up).
Untuk bahan-bahan yang heat-labile dalam bentuk larutan, sterilisasi dilakukan dengan
menyaring larutan melalui filter yang mempunyai ukuran pori 0.20-0.22 um. Diameter
filter yang bermacam-macam tergantung dari volume larutan yang ingin disterilkan.
Untuk volume larutan 10 ml, dipergunakan filter yang dipasang di ujung jarum suntik.
Bahan yang heat labile antara lain : GA3, Thiamin-HCL, Ca-panthothenate, Antibiotik:
carbenocilin (Anonimous, 2009).

BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum Pembuatan Media ini dilaksanakan pada hari Jum'at tanggal 7
November 2014 pukul 10.00 WIB dan bertempat di Laboratorium Kultur Jaringan
Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Jambi.

3.2 Alat dan Bahan


Adapun alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas ukur, gelas
piala (ukuran 2 L), timbangan digital, hot plate dan termometernya, stirer, pH meter,
corong, botol kultur, karet dan plastik, dan pipet tetes.
Bahan-bahan yang diperlukan dan digunakan dalam praktikum pembuatan
media yaitu berupa bahan media MS yang isinya berupa :
1. Unsur hara makro :
KNO3

= 712,500 mg/l

NH4NO3

= 618,750 mg/l

CaCl2.2H2O

= 165,000 mg/l

MgSO4.7H2O

= 138,750 mg/l

KH2PO4

= 63,750 mg/l

2. Unsur hara mikro :


MnSO4.4H2O

= 8,363 mg/l

ZnSO4.7H2O

= 3,225 mg/l

KI

= 0,311 mg/l

Na2MoO4.2 H2O = 0,094 mg/l


CuSO4.5H2O

= 0,009 mg/l

3. Besi

FeSO4.7H2O

Na2-EDTA.2H2O = 13,975 mg/l

4.

= 10,425 mg/l

Vitamin
Mio-inositol

= 37,500 mg/l

Thiamin HCl

= 0,045 mg/l

Piridoksin HCl

= 0,195 mg/l

Glisin

= 0,045 mg/l

5. ZPT

Sitokinin

= 1 mg/l

Auksin

= 1 mg/l

6. Bahan pemadat (agar)

= 10,5 g/l

7. Sukrosa

= 45 g/l

8. KOH atau NaOH

=1M

9. HCl

=1M

3.3 Prosedur Kerja


1. Pembuatan larutan stok
a. Larutan stok A, merupakan larutan unsur hara makro
1. Menimbang pesenyawaan NH4NO3 sebanyak 20,625 gr
2. Memasukan bahan yang telah ditimbang tersebut ke dalam gelas piala bersih yang
telah berisi aquades atau air bebas ion kurang lebih 250 ml. Selanjutnya
melakukan pengadukan hingga larut merata dengan menggunakan hotplate, jika
berhasil larutan berwarna bening
3. Memindahkan larutan tersebut ke dalam botol dan ditutup dengan plastik dan
diikat dengan karet serta diberi label "A". Selanjutnya menyimpan larutan stok ke
dalam ruangan pendingin.
b. Larutan stok B KNO3 (23,750 gr)
c. Larutan stok C merupakan campuran KH2PO4 (8,500 gr), H3BO3 (0,310 gr), Kl (0,042
gr), Na2MoO4 . 2H2O (0,013 gr) dan CoCl2 . 6H2O (0,001 gr)
d. Larutan stok D merupakan CaCl2 . 2H2O (22,000 gr)
e. Larutan stok E merupakan campuran MgSO4 . 7H2O (18,500 gr), MnSO4 . 4H2O (1,115
gr), ZnSO4 . 4H2O (0,430 gr) dan CuSO4 . 5H2O (0,001 gr)
f. Larutan Stok F merupakan campuran Na2EDTA (1,865 gr) dan FeSO4 . 7H2O (1,390 gr)
** Untuk langkah kerja larutan stok B, C, D, E dan F hampir sama dengan larutan stok A
hanya berbeda dijumlah senyawa dan pemberian nama label.

2. Pembuatan Medium Kultur


a. Menimbang sukrosa (gulaku) sebanyak 45 gr dan agar-agar sebanyak 10,5 gr
b. Menyiapkan gelas piala berukuran 2000 ml (2 liter) lalu dimasukkan vitamin (15 ml),
sukrosa (45 gr) dan agar-agar (10,5 gr) serta larutan A (30 ml), larutan B (30 ml),
larutan C (7,5 ml), larutan D (7,5 ml), larutan E (7,5ml) dan Larutan F (7,5 ml)
c. Menambahkan aquades ke dalam gelas piala hingga mencapai volume 1500 ml
(dilebihkan sedikit untuk mengantisipasi larutan yang menguap)
d. Menghomogenkan larutan hingga merata dengan menggunakan Hot Plate dan
Magnetik stirrer dan ditunggu hingga mendidih kemudian diukur pH nya. pH larutan
diukur menggunakan pH meter elektrik hingga mencapai pH yang dibutuhkan yaitu
5,7 5,8. Jika terlalu asam tambahkan NaOH atau KOH 1 M, dan jika terlalu basa
tambahkan HCl 1 M.
e. Medium yang telah mendidih tersebut dituangkan ke dalam botol-botol kultur.
f. Botol kultur ditutup menggunakan plastik dan karet yang telah disterilkan dan
disimpan di ruang kultur.

Sterilisasi Media
a. Botol kultur yang sudah berisi medium dimasukkan ke dalam autoclave dengan tekanan
15 - 17,5 psi pada suhu 120 oC selama 20 menit, sampai tiga kali.
b. Botol diangkat dan disimpan dalam ruang inkubasi sampai siap digunakan.
c. Medium siap digunakan.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Praktikum


a. Pembuatan Larutan Stok
Komposisi Medium Murashige dan Skoog (MS) (1962) pada pH 5,6 - 5,8
Pemakaian
Stok

Senyawa

per liter stok


Stok

per liter medium

NH4NO3

20,625 gr

30,0 ml

618,750 mg

KNO3

23,750 gr

30,0 ml

712,500 mg

KH2PO4

8,500 gr

7,5 ml

63,750 mg

H3BO3

0,310 gr

2,325 mg

Kl

0,042 gr

0,311 mg

Na2MoO4 . 2H2O

0,013 gr

0,094 mg

CoCl2 . 6H2O

0,001 gr

0,009 mg

CaCl2 . 2H2O

22,000 gr

7,5 ml

165,000 mg

MgSO4 . 7H2O

18,500 gr

7,5 ml

138,750 mg

MnSO4 . 4H2O

1,115 gr

8,363 mg

ZnSO4 . 4H2O

0,430 gr

3,225 mg

CuSO4 . 5H2O

0,001 gr

0,009 mg

Na2EDTA

1,865 gr

FeSO4 . 7H2O

1,390 gr

7,5 ml

13,975 mg
10,425 mg

Myo-inositol

2,500 gr

15,0 ml

37,500 mg

Glisin

0,050 gr

0,750 mg

Niasin

0,013 gr

0,195 mg

Piridoksin-HCl

0,013 gr

0,195 mg

Tiamin-HCl

0,003 gr

0,045 mg

Sukrosa

45,000 mg

Agar - agar

10,500 mg

No. Gambar

Keterangan

1.
Proses pembuatan larutan stok

2.
Larutan stok yang telah selesai dan harus
disimpan di tempat yang dingin (kulkas)

b. Pembuatan Media MS
No. Gambar

Keterangan

1.
Penimbangan sukrosa (gula) sebanyak 45 gram

2.
Penimbangan agar-agar sebanyak 10,5 gram

3.
Memasukkan agar-agar (10,5 gr), sukrosa (45
gr), vitamin 15 ml, larutan stok A, B, C, D, E
dan F ke dalam gelas piala ukuran 2 liter lalu
ditambahkan aquades hingga mencapai 1500
ml

4.
Media yang telah mendidih (berwarna bening)
dan selanjutnya dipindahkan ke botol-botol
kultur

5.
Media yang telah dipindahkan ke botol-botol
kultur dan ditutup rapat dengan plastik dan
karet lalu disimpan atau disusun di ruang
kultur

4.2 Pembahasan
a. Pembuatan Larutan Stok
Media merupakan suatu bahan yang penting untuk pertumbuhan kultur. Media
untuk pertumbuhan kultur dapat berupa media padat dan media cair. Media padat
biasanya digunakan untuk mengkulturkan kalus kemudian diinduksi menjadi tanaman
lengkap, sedangkan media cair biasanya digunakan untuk kultur sel. Komponen yang
penting dalam suatu media adalah senyawa anorganik, sumber karbon, vitamin, zat
pengatur tumbuh, dan suplemen organik (Yuwono 2008).
Larutan Stok Media merupakan tempat tumbuhnya tanaman. Semua kebutuhan
yang diperlukan oleh tanaman untuk tumbuh dan berkembang harus terkandung dalam
media tersebut. Dalam media kultur jaringan (kuljar) telah tersedia unr makro, unsur
mikro, vitamin, hormon (zat perangsang tumbuh) dan lain-lain. Formula ini memang
memudahkan pekerjaan, tapi untuk suatu penelitian yang memerlukan perubahan
komposisi dalam satu atau beberapa komponen, maka pemisahan komponen-komponen
penyusun media perlu dilakukan. Secara umum kebutuhan nutrisi setiap tanaman sama,
tetapi secara khusus kebutuhanya berbeda. Kesamaanya adalah tanaman memerlukan
hara makro dan mikro, vitamin-vitamin, karbohidrat, asam amino dan N-organik, ZPT,
zat pemadat dan kadang ada penambahan seperti air kelapa, ekstrak ragi, jus tomat,
ekstak kentang, bufer organik maupun arang aktif. Kebutuhan tiap tanaman berbeda
pada hal komposisi dan jumlah yang diperlukan.

Pada praktikum kali ini yaitu pembuatan larutan stok. Diawali dengan
penimbangan media komponen penyusun larutan stok dengan menggunakan timbangan
analitik. Setelah dilakukan penimbangan sesuai dengan kebutuhan yaitu berdasarkan
kepekatan atau konsentrasi yang dinginkan, maka dilakukan proses pelarutan dengan
menggunakan aquades murni yang tidak mengandung ion. Untuk larutan stok yang
terdiri lebih dari satu persenyawaan maka proses pelarutan dilakukan pada tempat yang
berbeda hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya reaksi kimia antara masing-msing
persenyawaan misalnya reaksi penggaraman yang dapat meyebabkan degradasi atau
penurunan dari larutan stok itu sendiri.
Larutan stok A mengandung NH4NO3 sebanyak 1.650,000 mg. Untuk membuat
larutan stok A kita memerlukan 82,500 gr. Tetapi dalam praktikum ini hanya membuat
larutan stok A hanya 250 ml dengan kepekatan 50 saja, maka kami hanya memerlukan
NH4NO3 sebanyak 20,625 g (82,500 gr : 4). Pembuatan larutan stok A, yaitu dengan
menimbang NH4NO3 sebanyak 20,625 g, kemudian memasukkannya ke dalam gelas
kimia dan menambahkan akuades sekitar 250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan
magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut
sempurna, larutan persenyawaan tersebut dituangkan pada botol yang telah disiapkan
dan ditutup rapat kemudian diberi lebel A. Larutan harus terlarut sempurna agar pada
waktu diletakkan dilemari es tidak terjadi endapan. Biasanya larutan yang sudah
mengalami pengendapan, tidak dapat digunakan lagi. Pengendapan larutan stok
umumnya terjadi bila kepekatan dapat dihindari dengan membuat larutan yang tidak
terlalu pekat atau tidak menggunakan larutan campuran, yaitu dengan membuat satu
larutan stok hanya untuk satu jenis bahan (terutama untuk unsur hara makro). Kondisi
simpan juga diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu
tinggi atau cahaya.
Pembuatan larutan stok B, yaitu dengan menimbang KNO3 sebanyak 23,750 g,
kemudian memasukkannya ke dalam gelas kimia dan menambahkan akuades sekitar
250 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya
menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan
tersebut dituangkan pada botol dan diberi lebel B.
Pembuatan larutan stok C, yaitu masing-masing media dimasukkan ke dalam
gelas kimia secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing 30 ml, kemudian

sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate.


Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada
labu ukur secara berurut yaitu KH2PO4, H3BO3, KI, Na2MoO4.2H2O, dan CoCl2.6H2O,
supaya tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya
dengan menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah
ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi
lebel C.
Karena kami di dalam praktikum ini membuat larutan stok D hanya 250 ml
dengan kepekatan 50, maka kami hanya memerlukan CaCl2.2H2O sebanyak 22 g,.
Pembuatan larutan stok D, yaitu dengan menimbang CaCl2.2H2O sebanyak 22 g,
kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades sekitar
100 ml, kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya
menggunakan hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan
tersebut dituangkan pada labu ukur dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan
aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok
tersebut dipindahkan ke botol ditutup rapat kemudian diberi lebel D.
Pembuatan larutan stok E, yaitu dengan menimbang MnSO4.7H2O, MgSO4.7
H2O, kemudian memasukkannya ke dalam botol kultur dan menambahkan akuades

sekitar 250 ml. Larutan dimasukkan ke dalam botol yang terpisah, kemudian sambil
diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan hot plate. Setelah
larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut digabung pada labu ukur
secara berurut yaitu MgSO4 kemudian KH2PO4 supaya tidak terjadi penggumpalan atau
pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan menggunakan aquades sampai batas

250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka larutan stok tersebut dipindahkan ke
botol ditutup rapat kemudian diberi lebel E.
Larutan stok F mengandung FeSO4.7H2O dan Na2.EDTA sebanyak 1,865 g dan
1,390 g. Pembuatan larutan stok F, yaitu dengan menimbang FeSO4.7H2O dan Na2.EDTA
masing-masing sebanyak 1,865 g dan 1,390 g, kemudian memasukkannya ke dalam
gelas piala secara terpisah dan menambahkan akuades masing-masing sekitar 100 ml,
kemudian sambil diaduk meggunakan magnetic stirrer melarutkannya menggunakan
hot plate. Setelah larutan stok terlarut sempurna, larutan persenyawaan tersebut
digabung pada labu ukur secara berurut yaitu FeSO4.7H2O kemudian Na2.EDTA supaya

tidak terjadi penggumpalan atau pengendapan, dan ditepatkan volumenya dengan


menggunakan aquades sampai batas 250 ml. Setelah volumenya sudah ditepatkan maka
larutan stok tersebut dipindahkan botol ditutup rapat kemudian diberi lebel F.
Setelah selesai membuat larutan stok, larutan stok yang telah jadi disimpan
pada lemari pendingin secara berurutan (A-F). gelas Erlenmeyer tersebut (tempat
larutan stok) sebelumnya telah dibaluti dengan aluminium foil yang telah disterilkan.
Untuk penggunaannya dalam pembuatan media yaitu dengan cara mengencerkan
larutan stok yang telah dipipet sesuai dengan kebutuhan dengan menggunakan aquades.
Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat
waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media, mengatasi
kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil dan mengurangi kerusakan bahan kimia
akibat terlalu sering dibuka dan ditutup. Larutan stok dalam bentuk cair disimpan di
dalam lemari es. Pembuatan larutan stok harus dilakukan dengan cermat, sebab larutan
stok yang terlalu pekat akan mengalami penendapan di dalam lemari es. Jika terjadi
pengendapan, maka sebelum larutan stok digunakan terlebih dahulu harus dipanaskan.
Pembuatan media dikelompokan berdasarkan jenis bahan kimia yang
digunakan, sehingga jika bahan kimia tersebut dicampur tidak terjadi interaksi yang
menghasilkan senyawa baru. Biasanya pengelompokan dilakukan berdasarkan stok hara
makro, stok hara mikro, vitamin dan stok hormone, terutama jika larutan stok tidak
disimpan terlalu lama.
Senyawa-senyawa

di

dalam

media

MS

dapat

terjadi

pengendapan

persenyawaan, ini terlihat jelas pada media cair. Kebanyakan dari persenyawaan yang
mengendap adalah fosfat dan besi, kemudian dalam jumlah yang lebih sedikit adalah
Ca, K, N, Zn dan Mn. Senyawa paling sedikit adalah senyawa yang mengandung unsur
C, Mg, H, Si, Mo, S, Ca dan Co. Pengendapan unsur-unsur tersebut mungkin tidak
penting, karena unsur-unsur tersebut masih tersedia bagi jaringan tanaman dan pengaruh
pengendapannya belum diketahui. Untuk mengatasi pengendapan Fe, Dalton dan
grupnya menganjurkan supaya konsentrasi Fe dikurangi sampai 1/3 dengan EDTA yang
tetap (Dalton et al, 1983).

b. Pembuatan Media MS
Media Murashige & Skoog (media MS) merupakan media yang digunakan
hampir pada semua macam tanaman terutama herbaceous. Media ini memiliki
konsentrasi garam-garam mineral yang tinggi, terutama kebutuhan garam anorganik
yang mendukung pertumbuhan optimum pada kultur jaringan tembakau dan senyawa N
dalam bentuk NO3- dan NH4+.
Menurut Gamborg dan Shyluk (1981) dalam Gunawan (1988), sel-sel tanaman
membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,55,8. Pengaturan pH, biasa
dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL
pada waktu semua komponen sudah dicampurkan. Pada praktikum yang telah di
laksanakan dilakukan penambahan NaoH untuk mencapai pH netral.
Agar dapat mencukupi kebutuhan karbon, maka sukrosa harus ditambahkan
ke dalam media. Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena
mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya. Sumber karbon ini menyediakan
energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk
memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.
Bahan pemadat media yang digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah
campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur,
diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na
(Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992).
Smith (1992) menyatakan pemilihan media kultur jaringan merupakan kunci
sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian untuk
memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap berbagai macam
tanaman. Sumber karbon merupakan salah satu faktor yang sangat penting untuk
menentukan keberhasilan kultur jaringan selain kombinasi zat tumbuh (ZPT). Sumber
karbon berfungsi sebagai sumber energi yang dibutuhkan oleh sel untuk dapat
melakukan pertumbuhan (Kimball, 1994). Glukosa dan fruktosa sebagai hasil hidrolisis
sukrosa dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Konsentrasi sukrosa
berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus (Srilestari, 2005).
Pada praktikum yang kami lakukan penambahan NaOH pada larutan sebab pH
larutan berada di bawah kisaran pH yang dianjurkan yaitu sebesar 5,6 karena bahan
pembuat medianya kebanyakan golongan asam. Kemudian dilakukan pengukuran pH

dan ditetapkan sampai 5.8. Pengaturan pH dilkukan untuk menjamin ketersediaan


unsure hara bagi eksplan di dalam botol kultur. Karena pada praktikum ini, media yang
digunakan adalah media padat maka diperlukan bahan pemadat berupa agar. Agar yang
diberikan yaitu sebesar 10,5 gram dimasukkan kedalam larutan penyusun media dan
dipanaskan. Pengukuran pH tidak lagi dilakukan karena apabila larutan media yang
telah ditambahkan agar diukur pH-nya maka akan merusak pH-meter. Konsentrasi agar
yang terlalu tinggi dapat mengurangi difusi persenyawaan dari dan ke arah eksplan
sehingga pengambilan hara dan zat tumbuh berkurang, sedangkan zat penghambat dari
eksplan tetap berkumpul di sekitar eksplan. Setelah mencapai titik didih yang ditandai
dengan larutan berwarna bening dan terdapat gelembung maka larutan dituangkan ke
dalam botol-botol kultur. Kemudian botol ditutup dengan plastik dan diikat dengan
karet yang sebelumnya telah disterilkan dan dilakukan sterilisasi basah dengan
menggunakan autoclave selam 20 menit pada suhu 1200C dan pada tekanan 15 psi.
Setelah itu botol-botol kultur diletakan di dalam ruang kulur pada rak-rak yang telah
tersedia.

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :
Dengan adanya larutan stok dapat memberi keuntungan antara lain yaitu menghemat
waktu pekerjaan, menimbang bahan media setiap kali ingin membuat media,
mengatasi kesulitan menimbang dalam konsentrasi kecil.
Dari hasil praktikum dapat disimpulkan bahwa dalam proses pembuatan larutan stok
yang terdiri dari stok A-F melalui beberapa tahapan antara lain: penimbangan
persenyawaan, pelarutan senyawa kimia dengan menggunakan aquades, penetapan
volume akhir, pelabelan dan panyimpanan pada lemari es.
Sterilisasi merupakan suatu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau
benda dari semua mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan pada praktikum ini
dengan menggunakan senyawa kimia dan pemanasan uap air bertekanan (Autoklaf)
Media Murashige dan Skoog (MS Medium) adalah media yang khusus dibuat untuk
pertumbuhan kalus dalam kultur jaringan, tetapi bisa diapikasikan ke semua jenis
tanaman walau kurang spesifik.
5.2 Saran
Sebaiknya dalam praktikum pembuatan media menggunakan massa atau
konsentrasi senyawa yang sesuai agar tidak terjadi pengendapan pada botol stok dan
mahasiswa diberi waktu yang cukup untuk lebih mengenal dan memahami media-media
yang digunakan dalam kultur jaringan agar mahasiswa lebih memahaminya.

DAFTAR PUSTAKA
Gunawan, L.W. 1992. Teknik Kultur Jaringan Tumbuhan Pusat Antar Universitas
(PAU) Bioteknologi IPB Bogor. 165 hal.
Hendaryono dan Ir Ari Wijayani, 2007. Teknik Kultur Jaringan. Kanisius, Yogyakarta
Kimball, J.W. 1994. Biologi. Erlangga. Bogor
Lawalata, Imelda Jeanette.2011. Pemberian Beberapa Kombinasi ZPT Terhadap
Regenerasi Tanaman Gloxinia (Siningia speciosa) dari Eksplan Batang dan
Daun Secara In Vitr. J.Exp. Life Sci. Vol. 1 No. 2, Feb 2011.Ambon
Marlin, dkk. 2012. Penuntun Praktikum Kultur Jaringan. Fakultas Pertanian Universitas
Bengkulu, Bengkulu.
Nugroho, A dan H. Sugianto. 1997. Pedoman Pelaksanaan Tehnik Kultur Jaringan.
Penebar Swadaya, Jakarta.
Sitorus, Ertina Novaria, DKK. 2011. Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.)
Secara In Vitro Pada Media Murashige & Skoog Dengan Konsentrasi
Sukrosa Yang Berbeda. BIOMA, Juni 2011 ISSN: 1410-8801 Vol. 13, No.
1.Semarang
Smith, R.S. 1992. Plant Tissue Culture Techniques and Experiments. Academic Press.
USA.
Srilestari, R. 2005. Induksi Embrio Somatik Kacang tanah Pada Berbagai Macam
Vitamin dan Sukrosa. Ilmu pertanian Vol. 12. No. 1. Hal 43-51.
Yusnita, 2003. Kultur Jaringan Cara Memperbanyak Tanaman Srcara Efisien. P.T
Agromedia Pustaka, Tangerang.
Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman : Solusi Perbanyakan Tanaman Budidaya.
Bumi Aksara, Jakarta