Recoleccin de muestras

Los puntos de muestreo se determinaran en base al tamao y la accesibilidad

al pozo de
relave minero. Las muestras lquidas fueron colectadas en frascos de plstico
de
primer uso, con capacidad de 1 litro. Se colectaran aproximadamente 500 mL
de
muestra por cada punto.
Para cada punto de muestreo se determinar el pH de la muestra, preservadas
a una temperatura <10C y transportadas inmediatamente al laboratorio para
su procesamiento.

La recogida de muestras y el aislamiento bacteriano Para el aislamiento de

bacterias resistentes a arsnico, muestras de agua residual se obtuvieron de
Kala Shah Kakoo, Pakistn en el tornillo de tope botellas esterilizadas. Algunos
parmetros fsico-qumicos como el pH, la temperatura, el oxgeno disuelto y el
arsnico ( mg / mL) se midieron. About50m
Muestras de agua L se extendieron sobre Luria Bertani agarplates que
contienen 10 mg / L de arsenito para el aislamiento de bacterias resistentes a
arsnico (Shakoori et al., 2010). Despus de la incubacin Hof 24 a 37 C se
observ el crecimiento de bacterias.
Las colonias individuales se seleccionaron y estras sobre medio de agar Luria
Bertani que contiene 20 mg / L de arsenito. El agar Luria Bertani fue preparado
por mixing 5 g de cloruro de sodio, 5 g de extracto de levadura, 10 g de
triptona y 17 a 19g de agar por 1000 ml de agua, el pH del medio se ajust
entre 7,0 y 7,2. Despus de mezclar 100 ml de medio era tomada en un matraz
y se cubre con tapn de algodn. El medio se someti a autoclave a 15 libras
por pulgada cuadrada de presin 121 C durante 15 min. Despus de 24 h el
crecimiento de colonias bacterianas se oberved a 37 C de incubacin. Los
efectos de arsenito en crecimiento de las cepas bacterianas se comprob en
acetato mnima medio que contena g / L: 0,5 g de extracto de levadura, 0,2 g
de sulfato de magnesio (MgSO4), 5,0 g de acetato de sodio, sulfato frrico
0,001 g (FeSO4), 0,001 g de cloruro de calcio (CaCl2), 0,5 g de fosfato de
potasio (KH2PO4) y 1.0 g de cloruro de amonio (NH4Cl) en 1.000 ml de agua
destilada.

Despus de mezclar a fondo 5 ml de medio fue tomada en eachtest tubo y en

autoclave a 121 C, 15 libras de presin por pulgada cuadrada durante 15-18
min. Despus de la inoculacin bacteriana en tubos de ensayo de medio
mnimo de acetato se mantuvieron en una incubadora agitadora a 37 C
durante 24 h.
Concentracin inhibitoria mnima de cepas bacterianas
Para la determinacin de la concentracin mnima inhibitoria de las cepas
bacterianas 5 ml de medio mnimo de etilo se aadi en cada tubo de ensayo y
diferentes concentraciones de arsenito se aadieron a partir de 30 a 370 mg /
L. Ellos se inocularon y se incubaron a 37 C durante 24 h en agitacin
incubadora. Densidad ptica de cada aislamiento bacteriano se estim
mediante U El mismo proceso se repiti en Luria Bertani placas de agar y
observ el crecimiento de colonias bacterianas a diferentes concentraciones de
arsnico. Bsicamente en la placa de agar bacterias slo pueden acceder a los
nutrientes por debajo, y por lo tanto slo son capaces de crecer
horizontalmente en segundo lugar en superficie mtodo de la placa en relacin
al volumen de las bacterias contra el arsnico es muy bajo, mientras que en el
caldo que estn rodeados de nutrientes y de superficie a volumen relacin
tambin muy alta. Debido a esta razn caldo considerado asstandard mtodo
porque la concentracin mnima inhibitoria de bacterias en caldo es muy bajo
de agar

Identificacin de aislados bacterianos

Para la identificacin morfolgica de aislamientos bacterianos diferentes
pruebas se llevaron a cabo como la tincin de Gram, tincin rpida cido,
tincin endospora y la prueba de motilidad. Para la caracterizacin bioqumica
de las cepas bacterianas algunas pruebas como la catalasa, ureasa, hidratos de
carbono, la hidrlisis de gelatina, agar citrato pruebas se llevaron a cabo.
Algunas pruebas especficas se realizaron como prueba de Metil-Red Voges
Proskaure, MacPrueba Conkey agar, prueba de agar sangre, prueba el chocolate-agar para la
caracterizacin a nivel de especie de los aislamientos bacterianos (Brown,
2009). Para la caracterizacin molecular, el ADN genmico se purific usando
el kit de GenElute. As, con la ayuda de la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) del 16S rRNA se amplific utilizando cebadores de ARNr 16S (UNI-27F; 5'AAACTC-AAATGAATTGACGG-3 ', y

UNI-1492R; 5'-ACGGGCGGTGTGTAC-3 ') (Kim et al., 2012). La PCR se complet

con un paso inicial de desnaturalizacin a 94 C durante 5 min, seguido de 35
ciclos con la de desnaturalizacin a 94 C, recocido a 52 C y elongacin a 72
C durante 30 s, 40 s y 30 s respectivamente. La extensin final fue dado a 72
C durante 10 min. Despus de la amplificacin del producto de 16S rRNA
mediante el uso de PCR kit (Fermentas Co, Alemania)
se compar con secuencias conocidas en la base de datos GenBank (La base
de datos GenBank un acceso abierto, coleccin comentada de todas las
secuencias de nucletidos a disposicin del pblico y de sus traducciones de
protenas) para identificar especies ms relacionadas.