UNIVERSIDAD DE CHILE

MAGISTER EN CIENCIAS DE LA ACUICULTURA

DETECCIN Y ASOCIACIN DE LA PRESENCIA DE Piscirickettsia salmonis EN

RIN, HGADO, BAZO Y HECES DE SALMN COHO (Oncorhynchus kisutch)
BAJO CONDICIONES DE CULTIVO EN AGUA DE MAR

Tesis para optar el grado de Magister en Ciencias de la Acuicultura

EDERSON JUAN MONTALICO PONGO

Director de Tesis
JULIO JOS LARENAS HERRERA

Profesores Evaluadores
NELSON DAZ PREZ
JURIJ WACYK
JOS MANUEL YEZ
Evaluadora Externa
ANA SANDINO GARCA

SANTIAGO - CHILE
2015

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS AGRONMICAS
ESCUELA DE POSTGRADO

DETECCIN Y ASOCIACIN DE LA PRESENCIA DE Piscirickettsia salmonis EN

RIN, HGADO, BAZO Y HECES DE SALMN COHO (Oncorhynchus kisutch)
BAJO CONDICIONES DE CULTIVO EN AGUA DE MAR
Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de:
Magister en Ciencias de la Acuicultura
EDERSON JUAN MONTALICO PONGO
Calificaciones

FIRMA

Nelson Daz Prez

Dr. en Ciencias

...

Jurij Wacyk
Ingeniero Agrnomo. Ph. D.

....

Jos Manuel Yez

Mdico Veterinario, Dr.

...

....

...

....

DIRECTOR DE TESIS
Julio Jos Larenas Herrera
Mdico Veterinario. Mag.
PROFESORES EVALUADORES

EVALUADOR EXTERNO
Ana Sandino Garca
Dr. en Ciencias mencin Biologa

Santiago - Chile
2015

Financiamiento: Laboratorio Nacional de Referencia para el Diagnstico de

Enfermedades de Especies hidrobiolgicas, Unidad de Anatoma Patolgica.
Departamento de Patologa Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias.
Universidad de Chile

AGRADECIMIENTOS

Mis ms grandes agradecimientos al profesor Dr. Julio Larenas Herrera.

Por guiarme durante el desarrollo de este trabajo, apoyarme en todo momento y ser un gran
aporte en mi desarrollo como profesional.
A todos los compaeros del laboratorio de patologa de peces que siempre respondieron a
mis requerimientos y consultas.
Y a todas las personas que colaboraron desinteresadamente en el desarrollo de este
proyecto.

DEDICATORIA

Dedico este trabajo a mis padres que siempre creyeron en m

y me apoyaron incondicionalmente en todos
mis proyectos, contribuyendo
a alcanzar mis
metas.

NDICE
ndice de Contenido

Pgina

INTRODUCCIN. 1
REVISIN BIBLIOGRFICA. 2
HIPTESIS 8
OBJETIVOS.......... 8
Objetivo general... 8
Objetivos especficos 8
MATERIALES Y MTODOS. 9
1. Obtencin de frotis renales, hgado, bazo y heces.. 9
2. Anlisis de las muestras.. 10
3. Controles. 11
3.1 Control positivo... 11
3.2 Control negativo.. 11
4. Observacin del agente... 11
5. Registro de resultados. 11
6. Anlisis estadstico.

12

6.1 Comparacin de diferencias entre todas las muestras. 12

6.2 Medicin de la asociacin entre rganos y heces...

12

RESULTADOS ......

14

1. Deteccin de P. salmonis en rin, hgado, bazo y heces.. 14

2. Anlisis estadstico.

16

2.1 Determinacin del grado de asociacin entre las muestras de los rganos
y heces en forma conjunta mediante la prueba Q de Cochran (Q). 16
2.2 Anlisis para determinar la asociacin entre los rganos y heces de la
prueba Mc Nemar (2). 16
2.3 Resumen de asociaciones a la presencia de P. salmonis en frotis de
rganos y heces..

18

DISCUSIN. 19
CONCLUSIN 23
BIBLIOGRAFA.

24

ANEXOS.

31

ndice de Tablas

Tabla 1. Nmero de alevines de salmn coho segn deteccin por IFI de Piscirickettsia
salmonis en frotis renal y de heces 6
Tabla 2. Deteccin de Piscirickettsia salmonis mediante inmunofluorescencia indirecta
(IFI) en frotis de rin, hgado, bazo y heces de salmn coho. 14
Tabla 3. Porcentaje de positividad de P. salmonis en rganos y heces en salmn
coho.. 15
Tabla 4. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin e hgado de salmones
coho afectados por un brote de Piscirickettsiosis . 17
Tabla 5. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin y bazo de salmones coho
afectados por un brote de Piscirickettsiosis ...
17
Tabla 6. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin y heces de salmones
coho afectados por un brote de Piscirickettsiosis .. 17
Tabla 7. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de hgado y bazo de de salmones
coho afectados por un brote de Piscirickettsiosis . 17
Tabla 8. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de hgado y heces de de salmones
coho afectados por un brote de Piscirickettsiosis .... 18
Tabla 9. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de bazo y heces de salmones coho
afectados por un brote de Piscirickettsiosis 18
Tabla 10. Resumen de asociacin encontrada entre los rganos y heces de salmn
coho... 18

ndice de Figuras

Figura 1. La fotografa muestra signos clnicos propios de la piscirickettsiosis. Se observa

abundante cantidad de lceras correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados
en agua de mar 33
Figura 2. Frotis renal. Se observa abundante cantidad de microorganismos cocoides
correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados en agua de mar.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 1000X. 33
Figura 3. Frotis de hgado. Se observa abundante cantidad de microorganismos cocoides
correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados en agua de mar.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 1000X. 34
Figura 4. Frotis de bazo. Se observa abundante cantidad de microorganismos cocoides
correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados en agua de mar.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 1000X. 34
Figura 5. Frotis de heces. Se observa abundante cantidad de microorganismos cocoides
correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados en agua de mar.
Inmunofluorescencia indirecta (IFI). 1000X. 35

ndice de Grficos

Grfico 1. Porcentaje de positividad de P. salmonis en rganos y heces en salmn

coho 16
Grfico 2. Porcentaje de deteccin de P. salmonis segn la asociacin de rganos para el
diagnstico de piscirickettsiosis. 20

ANEXOS

Anexo 1. Protocolo inmunofluorescencia indirecta para la deteccin de Piscirickettsia

salmonis.....
32

RESUMEN

Piscirickettsia salmonis es el agente causal de piscirickettsiosis, la enfermedad ms

importante de la salmonicultura en Chile. El microorganismo se encuentra habitualmente
en rin, hgado, bazo, branquias, corazn, piel y encfalo, Al respecto, la OIE ha
establecido que para el diagnstico con la tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI),
se utilice de preferencia rin, hgado y sangre obtenido desde peces infectados. Sin
embargo, no existen antecedentes publicados que establezcan cuales son los rganos ms
adecuados para la deteccin del agente etiolgico.
En el presente trabajo se emplearon 19 peces de la especie salmn coho (Oncorhynchus
kisutch), con signos clnicos de piscirickettsiosis, provenientes de centros de cultivo en
agua de mar con brote de la enfermedad, ubicado en la Regin de los Lagos. Como
muestras se obtuvieron frotis de tejido renal, heptico, esplnico y de heces, para
posteriormente ser procesadas mediante (IFI) para la deteccin de P. salmonis.
Los resultados obtenidos demostraron la presencia de P. salmonis en todos los rganos y
heces de salmones coho, presentando mayor positividad el hgado y rin con un 68,4% y
52,6% respectivamente. Adems, la bacteria fue observada en heces en un 47,4%,
significando que la eliminacin va fecal del agente es posible en condiciones de cultivo, lo
que plantea nuevas estrategias epidemiolgicas.
Por otro lado en este estudio se demuestra que los rganos rin e hgado slo detectan el
78,9% de los peces positivos al agente. Al respecto, slo al utilizar los tejidos heptico,
esplnico y las heces se logra detectar el 100% de los peces positivos a P. salmonis. Estos
resultados pueden implicar una reformulacin de los mtodos diagnsticos actualmente
utilizados.

Palabras claves: Salmnidos, diagnstico, enfermedad, piscirickettsiosis.

ABSTRACT

Piscirickettsia salmonis is the causative agent of piscirickettsiosis, the most important

disease of salmoniculture in Chile. The microorganism is commonly found in kidney,
liver, spleen, gills, heart, skin and brain. In this regard, the OIE has established that for the
diagnosis with indirect fluorescent antibody test (IFAT), kidney, liver and blood obtained
from infected fish should preferably be used. However, there is no reported information
establishing the most appropriate organs for detection of the etiologic agent.
In this study 19 specimens of coho salmon (Oncorhynchus kisutch) with clinical signs of
piscirickettsiosis were used. They were obtained from seawater cultures with outbreak of
the disease, located in the Region de los Lagos. Smear samples were obtained from kidney,
liver, spleen and fecal tissues and then processed by IFAT for detecting P. salmonis.
The results obtained showed the presence of P. salmonis in all organs and feces of coho
salmon, presenting greater positivity in liver and kidney with 68.4% and 52.6%,
respectively. In addition, the bacterium was observed in 47.4% of feces, indicating that
fecal elimination of the agent is possible under culture conditions, posing new
epidemiological strategies.
Furthermore, in this study it is shown that kidney and liver detect only 78.9% of the fish
positive to the agent. In this regard, only when using liver and spleen tissues as well as
feces, detection of 100% of fish positive to P. salmonis is attained. These results may
involve a reformulation of the diagnostic methods currently used.

Key words: Salmonids, diagnosis, diseases, piscirickettsiosis.

INTRODUCCIN

En Chile, la salmonicultura se ha desarrollado con tal rapidez que actualmente se ha

transformado en uno de los sectores ms exitosos de la economa nacional (Bravo y
Midtlyng, 2007) y en el segundo productor del mundo de salmnidos de cultivo despus
de Noruega (Buschmann et al., 2009).
Entre las principales ventajas comparativas que Chile posee para el desarrollo de esta
industria, se destacan el clima y la geografa, que permiten cultivos en grandes
extensiones, y la calidad de sus aguas, ideales para los peces por su temperatura y
salinidad que permiten un adecuado desarrollo de las especies acucolas salmondeas
(Knapp et al., 2007).
Sin embargo, estas cualidades se han ido perdiendo con el tiempo, debido que al igual
que en otros pases, las enfermedades infecciosas tambin empezaron a constituir un serio
problema para la industria salmonera (Bravo y Midtlyng, 2007). Esta situacin ha tenido
un mayor impacto en la fase de engorda de estos peces, efectuada en el agua de mar o
estuarina, generando prdidas econmicas que anualmente exceden los 100 millones de
dlares (Bravo y Campos, 1989).
Las enfermedades bacterianas corresponden al 42,2% de las prdidas totales de la
salmonicultura en Chile (Bustos et al., 1994). Entre estas enfermedades se encuentran la
piscirickettsiosis, descrita por primera vez en Chile en 1989 (Bravo y campos, 1989;
Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). Esta enfermedad tiene como agente etiolgico
a Piscirickettsia salmonis, que es considerado el ms serio patgeno que afecta a los
salmones de cultivo en Chile (Bravo, 1994).
En la actualidad la piscirickettsiosis, no se ha podido controlar y esto es debido a la
escasa informacin que existe acerca de varios aspectos del ciclo de vida de la bacteria,
as como la virulencia, patogenia, medios de transmisin y medios de excrecin del
agente. Es por ello que la presente memoria de tesis busca aportar informacin acerca de
la distribucin de la bacteria en diferentes rganos y su posible eliminacin del agente va
fecal.
En la presente tesis se compar la presencia y asociacin de P. salmonis en muestras de
frotis renal, hgado, bazo y contenido intestinal, obtenidos de salmones coho
provenientes de centros de cultivo de la Regin de los Lagos, que presentaban brotes de
piscirickettsiosis. Para la deteccin del agente etiolgico se utiliz la tcnica de
inmunofluorescencia indirecta (IFI).

REVISIN BIBLIOGRFICA

Actualmente, la piscirickettsiosis es considerada como la principal causa de altas

mortalidades en las especies de salmnidos cultivadas en Chile, provocando anualmente
prdidas superiores a los cien millones de dlares. Adems, representa la causa
primordial y de mayor impacto econmico en la salmonicultura en Chile (Bravo et al.,
2005).
La piscirickettsiosis es una de las principales enfermedades infecto-contagiosas teniendo
un curso agudo o crnico en sus hospederos. Afecta, principalmente a las especies de
salmnidos como trucha arcoris (Oncorhynchus mykiss), salmn coho (O. kisutch),
salmn del Atlntico (Salmo salar), salmn chinook (O. tshawytscha), salmn japons
(O. masou) y salmn rosado (O. gorbuscha) (Leal y Woywood, 2007). Se sospecha que
el salmn coho es la especie ms susceptible (OIE, 2006). En su aparicin e impacto
coexisten una serie de factores propios del agente, de los mismos peces y de los sistemas
de cultivo a la que estn sometidas las especies (Leal y Woywood, 2007). El agente
etiolgico fue caracterizado por primera vez en 1990 por Fryer et al., quienes utilizaron
la lnea celular CHSE-214 sin antibiticos ni fungistticos para su aislamiento.
El agente etiolgico de la piscirickettsiosis es Piscirickettsia salmonis, la cual es una
bacteria patgena intracelular facultativa, aerbica, gram negativa, inmvil, acapsulada,
pleomrfica (aunque generalmente suele observarse como un cocoide) y difcil de
cultivar (OIE, 2006). Habitualmente se la observa agrupada en pares o en anillos y de un
tamao que vara de entre 0,5 a 1,5 m de dimetro (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al.,
1991; Bravo 1994), aunque se describe que puede generar variantes pequeas con
tamaos inferiores a 0,2 m (Rojas et al., 2008). El rango de temperatura ptima para la
multiplicacin de P. salmonis est entre los 15 y 18C, disminuyendo significativamente
su replicacin bajo los 10C y sobre los 20C, adems no se multiplica sobre los 25C
(Fryer et al., 1992).
La piscirickettsiosis se considera bsicamente una enfermedad de agua de mar, ya que en
este tipo de ambiente acutico es donde se han presentado prcticamente la mayora de
brotes; no obstante lo anterior, excepcionalmente la enfermedad se ha reportado en agua
dulce y en la literatura se describen dos hallazgos de este tipo en ambiente acutico, uno
de ellos comunicado por Bravo (1994) y el otro por Gaggero et al. (1995). Esta
enfermedad ha sido denominada de diversas maneras tales como: Sndrome de Huito,
Sndrome del salmn coho, Septicemia rickettsial del salmn (SRS) y
piscirickettsiosis (Austin et al., 2007; Leal y Woywood, 2007).

La bacteria se replica en vacuolas intracitoplasmticas de sus clulas hospederas,

formando un efecto citoptico (ECP) caracterstico. La multiplicacin bacteriana en la
lnea celular CHSE-214 se evidencia por la presentacin gradual de un ECP, que
comienza entre los 5 a 6 das post-inoculacin. El ECP se visualiza por la formacin
progresiva de grupos de clulas redondeadas, que aumentan tanto en tamao como en
nmero, similares a racimos de uvas, hasta lograr finalmente que la monocapa celular se
afecte completamente (Fryer et al., 1990; Garcs et al., 1991).
Los brotes de la enfermedad se presentan generalmente entre abril y agosto, 6 a 12
semanas despus que los smolts son transferidos a la fase marina del ciclo productivo,
llegando a durar hasta 10 semanas y luego declinar (Cvitanich et al., 1990). No obstante
lo anterior, la enfermedad se puede presentar en peces de todas las edades, incluso hasta
los tamaos comerciales (Corbeil y Crane, 2009). Al respecto, se ha propuesto que el
proceso de smoltificacin puede incrementar la susceptibilidad de los peces infectados
(Graumann et al., 1997). Originalmente, las epizootias surgan en el otoo y la primavera
de cada ao (Lannan y Fryer, 1994) cuando las temperaturas de agua fluctuaban entre los
9 y los 16C (Cvitanich et al., 1995; Lannan y Fryer, 1991), pero en los ltimos aos su
presentacin no ha tenido las caractersticas de estacionalidad anteriormente sealadas,
puesto que esta enfermedad se produce durante todo el ao (Monasterio, 2008).
El agente es eliminado por las heces, orina y bilis de los individuos afectados y una vez
en el ambiente es capaz de infectar a otros peces, siendo capaz de penetrar piel y
branquias intactas (Smith et al., 1999). Se desconoce hasta la fecha si existen vectores
marinos implicados en la transmisin. Al respecto, Correal (1995) describi la presencia
del agente, usando tcnicas de inmunofluorescencia indirecta, en el parsito hematfago
Ceratothoa gaudichaudii y en el ectoparsito Calligus sp. Adems la observ en
algunos peces tales como la Cabrilla (Paralabrax humeralis), Jurel (Trachurus
murphyi), Pejerrey (Basilichthis australis), as como en algunos moluscos y crustceos
como choritos (Mytilus chilensis), Picorocos (Balanus psitacci) y coppodos de la vida
libre (no identificados).
La transmisin horizontal ocurre tanto en agua salada como dulce. La transmisin vertical
ha sido experimentalmente documentada, pero su importancia epidemiolgica no es clara
(Larenas et al., 2003).
La patognesis de la piscirickettsiosis se inicia cuando las barreras fsicas de la piel y/o
branquias son superadas por la bacteria, produciendo zonas decoloradas en la piel que
luego pueden convertirse en lceras superficiales. La bacteria va hematgena alcanza
posteriormente el parnquima de numerosos rganos (Smith et al., 2004). La naturaleza
septicmica de la P. salmonis se demuestra tambin por la presencia de macrfagos
infectados visibles en los frotis de sangre de los peces enfermos (Fryer y Hedrick, 2003).
3

Los peces afectados presentan signos clnicos inespecficos, tales como un

desplazamiento cerca de la superficie, errtico, descoordinado, lento, y a veces en
tirabuzn, lo que refleja alteraciones en el sistema nervioso en estos individuos
(Cvitanich et al., 1991; Larenas et al., 1995; Larenas et al., 1996). Adems, se ha
descrito letargia, anorexia, choque contra las mallas de las balsas-jaulas y orillamiento
(Olsen et al., 1997; Larenas et al., 2000).
Las alteraciones macroscpicas externas ms relevantes incluyen oscurecimiento y
descamacin de la piel (Fryer et al., 1997; Larenas et al., 2005; Monasterio, 2008),
adems de lesiones en este tejido que comprenden desde pequeas reas de
solevantamiento hasta lceras hemorrgicas de hasta 2 cm de dimetro (Branson y Nieto
Diaz-Muoz, 1991). Tambin se describe la presencia de petequias y equimosis en la piel
de la base de las aletas, del vientre y de la zona perianal y en algunos casos, hemorragias
perioculares, que generalmente son bilaterales (Alvarado et al., 1990; Cubillos et al.,
1990). Un signo generalmente presente es la palidez branquial, consecuencia de una
anemia significativa. El hematocrito en los peces afectados puede disminuir hasta un 2%,
con un promedio de 18,5, siendo el rango normal de 35 a 50% (Fryer y Hedrick, 2003).
Internamente, se presenta severa inflamacin y necrosis en el rin, hgado, bazo,
intestino y tejido hematopoytico del rin inflamado y descolorido, adems de una
esplenomegalia. Tambin puede presentarse ascitis en la cavidad celmica y hemorragias
en la grasa visceral circundante al estmago, en la vejiga natatoria y en la musculatura
esqueltica (Almendras et al., 1997; Almendras et al., 2000; Fryer y Mauel, 1997).
El hgado se presenta plido y con ndulos blanquecinos, circulares y opacos de
alrededor de 5-6 mm de dimetro (Fryer y Lannan, 2005). Adems, puede mostrar un
aspecto moteado, debido a la presencia de pequeos ndulos subcapsulares
blanquecinos a amarillentos distribuidos difusamente en toda su superficie (Larenas et
al., 1995; Olsen et al., 1997). Tambin existe un aumento en el volumen del lquido
cefalorraqudeo, acompaado en muchos casos de congestin de las meninges (Larenas
et al., 1997).
En tanto, el rin exhibe prdida de su apariencia brillante, tornndose caf-grisceo
opaco (Alvarado et al., 1990) y aumento de su tamao (Branson y Nieto Daz-Muoz,
1991).
A nivel del bazo, se presenta esplenomegalia en diferentes grados, observndose en
reiteradas ocasiones las mismas lesiones blanquecinas descritas en el hgado (Mauel et
al., 2002; Cubillos et al., 1990; Fryer et al., 1990). Cabe recalcar que las lesiones
histopatolgicas ms severas se observan en el hgado, rin y bazo (Cvitanich et al.,
1990).
4

En el estmago, se encuentra un lquido transparente seromucoso (Alvarado et al., 1990;

Schfer et al., 1990), lo cual confiere la impresin de que el pez ha tragado agua (Bravo,
2000). El intestino generalmente no posee alimento (Austin et al., 2011; Venegas, 1996),
evidencindose enteritis en el tercio distal (Garcas et al., 2005); adicionalmente, el
lumen de esta vscera puede contener un gran volumen de mucus amarillento (Schfer et
al., 1990; Larenas, 1999). El corazn, en ocasiones, tambin presenta focos necrticos y
hemorragias petequiales de tipo difuso (Cubillos et al., 1990) y en un 2% de los peces
moribundos se observa la presencia de una pseudomenbrana que lo cubre, sugiriendo la
presencia de pericarditis (Cvitanich et al., 1991). Por la gran variedad de rganos que
presentan lesiones se puede desprender que esta enfermedad tiene una naturaleza
sistmica (Fryer y Hedrick, 2003), aunque ciertos tejidos tienen un dao ms severo,
como el inmunopoytico renal (Venegas et al., 2004) y el cardaco (Monasterio, 2008).
Las alteraciones histopatolgicas ms relevantes son necrosis, proliferacin del tejido
conectivo y alteraciones vasculares (Larenas et al., 1995; Manneschi, 2011). Adems, se
observa la formacin de trombos, invasin de clulas inflamatorias, aparicin de grnulos
basoflicos, as como la aprecia de fibrosis y edema del tejido hematopoytico renal
(Branson y Nieto Daz-Muoz, 1991; Larenas et al., 1997). Tambin se puede encontrar
macrfagos conteniendo organismos dentro del citoplasma, coagulacin intravascular,
inflamacin perivascular, pericarditis, endocarditis, lesin inflamatoria crnica en la
lmina propia del intestino, incremento del nmero de clulas granulares del estrato
granuloso intestinal e hiperplasia y fusin laminillar (Cubillos et al., 1990; Sernapesca,
2013; Stefansson et al., 1991).
Respecto a los mtodos de diagnstico, la manera de confirmar la presencia del patgeno
viable en los tejidos es mediante el aislamiento de este en diferentes lneas celulares o en
medios de cultivo libres de clula, como el descrito por Mauel et al. (2008). La
confirmacin de P. salmonis en cultivo celular puede hacerse mediante la prueba de
inmunofluorescencia indirecta (IFI) o por la prueba de la reaccin en cadena de
polimerasa (PCR) (OIE, 2006). Alternativamente, la bacteria puede detectarse en frotis de
tejidos teidos con Giemsa (OIE, 2006).
La tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) desarrollada por Lannan et al. (1991),
es actualmente la ms utilizada y ampliamente implementada en los laboratorios por ser
un mtodo rpido, simple y sensible para la deteccin del agente. No hay requerimientos
de estrictas condiciones de asepsia como es el caso del aislamiento. Se puede realizar esta
tcnica en frotis de tejidos o de sangre las que deben ser fijadas en metanol u otro fijador
citolgico. Las muestras no utilizadas deben ser almacenadas a -20C (Lannan et al.,
1991). Para el caso de P. salmonis al ser observada bajo el microscopio de fluorescencia
se ve de un color verde manzana y con su caracterstica morfologa cocoide,
5

destacndose su contorno lo cual le confiere una forma de anillo (Lannan et al., 1991;
Larenas et al., 1996).
La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) incorpora como primer anticuerpo
inmunoglobulina IgG de ratn anti P. salmonis y como segundo anticuerpo un IgG
comercial anti-ratn conjugado con isotiocianato de fluorescena (FITC) u otro
compuesto fluorescente. Al examinarlo con iluminacin de campo oscuro, en un
microscopio que tenga una luz ultravioleta, las partculas antignicas unidas al Ac
marcado se observan brillantes y fluorescentes. Adems, esta tcnica ha sido modificada
por Larenas et al. (1996) mediante el uso de microondas lo cual disminuye el tiempo
requerido para la incubacin del primer y segundo anticuerpo. Los resultados obtenidos y
la calidad de observacin alcanzada son buenas, sin afectar la sensibilidad y especificidad
de la prueba (Larenas et al., 2005).
Para la prevencin de esta enfermedad se recomienda algunos manejos en los planteles
productivos. Entre estos se describe: la disminucin en la densidad de la biomasa (Fryer y
Hedrick, 2003).
Segn Salinas (1998), en un trabajo experimental utilizando trucha arcoris que fueron
inoculadas con P. salmonis, se obtuvo como resultado positividad en la presencia del
agente en rin, orina, bilis y heces; significando esto la eliminacin y posterior
diseminacin del agente mediante va fecal.
De acuerdo a Larenas et al. (2005), en un trabajo experimental en alevines de salmn
coho, se diagnostic la presencia de P. salmonis en rin y heces, tenindose como
resultado que solo 1 alevn mostr positividad del agente en rin y heces; en 11 alevines
el agente fue encontrado en rin y no en heces; y en 11 alevines el agente se encontr
en las heces pero no en el rin; indicando en este ltimo caso que se logra eliminar y
diseminar el agente va fecal aun cuando en el rin resulte negativo a la presencia de P.
salmonis.
Tabla 1. Nmero de alevines de salmn coho segn deteccin por IFI de Piscirickettsia salmonis en
frotis renal y de heces.

Rin (+)
1
Heces (+)
11
Heces (-)
Total
12
+ : Presencia de P. salmonis
- : Ausencia de P. salmonis

Rin (-)
10
78
88

Total
11
89
100

En un trabajo realizado por Solis (2002), en reproductores macho y hembra de salmn del
Atlntico, salmn coho y trucha arcoris, afectados naturalmente por piscirickettsiosis; se
compar la presencia de P. salmonis en muestras de tejido renal y de fluido celmico o
seminal en hembras y machos respectivamente. La especie salmn coho fue la que
present el mayor porcentaje de positividad siendo las hembras eliminadoras del agente
por sus fluidos. Esto podra indicar que existe mayor probabilidad de encontrar a un
individuo positivo para su frotis renal que para su frotis de fluido celmico o seminal.
Segn la Organizacin Mundial de Sanidad Animal (OIE) (2006), indica que para
diagnosticar la piscirickettsiosis en peces afectados por la enfermedad, se recomienda
usar como muestras frotis o improntas tomadas directamente del rin (parte posterior);
en el caso de usar la prueba de inmunofluorescencia indirecta.
De acuerdo a los antecedentes descritos, hasta la fecha no existe alguna publicacin que
determine que muestra de rgano(s) es el ms adecuado para un correcto diagnstico de
la infeccin. Al respecto, actualmente como rganos de diagnstico son usados el tejido
renal y heptico, as como lo indica la OIE. Al respecto, en el presente trabajo se
diagnostic la presencia del agente en muestras de tejidos de rin, hgado, bazo y heces
de salmones coho cultivados en agua de mar, para posteriormente mediante una prueba
de asociacin establecer cules son los mejores rganos para el diagnstico.
Por otro lado, la excrecin de P. salmonis mediante las heces slo se ha demostrado en
truchas arcoris inoculadas va intraperitoneal en agua dulce; sin embargo hasta la fecha
no hay una publicacin que demuestre la va de eliminacin de la bacteria en la especie
salmn coho cultivada en agua de mar.
De acuerdo a lo anterior, en el presente trabajo se demostr mediante IFI que P. salmonis
se logra eliminar mediante las heces.

HIPTESIS 1

Existe presencia de Piscirickettsia salmonis en rin, hgado, bazo y heces de salmn

coho (Oncorhynchus kisutch), bajo condiciones de cultivo en agua de mar.

HIPTESIS 2

Existe asociacin de la presencia de Piscirickettsia salmonis entre los rganos y heces de

salmn coho que presenten signos clnicos de piscirickettsiosis.

OBJETIVOS

Objetivo General
Determinar la presencia y asociacin de la Piscirickettsia salmonis en el rin, hgado,
bazo y heces en salmn coho (Oncorhynchus kisutch) que presenten signos clnicos de
piscirickettsiosis.

Objetivos especficos
1. Determinar la presencia de la Piscirickettsia salmonis en rin, hgado y bazo
mediante la tcnica inmunofluorescencia indirecta (IFI).
2. Determinar la excrecin de Piscirickettsia salmonis en heces mediante la tcnica
inmunofluorescencia indirecta (IFI).
3. Determinar la asociacin de la presencia de Piscirickettsia salmonis entre rin,
hgado, bazo y heces de salmn coho.

MATERIALES Y MTODOS

El presente trabajo fue realizado en el Laboratorio Nacional de Referencia para el

Diagnstico de Enfermedades de Especies Hidrobiolgicas del Departamento de
Patologa Animal de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad
de Chile.

1. Obtencin de frotis renales, hgado, bazo y heces

Se emplearon 19 salmones coho (O. kisutch) en etapa adulta moribundos o muertos
correspondientes a la mortalidad del da, que presentaban signos clnicos de
piscirickettsiosis, provenientes de diferentes jaulas de un mismo centro ubicado en la
Regin de los Lagos-Chile, zona endmica de la enfermedad. El diagnstico de la
enfermedad fue realizado por la misma empresa de acuerdo a los protocolos sanitarios
propios y de acuerdo a la normativa de Sernapesca.
Los peces obtenidos fueron analizados mediante un estudio de necropsia para luego
obtener muestras de frotis de rganos y heces. Los peces vivos fueron previamente
eutanasiados mediante un golpe en la cabeza.
El procedimiento de necropsia se realiz en una balsa jaula techada y acondicionada para
realizar esta operacin. El proceso de necropsia se realiz de acuerdo a lo descrito por
Acua et al. (2014). Bsicamente esta consisti en realizar un corte abdominal ventral
desde la zona del oprculo hasta el ano, luego un segundo corte por el lado izquierdo del
pez que discurre desde la zona anal hasta el extremo superior del oprculo y un tercero
paralelo al oprculo que une a los dos cortes anteriores, de tal manera de facilitar el
muestreo de los rganos de inters y evitar una posible contaminacin cruzada.
Como muestras se tomaron frotis de tejido renal, hgado, bazo y contenido fecal. Para
obtener la muestra de rin, se realiz un corte longitudinal con un bistur en la regin
ms posterior del rin; luego se introdujo un cotn en la zona de la incisin.
Posteriormente se realiz el frotis en un portaobjetos debidamente rotulado indicando el
nmero de pez y rgano muestreado. El frotis se fij con un fijador citolgico
(Citofix)1. El procedimiento de toma de muestras del hgado y bazo fue de forma
similar que el rin. En el caso de la toma de muestra de las heces, se realiz con un corte

Laboratorio Linsan, Santiago, Chile

longitudinal en la parte posterior del intestino procedindose a realizar un frotis del

contenido intestinal.
Luego de obtenerse todas las muestras, stas fueron refrigeradas. Durante su transporte
desde el centro de cultivo hacia Santiago, se mantuvieron en un contenedor con bolsas de
hielo, para tratar de mantener la temperatura lo ms baja posible. Las muestras fueron
recibidas en el laboratorio en mencin y almacenadas a temperatura de refrigeracin
hasta su uso.

2. Anlisis de las muestras

Todas las muestras obtenidas fueron procesadas mediante la tcnica de
inmunofluorescencia indirecta, de acuerdo a lo previamente establecido por Lannan et al.
(1991) y modificada de acuerdo a los protocolos propios del laboratorio (Anexo N1).
Para el anlisis de las muestras se utiliz un kit comercial de inmunofluorescencia
indirecta (SRS-FluoroTest Indirecto2) para detectar la presencia de P. salmonis.
A cada muestra se aadi 10 L de solucin de trabajo (10-2 en PBS) del primer
anticuerpo anti-P. salmonis producido en ratn. Despus cada frotis se procedi a incubar
en una cmara cerrada, hmeda y oscura por 60 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente se realiz un lavado completo de la muestra con PBS (pH = 7,05), por 5
minutos.
En la etapa siguiente, se agreg a la muestra 10 L de solucin de trabajo (10-2 en PBS)
del segundo anticuerpo anti-ratn conjugado con isotiocianato de fluorescena. Los frotis
se incubaron en una cmara cerrada, hmeda y oscura por 60 minutos a temperatura
ambiente y posteriormente se sigui el mismo procedimiento anterior de lavado.
Los cubreobjetos se montaron usando un medio de montaje acuoso Fluorogel3. Para
visualizar las muestras en un microscopio de epifluorescencia se utiliz una longitud de
onda de 494 nm, utilizndose un aumento de 1000X.

2
3

Grupo Bios, Santiago, Chile

Empresa Fermelo, Santiago, Chile

10

3. Controles
3.1 Control positivo
Como controles positivos, se usaron frotis de una alcuota de cultivo celular CHSE214 infectada con P. salmonis (100% de efecto citoptico). Para confirmar la
presencia del agente se realizaron pruebas de tincin Giemsa, Gram, IFI y PCR.

3.2 Control negativo

Como controles negativos de la prueba se utilizaron frotis de mismos tejidos
provenientes de truchas arcoris clnicamente sanas que provenan de una piscicultura
ubicada en la Regin de Valparaso, zona la cual nunca se han presentado o
registrado brote de piscirickettsiosis. Para comprobar que estos frotis estuviesen
libres de la bacteria se realiz pruebas de Gram, IFI y PCR. Por otra parte, como
control negativo se utiliz frotis de cultivos celulares libres de la bacteria. Adems,
como control de especificidad se obvi el uso del primer anticuerpo en algunas
muestras.

4. Observacin del agente

Para visualizar la presencia de P. salmonis en las muestras, se utiliz un microscopio4 de
epifluorescencia con una longitud de onda de 494 nm. Para cada muestra se observaron
10 campos microscpicos con un aumento de 1000X, de acuerdo a los descrito por Smith
et al. (1999). Las muestras fueron clasificadas como negativas (-) o positivas (+). En este
ltimo caso, correspondi a la deteccin de a lo menos una bacteria dentro de los 10
campos visuales.

5. Registro de resultados
Los resultados obtenidos mediante IFI se encuentran en la Tabla N 2.

Nikon, modelo Optiphot-2, Tokio, Japn.

11

6. Anlisis estadstico
Los datos fueron analizados mediante las pruebas estadsticas no paramtricas Q de
Cochran y Mc Nemar (que usa la distribucin chi2).

6.1 Comparacin de diferencias entre todas las muestras

Primero se realiz la prueba de Cochran (Q), para comparar la presencia de P.
salmonis en los rganos y heces. Los resultados de la prueba fueron ordenados en un
tabla de dos vas que tiene N filas y k columnas, a los resultados positivos se les
asign el nmero 1 y a los negativos el nmero 0. La hiptesis nula (Ho) indica que
la probabilidad de obtener una respuesta positiva es la misma para cada una de las
cuatro muestras y la hiptesis alternativa (H1) seala que la probabilidad de registrar
una respuesta positiva para cada una de las cuatro muestras difiere. La frmula
utilizada para este modelo estadstico, se seala a continuacin (Siegel, 1956):

Donde:
X2Q

: Estadstico ji cuadrado de la prueba Q de Cochran.

: Nmero de tratamientos.

Gn

: Nmero total de respuestas de cambio de cada tratamiento positivas en la

columna.

Lc

: Nmero total de respuestas de cambio por individuo de la muestra.

6.2 Medicin de la asociacin entre rganos y heces

Para determinar la asociacin estadstica de la presencia de P. salmonis entre rganos
y heces, se utiliz el mtodo Mc Nemar (2) (Dawson-Saunders y Trapp, 1997;
Martin et al., 1997), permitiendo evaluar la concordancia que existe entre dos
tratamientos diferentes en un mismo grupo de individuos; utilizndose un nivel de
significancia de 0,05 para determinar la asociacin entre rganos y heces.

12

Para las determinaciones de las asociaciones, se utiliz una tabla de contingencia

agrupndose en pares de acuerdo a lo sealado por Thrusfield (1990) y Martin et al.
(1997). Una adaptacin de esta tabla se ilustra a continuacin:

Estado verdadero
Total
Infectado

No infectado

Infectado

a + b

No infectado

c + d

Resultado
de la Prueba

Total

a + c

b +d

a + b + c + d

Donde:
a : Son los rganos de los individuos que fueron detectados como positivos por la prueba
IFI y que son verdaderamente positivos.
b : Son los rganos de los individuos falsos positivos. La prueba diagnstica IFI los
define como positivos pero en realidad son negativos.
c : Son los rganos de los individuos falsos negativos. La prueba diagnstica IFI los
define como negativos pero en realidad son positivos.
d : Son los rganos de los individuos que fueron detectados como negativos por la prueba
diagnstica IFI y que son verdaderamente negativos.
a + c : Es el total de rganos verdaderamente positivos.
b + d : Es el total de rganos verdaderamente negativos.
a + b : Es el total de rganos de los individuos definidos como positivos por la prueba
diagnstica.
c + d : Es el total de rganos de los individuos definidos como negativos por la prueba
diagnstica.

13

RESULTADOS

1. Deteccin de P. salmonis en hgado, rin, bazo y heces

Todos los salmones presentaron signos y/o lesiones macroscpicas que han sido
descritas para la enfermedad. Dentro de estas se observ principalmente lceras
prominentes en la piel, palidez heptica y hemorragias en rganos abdominales.
Los resultados de positividad o negatividad de los rganos y heces obtenidas por medio
de la tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la totalidad de las muestras, se
muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Deteccin de Piscirickettsia salmonis mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) en frotis
de rin, hgado, bazo y heces de salmn coho.
RGANOS
PEZ
RIN

HGADO

BAZO

HECES

10

11

12

13

(contina)

14

(Continuacin)
RGANOS
PEZ
RIN

HGADO

BAZO

HECES

14

15

16

17

18

19

Total positivos

10

13

Total
negativos

15

10

TOTAL

19

19

19

19

% positivos

52,6

68,4

21,1

47,4

+ : Presencia de Piscirickettsia salmonis

- : Ausencia de Piscirickettsia salmonis

En la Tabla 3 se muestra un resumen de la sumatoria de positividad, negatividad y el

porcentaje de positividad de los rganos y heces encontrados a la presencia de P.
salmonis. Para el total de muestras (n=19), se obtuvo un 52,6% de positividad a P.
salmonis en rin, un 68,4% en hgado, un 21,1% en bazo y un 47,4% en heces.
Tabla 3. Porcentaje de positividad de P. salmonis en rganos y heces en salmn coho.

+
% Positividad

Rin
10
9
52,6 %

Hgado
13
6
68,4 %

Bazo
4
15
21,1 %

Heces
8
11
47,4 %

15

En el siguiente Grfico 1 se muestra a manera ilustrativa los resultados de la Tabla 2

Grafico 1. Porcentaje de positividad de P. salmonis en rganos y heces en

salmn coho

2. Anlisis estadstico
2.1 Determinacin del grado de asociacin entre las muestras de los rganos y heces
en forma conjunta mediante la prueba Q de Cochran (Q)
Para este clculo se emplearon los resultados de la tabla 2. En el caso de las muestras
analizadas el valor fu de Q = 5,95. Este valor es superior al valor crtico de Q = 5,9;
definido para todas aquellas pruebas con un grado de libertad y un nivel de
significancia de un 5%. Por lo tanto, al caer en la regin de la hiptesis nula, se
rechaza la hiptesis alternativa que significa que los resultados entregados por las
pruebas difieren al ser analizados en forma conjunta.

2.2 Anlisis para determinar la asociacin entre los rganos y heces a travs de la
prueba Mc Nemar (2)
Para calcular estas asociaciones estadsticas se construyeron las siguientes tablas de
contingencia agrupando los rganos en pares (Tablas 4 a 9).

16

Tabla 4. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin e hgado de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

+
TOTAL
Valor 0,125 (p > 0,01)
HGADO

RIN
+
7
3
10

5
4
9

TOTAL
12
7
19

Tabla 5. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin y bazo de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

+
BAZO
TOTAL
Valor 3,27 (p > 0,01)

RIN
+
2
8
10

3
6
9

TOTAL
5
14
19

Tabla 6. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de rin y heces de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

+
HECES
TOTAL
Valor 0,36 (p > 0,01)

RIN
+
4
6
10

5
4
9

TOTAL
9
10
19

Tabla 7. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de hgado y bazo de de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

+
BAZO
TOTAL
Valor 7,69 (p < 0,01)

HGADO
+
2
11
13

2
4
6

TOTAL
4
15
19

17

Tabla 8. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de hgado y heces de de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

+
TOTAL
Valor 1,23 (p > 0,01)
HECES

HGADO
+
4
8
12

5
2
7

TOTAL
8
11
19

Tabla 9. Deteccin de Piscirickettsia salmonis en frotis de bazo y heces de salmones coho

afectados por un brote de Piscirickettsiosis.

HECES

+
TOTAL

BAZO
+
2
3
5

7
7
14

TOTAL
8
11
19

Valor 0,9 (p > 0,01)

2.3 Resumen de asociaciones a la presencia de P. salmonis en frotis de rganos y

heces
En la Tabla 10, se resumen los resultados obtenidos al determinar la asociacin
existente entre los rganos y heces de salmn coho.
Tabla 10. Resumen de asociacin encontrada entre los rganos y heces de salmn coho.

RIN
RIN
HGADO
BAZO
HECES
SI : Si hay asociacin
NO : No existe asociacin

HGADO
SI

BAZO
SI
NO

HECES
SI
SI
SI

18

DISCUSIN

Para el caso de la salmonicultura chilena, la piscirickettsiosis se ha constituido en la

principal enfermedad que ha provocado prdidas econmicas cuantiosas a la industria por
concepto de mortalidades, costos en tratamientos y en ciertos casos ms extremos, por la
eliminacin completa de stocks afectados (Fryer et al., 1992). Esta enfermedad
contina siendo difcil de controlar y se requiere mayor investigacin del ciclo de vida
del agente etiolgico para desarrollar estrategias efectivas de control (Rozas y Enrquez,
2014).
La fuente y reservorios de P. salmonis en el ambiente natural, as como el modo de
transmisin an se desconocen (Rozas y Enrquez, 2014). Si bien se ha determinado que
no existe necesidad de vectores para la transmisin de la bacteria en el mar (Olivares et
al., 2010).
Dentro de los mtodos de diagnstico utilizados, el ms concluyente es la inoculacin de
lneas celulares, pero la contaminacin de este medio es altamente probable. Otras
tcnicas descritas para detectar al agente son: tincin de Gram, Giemsa, azul de toluidina
y naranja de acridina. Por otra parte segn la OIE, como mtodo de diagnstico se
recomienda usar la tcnica de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos (IFI) o la
prueba de reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
En la presente tesis se utiliz el mtodo de diagnstico de inmunofluorescencia indirecta
(IFI) de acuerdo a lo descrito por Lannan et al. (1991). Dicha prueba se realiz con una
mezcla de anticuerpos monoclonales de origen comerciales lo que le confiere una mayor
sensibilidad en los resultados de diagnstico, por estar dirigida contra un amplio grupo de
eptopes de P. salmonis.
La OIE (2006) ha establecido que al usar la tcnica de inmunofluorescencia para el
diagnstico de la infeccin, hay que utilizar rin e hgado, ello basado en publicaciones
donde se describe la histopatologa de la enfermedad. Sin embargo, hasta la fecha no
existe ningn trabajo que indique cual o cuales son los mejores rganos para diagnosticar
a los animales infectados.
En la presente tesis, se analizaron un total de 19 salmones coho que provenan de un
centro de cultivo en agua de mar con brote de piscirickettsiosis. Los peces fueron
analizados para la deteccin de P. salmonis a travs de la prueba diagnstica de
inmunofluorescencia indirecta.

19

En el presente trabajo, se comprob que los rganos que presentaron mayor positividad al
agente etiolgico mediante IFI, fueron el hgado, rin y heces con un 68,4%, 52,6% y
47,4%, indicando que ningn rgano en forma independiente es capaz de detectar el
100% de los animales con piscirickettsiosis, por ello es necesario asociar los rganos para
un efectivo diagnstico de la enfermedad.
Para analizar los resultados independientemente de la prueba estadstica, se asociaron los
rganos tomndose las muestras en pares y de a tres, lo que se muestra en el grfico 2,
para establecer cul es la mejor asociacin capaz de detectar el 100% de los animales
infectados con P. salmonis.

Grfico 2. Porcentaje de deteccin de P. salmonis segn la asociacin de

rganos para el diagnstico de piscirickettsiosis

De acuerdo al grfico 2, se muestra que la asociacin de rin e hgado slo es capaz de

detectar el 78,9% de los animales positivos al agente; por otro lado se demuestra que la
asociacin de hgado, bazo y heces detect el 100% de los animales infectados. Esto no
concuerda con que establece la OIE, que indica que los mejores rganos para diagnosticar
la piscirickettsiosis son slo rin e hgado.
Salinas et al. (1998), demostr que las vas de eliminacin de P. salmonis en peces con
signologa son la orina y bilis. Por otro lado, durante el muestreo para este trabajo, se
observ que la lesin macroscpica ms prominente eran las lceras de la piel. Al
respecto, hasta la fecha no se ha realizado un estudio que demuestre si las lceras puedan
ser otra va de eliminacin del agente. Al respecto, los trabajos experimentales publicados
por Smith et al. (1999) han demostrado la presencia de la batera en abundante cantidad
en la dermis.
20

En un trabajo realizado por Larenas et al. (2005), en alevines de salmn coho se

realizaron frotis de rin y de heces obtenindose como resultado mediante IFI 12% y
11% de positividad a P. salmonis respectivamente. Al respecto, en el presente trabajo
tambin realizado en salmn coho pero en etapa adulta se obtuvo 52,6% para el rin y
47,4% en heces. Estas diferencias, obtenidos en la misma especie, podran estar dadas por
la etapa fisiolgica del pez.
Por otra parte, Salinas et al. (1998), inocul va intraperitoneal (IP) a 50 truchas arcoris
con el agente, demostrando a manera experimental y en agua dulce, que las truchas
logran eliminar la bacteria va fecal en un 32%, adems de establecer la existencia de
transmisin horizontal. En el presente trabajo se demostr que los peces excretan P.
salmonis va fecal en condiciones de cultivo en agua de mar, lo cual puede indicar que
posiblemente este medio sea una va de transmisin.
Este trabajo demuestra la eliminacin de P. salmonis va fecal al medio marino; pero al
respecto, es necesario establecer si el agente es viable y logra afectar a otras especies
susceptibles, tanto salmnidos como no salmnidos. Al respecto. Correal (1995),
demostr la presencia de P. salmonis en peces silvestres como pejerrey (Basilichthis
australis), rbalo (Eliginops maclovinus), cabrilla (Paralabrax humeralis), merluza
(Merluccius sp.), jurel (Trachurus murphy), as como tambin en moluscos y crustceos
como choritos (Mytilus chilensis).
La deteccin de la eliminacin de P. salmonis va fecal mostrada en este trabajo podra
representar un indicador para estudiar a futuro una deteccin temprana de la infeccin
antes que aparezcan los brotes de piscirickettsiosis y de tal manera poder realizar un
tratamiento rpido y oportuno para su control.
Segn Shannon et al. (1996), existen algunas bacterias, que afectan a las especies de
salmnidos y no salmnidos, que son capaces de sobrevivir en el estmago para
posteriormente crecer y multiplicarse en el intestino, como en el caso de Vibrio
anguillarum, agente causal de la vibriosis en los salmnidos. Este agente es capaz de
soportar el bajo pH y a las enzimas encontradas en el estmago, para posteriormente
desarrollarse en el intestino y ser eliminado va fecal. Al respecto, no existe publicacin
que indique si P. salmonis es capaz de sobrevivir y soportar el bajo pH y a las enzimas
encontradas en el estmago para posteriormente ser eliminada va fecal y ser viable e
infectar as a otros peces.
En el trabajo realizado por Salinas et al. (1998), se encontr que peces inoculados con P.
salmonis que no presentaban signos clnicos resultaban positivos al agente en rin,
heces, orina y bilis. En la presente tesis se utiliz peces que presentaban signologa,
encontrndose positividad al agente en todos ellos. Al respecto, sera interesante
21

establecer si los salmones cultivados infectados en el mar pero clnicamente sanos

tambin logran eliminar P. salmonis va fecal.
En el presente trabajo, se determin la excrecin va fecal del agente en salmn coho, si
bien el modo por el cual la bacteria llegara al material fecal de los peces infectados se
desconoce. Al respecto, en un estudio para conocer las vas de excrecin de P. salmonis,
Salinas et al. (1998) demostr la presencia del microorganismos en rin, heces, orina y
bilis en truchas arcoris experimentalmente infectados y cultivadas en agua dulce. De
acuerdo a ello, la bacteria podra ingresar al intestino y posteriormente ser eliminado va
fecal por medio de la bilis. Por otra parte, no se puede descartar la eliminacin por la
orina. Por ello, sera recomendable realizar un estudio entre rin y orina de salmnidos
de cultivo en agua de mar, determinando la asociacin de la presencia del agente y la
posible eliminacin va renal.
Segn un trabajo de Solis (2002), realizado en reproductores de salmn coho, salmn del
Atlntico y trucha arcoris se compar la presencia de P. salmonis en tejido renal, fluido
seminal y celmico en macho y hembra respectivamente. Se encontr que en el salmn
del Atlntico haba positividad al agente en tejido renal y no en fluido seminal ni
celmico; para el caso de la trucha arcoris no se encontr el agente en el tejido renal y si
en el fluido celmico y seminal; y para el salmn coho se present positividad en ambos
tejidos, indicndose diferencias por especies de salmnidos. Al respecto, sera interesante
comprobar si los resultados obtenidos en este trabajo son extrapolables a otras especies de
salmnidos cultivados en Chile.
Los resultados de asociacin de la presencia de la P. salmonis mediante IFI en las
muestras de los rganos hgado, bazo y heces encontrados en el presente trabajo,
proporcionan un importante avance y ayuda, permitiendo una mayor precisin
diagnstica de la infeccin y por lo tanto representar una manera ms eficiente a la
posterior presentacin del cuadro clnico de piscirickettsiosis. Sin embargo, sera
recomendable la generacin de mayores datos para perfeccionarlos y profundizar la
validacin de stas, sobre mayores poblaciones que representen la mayor cantidad de
variables de cultivo presentes en los centros de salmonicultura en Chile.
Finalmente este trabajo permite confirmar la eliminacin de P. salmonis por las heces en
salmones coho cultivado en agua de mar, lo cual slo se haba observado de forma
experimental. Por lo tanto, es posible pensar que el agente es viable y existe el riesgo de
transmisin horizontal hacia otras especies susceptibles. Adems, la excrecin del agente
va fecal puede representar un medio de deteccin temprana antes que aparezca un brote
de piscirickettsiosis que afecta a los centros de cultivo en Chile.

22

CONCLUSIN

Piscirickettsia salmonis mediante IFI se detect en todos los rganos estudiados y heces
de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) cultivados en agua de mar.
Se encontr una mayor frecuencia del agente en el hgado con un 68,4% de positividad y
en segunda instancia el rin con un 52,6%, indicando que ninguno de los dos rganos
fue suficiente para detectar el 100% de los peces positivos a P. salmonis.
El presente trabajo demuestra que en conjunto frotis de hgado, bazo y heces, es posible
detectar el 100% de los peces infectados con la bacteria.
Piscirickettsia salmonis se encontr por primera vez en las heces de salmn coho que
presentaban lesiones macroscpicas de piscirickettsiosis provenientes de un cultivo en
agua de mar.
Estadsticamente se encontr asociaciones entre todos los rganos a excepcin de entre el
hgado y bazo.

23

BIBLIOGRAFA

ACUA, M.; LARENAS, J. y OLIVARES, R. 2014. Manual de anatoma y

procedimientos diagnsticos en salmnidos. 2013-2014 Ed.FAVET - Universidad de
Chile. Santiago. Chile. [en lnea] <http://es.calameo.com/read/00081361607494ca4a527>
[consulta: 15 de mayo 2015].
ALMENDRAS, F. and FUENTEALBA, I. 1997. Salmonids
rickettsial septicemia
caused by Piscirickettsia salmonis: a review. Dis. Aquat. Org. 29:137-144.
ALMENDRAS, F.; FUENTEALBA, I.; MARKHAM, R. and SPEARE, D. 2000.
Pathogenesis of liver lesions caused by experimental infection with Piscirickettsia
salmonis in juvenile Atlantic salmon, Salmo salar L. J. Vet. Diag. Invest. 12:552-557.
ALVARADO, V.; SCHAFER, W.; ENRIQUEZ, R.; MONRS, M.; CUBILLOS, V.;
FARIAS, C. and ALBERDI, A. 1990. Sndrome del salmn coho (S.S.C.), nueva
enfermedad de salmondeos cultivados en fase de agua de mar en Chile. Situacin actual.
Pat. Animal. 4:10-13.
AUSTIN, B. 2011. Taxonomy of bacterial fish pathogens. Vet. Res. 42:21.
AUSTIN, B. and AUSTIN, D. 2007. Bacterial Fish Pathogens. Characteristics of the
disease, Piscirickettsiosis representative: Piscirickettsia
salmonis. 4th ed. SpringerPraxis. Chichester, U.K. pp:283-321.
BRANSON, E. and NIETO DAZ-MUOZ, D. 1991. Description of a new disease
condition occurring in farmed coho salmon, Oncorhynchus kisutch, in South America.
J. Fish Dis. 14:147-156.
BRAVO, S. 1994. Piscirickettsiosis in freshwater. Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 14:137138.
BRAVO, S. 2000. Previniendo las enfermedades en la industria salmonera. Chile
Acucola: 21-25.
BRAVO, S. y CAMPOS, M. 1989. Sndrome del salmn coho. Chile Pesquero. 54: 4748.

24

BRAVO, S.; DOLZ, H.; SILVA, M.; LAGOS, C.; MILLANAO, A. y URBINA, M.
2005. Diagnstico del uso de frmacos y otros productos qumicos en la acuicultura.
Informe final de proyecto Fondo de Investigacin Pesquera (FIP) N 2003-28.
Universidad Austral de Chile. Facultad de Pesqueras y Oceanografa. Instituto de
Acuicultura. Puerto Montt. Chile. 256p.
BRAVO, S. and MIDTLYNG, P. 2007. The use of fish vaccines in the Chilean salmon
industry. 1999-2003, Aquaculture. 270:36-42.
BUSCHMANN, A.; CABELLO, F.; YOUNG, K.; CARVAJAL, J.; VARELA, D. y
HENRIQUEZ, L. 2009. Salmon aquaculture and coastal ecosystem health in Chile:
analysis of regulations, environmental impacts and bioremediation systems. Ocean Coast.
Manage. 52:243-249.
BUSTOS, P.; ENTRALA, P.; MONTAA, J. y CALBUYAHUE, J. 1994. Septicemia
rickettsial salmonidea (SRS): Estudio de transmisin vertical en salmn Coho,
Oncorhynchus kisutch. Puerto Montt, Chile. In: Resmenes de Seminario de Patologa y
Nutricin en el Desarrollo de la Acuicultura: Factores de xito. 3-7 Octubre. Puerto
Montt. Chile. Fundacin Chile. pp. 33-40.
CORBEIL, S.; and CRANE, M. 2009. Piscirickettsia
salmonis. [en lnea]
<http://www.scahls.org.au/assets/pdf_file/0005/1516514/Piscirickettsia_salmonis.pdf>.
[consulta: 01 de setiembre del 2014].
CORREAL, P. 1995. Prospeccin de Piscirickettsia salmonis en fauna marina silvestre
asociada al cultivo intensivo en salmnidos. Memoria de Ttulo Mdico Veterinario.
Santiago. Chile. Universidad de Chile. Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias.
62p.
CUBILLOS, V.; FARAS, C.; ALBERDI, A.; ALVARADO, V.; SCHFER, W. y
MONRS, M. 1990. Caractersticas anatomopatolgicas del Sndrome del salmn
coho, nueva enfermedad de los salmnidos. Pat. Anim. 4:14-17.
CVITANICH, J.; GRATE, O. and SMITH, C. 1990. Etiological agent in a Chilean
coho disease isolated and confirmed by Koch`s postulates. AFS/FHS Newsletter 18:1-2.
CVITANICH, J.; GARATE, O. and SMITH, C. 1991. The isolation of rickettsia-like
organism causing disease and mortality in Chilean salmonids and its confirmation by
Koch postulate. J. Fish Dis. 14: 121-145.
25

CVITANICH, J.; GARATE, N.; SILVA, P.; ANDRADE, V. and FIGUEROA, P. 1995.
Isolation of a new rickettsia like organism from Atlantic salmon in Chile. AFS/FSH
Newsletter 23:1-3.
DAWSON-SAUDERS, B. y TRAPP, R. 1997. Bioestadstica Mdica. D.F. El manual
moderno. 403p.
FRYER, J.; LANNAN, C.; GARCES, H.; LARENAS, J. and SMITH, P. 1990. Isolation
of a rickettsial-like organism from diseased coho salmon (Oncorhynchus kisutch) in
Chile. Fish Pathol. 25: 107-114.
FRYER, J.; LANNAN, C.; GIOVANONNI, S. and WOOD, N. 1992. Piscirickettsia
salmonis gen. nov., sp. nov., the causative agent of an epizootic disease in salmonid
fishes. Int. J. Syst. Bacteriol. 42:120-126.
FRYER, J. and MAUEL, M. 1997. The Rickettsia: an emerging group of pathogens in
fish. Emerg. Infect. Dis. 3:137-144.
FRYER, J. and HEDRICK, R. 2003. Piscirickettsia salmonis: a Gram-negative
intracellular bacterial pathogen of fish. J. Fish Dis. 26: 251-262.
FRYER, J. and LANNAN, C. 2005. Family II. Piscirickettsiaceae fam. Nov. In: Garrity,
G.M. (ed). Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology. 2th ed, vol II The
Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria. Springer. New York, USA. pp:180184.
GAGGERO, A.; CASTRO, H. and SANDINO, A. 1995. First isolation of Piscirickettsia
salmonis from coho salmon, Oncorhynchus kisutch, and rainbow trout, Oncorhynchus
mykiss, during the freshwater stage of their life cycle. J. Fish Dis. 18:277-279.
GARCAS, F.; MENDOZA, J. and CARVAJAL J. 2005. Posible susceptibilidad de
Oncorhynchus kisutch a adquirir piscirickettsiosis en la fase de engorda debido al estrs
fisiolgico que le produce la alimentacin a saciedad. AQUATIC 22: 11-19.
GARCS, L.; LARENAS, J.; SMITH, P.; SANDINO, S.: LANNAN, C. and FRYER, L.
1991. Infectivity of a rickettsia isolated from coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Dis.
Aquat Org. 11:93-97.

26

GRAUMANN, R.; ENRQUEZ, R.; MONRS, M.; BROWN, A. and ROSENTHAL, H.

1997. Experimental challenge of Piscirickettsia salmonis in postsmolts of Atlantic
salmon (Salmo salar). In: 8th International Conference on Diseases of Fish and Shellfish.
Edinburg, Scotland. September, 14-19. European Association of Fish Pathologists
(EAFP). pp:56.
KNAPP, G.; ROHEIM, C. and ANDERSON, J. 2007. The World Salmon Farming
Industry. In: The Great Salmon Run: Competition between Wild and Farmed Salmon.
World Wildlife Fund. Washington DC, USA. pp:57-76.
LANNAN, C.; EWING, S. and FRYER, J. 1991. A fluorescent antibody test for
detection of the rickettsia causing disease in Chilean salmonids. J. Aquat Animal Health
3:229-234.
LANNAN, C. and FRYER, J. 1991. Recommended methods for inspection of fish for
the salmonis rickettsia. Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 11:135-136.
LANNAN, C. and FRYER, J. 1994. Extracellular survival of Piscirickettsia salmonis. J.
Fish Dis. 17:545-548.
LARENAS, J.; HIDALGO, L.; GARCS, H.; FRYER, J. y SMITH, P. 1995.
Piscirickettsiosis: Lesiones en salmn del Atlntico (Salmo salar) infectados
naturalmente con Piscirickettsia salmonis. Av. Cs. Vet. 10:53-58.
LARENAS, J.; ASTORGA, C.; CONTRERAS, J. y SMITH, P. 1996. Deteccin de
Piscirickettsia salmonis en ovas fertilizadas provenientes de trucha arco iris
(Oncorhynchus mykiss) experimental infectados. Arch. Med. Vet. 28:161-166.
LARENAS, J.; CONTRERAS. J.; OYANEDEL, S.; MORALES, M. y SMITH, P. 1997.
Efecto de la densidad poblacional y temperatura en truchas arcoris (Oncorhynchus
mykiss) inoculadas con Piscirickettsia salmonis. Arch. Med. Vet. 29. 1:113-119.
LARENAS, J. 1999. Evaluacin experimental clnico patolgica del efecto de la densidad
poblacional, temperatura e infeccin concominante con Renibacterium salmoninarum
sobre la presentacin de piscirickettsiosis. Memoria Grado Magister en Ciencias
Animales y Veterinarias, Mencin Patologa Animal. Santiago, Chile. U de Chile, Fac.
Cs. Veterinarias y Pecuarias. 149p.

27

LARENAS, J.; CONTRERAS, J. y SMITH, P. 2000. Piscirickettsiosis: uno de los

principales problemas en cultivos de salmones en Chile. Tecnovet 6:28-30.
LARENAS, J.; BARTHOLOMEW, J.; TRONCOSO, O.; FERNNDEZ, S.; LEDEZMA,
H.; SANDOVAL, N.; VERA, P.; CONTRERAS, J. and SMITH, P. 2003. Experimental
vertical transmission of Piscirickettsia salmonis and in vitro study of attachment and
mode of entrance into the fish ovum. Dis. Aquat. Org. 56:25-30.
LARENAS, J.; ZAMORANO, E. y SMITH, P. 2005. Deteccin de Piscirickettsia
salmonis en heces de alevines de salmn coho (Oncorhynchus kisutch) infectados por
transmisin vertical. Mon. Electr. Patol. Vet. 56-67.
LEAL, J. y WOYWOOD, D. 2007. Piscirickettsiosis en Chile; avances y perspectivas
para su control [en lnea] <http://www.salmonchile.cl/salmociencia/002/Paper1.pdf>
[consulta: 07 de mayo del 2014].
MANNESCHI, G. 2011. Desafo experimental con Piscirickettsia salmonis en familias
de salmn del Atlntico (Salmo salar). Memoria de Ttulo Mdico Veterinario. Santiago,
Chile. U de Chile. Fac. Ciencias Veterinarias y Pecuarias. 52p.
MARTIN, S.; MEEK, A. y WILLEBERG, P. 1997. Epidemiologa Veterinaria:
Principios y Mtodos. Madrid. Espaa. Acribia. 384p.
MAUEL, M. and MILLER, D. 2002. Piscirickettsiosis
infections in fish: a review. Vet. Microbiol. 87:279-289.

an piscirickettsiosis-like

MAUEL, W.; WARE, C. and SMITH, P. 2008. Culture of Piscirickettsia salmonis on

enriched blood agar. J. Vet. Diagn. 20:213-215.
MONASTERIO, M. 2008. Descripcin patolgica en salmones coho (Oncorhynchus
kisutch) coinfectados para reproducir experimentalmente piscirickettsiosis y anemia
hemoltica del salmn. Memoria de Ttulo Mdico Veterinario. Santiago. Chile. U de
Chile. Fac. Cs. Veterinarias y Pecuarias. 98p.
OIE, WORLD ORGANIZATION FOR ANIMAL HEALTH. 2006. Piscirickettsiosis.
Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animals. 5:250-256.

28

OLIVARES, J. and MARSHALL, S. 2010. Determination of minimal concentration of

Piscirickettsia salmonis in water columns to establish a fallowing period in salmon
farms. J. Fish Dis. 33:261-266.
OLSEN, A.; MELBY, H.; SPEILBERG, L.; EVENSEN, O. and HASTEIN, T. 1997.
Piscirickettsia salmonis infection in Atlantic salmon Salmo salar in Norwayepidemiological, pathological and microbiological findings. Dis. Aquat. Org. 31:35-48.
ROJAS, M.; OLIVARES, J.; DEL RO, R. and MARSHALL, S. 2008. Characterization
of a novel and genetically different small infective variant of Piscirickettsia salmonis.
Microb. Pathog. 44:370-378.
ROZAS, M. and ENRQUEZ, R. 2014. Piscirickettsiosis and Piscirickettsia salmonis in
fish: a review. J. Fish Dis. 37:163:188.
SALINAS, G.; CONTRERAS, J.; SMITH, P. and LARENAS, J. 1998. Horizontal
transmission and excretion of Piscirickettsia salmonis in rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) in fresh water condition. 57p.
SCHFER, J.; ALVARADO, V.; ENRQUEZ, R. and MONRS, M. 1990. The coho
salmon syndrome (CSS): a new disease in Chilean salmon, reared in seawater. Bull. Eur.
Assoc. Fish Pathol. 10:130-132.
SERNAPESCA. 2013. Nuevo programa sanitario de vigilancia y control en la
salmonicultura.
[en
lnea]
<http://www.sernapesca.cl/index.php?option=com_content&view=article&id=1573:serna
pesca-presento-nuevo-programa-sanitario-de-vigilancia-y-control-en-lasalmonicultura&catid=1:ultimas&Itemid=69> [consulta: 12 de octubre del 2014].
SHANNON, A and HOPE, T. 2014. Antibody Fc:Linking Adaptive and Innate
Inmunity. Mechanisms of Inmunoglobulin-Mediated Mucus Entrapment of Pathogens at
Various
Mucosal
Surfaces.
Elsevier.
[en
lnea].
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780123948021000200>. [consulta:
07 de Junio del 2015].
SIEGEL, S. 1956. The case of k Related Samples. In: Nonparametric Statistic for the
Behavioral Sciences. Tokyo. Japan. Mc Graw-Hill. p. 159-173.
SOLIS A. 2002. Comparacin del nivel de la presencia de Piscirickettsia salmonis en
muestras de frotis renal, fluido celmico y seminal de reproductores de salmnidos de la
29

Dcima Regin de Chile. Memoria Ttulo Mdico Veterinario. Santiago, Chile.

Universidad de Chile, Fac. Cs. Veterinarias y Pecuarias. p-67.
SMITH, P.; PIZARRO, P.; OJEDA, P.; CONTRERAS, J.; OYANEDEL, S. and
LARENAS, J. 1999. Routes of entry of Piscirickettsia salmonis in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Dis. Aquat. Org. 37: 165-172.
SMITH, P.; ROJAS, M.; GUAJARDO, A.; CONTRERAS, J.; MORALES, M. and
LARENAS, J. 2004. Experimental infection of coho salmon Oncorhynchus kisutch by
exposure of skin, gills and intestine with Piscirickettsia salmonis. Dis. Aquat. Org.
21:53-57.
STEFANSSON, S.; McGINNITY, P.; BJRNSSON, B.; SCHRECK, C. and
McCORMICK, S. 2003. The importance of smolt development to salmon conservation,
culture, and management: perspectives from the 6th International Workshop on
Salmonid Smoltification The Importance of Smolt. Aquaculture 222:1-14.
THRUSFIELD, M. 1990. Epidemiologa Veterinaria. Madrid. Espaa, Acribia. 339p.
VENEGAS, C. 1996. Piscirickettsia salmonis. Prospeccin en faunas marina asociada a
cultivos de salmnidos infectadas. Periodo invierno-primavera. Memoria Ttulo Mdico
Veterinario. Santiago. Chile. U. de Chile. Fac. Cs. Veterinarias y Pecuarias. 95p.
VENEGAS, C.; CONTRERAS, J.; LARENAS, J. and SMITH, P. 2004. DNA
hybridization assays for the detection of Piscirickettsia salmonis in salmonid fish. J.
Fish Dis. 27:431-433.

30

ANEXOS

31

ANEXO N 1

Protocolo inmunofluorescencia indirecta para la deteccin de Piscirickettsia

salmonis
1. Aplicar 10 l del 1er anticuerpo monoclonal anti-P. salmonis (Grupo Bios) hecho en
ratn diluido en una solucin 10-2.
2. Incubar la muestra en una cmara oscura y hmeda durante 60 minutos a temperatura
ambiente. Evitando que se seque los anticuerpos
3. Lavar completamente la muestra con PBS (pH: 7,0) mediante el uso de una botella de
lavado por 5 minutos
4. Aplicar 10 l del 2do anticuerpo anti-ratn marcado con isotiocianato de fluorescena
diluido en una solucin 10-2.
5. Incubar las muestras en una cmara oscura y hmeda durante 60 minutos a
temperatura ambiente. Evitando que se seque los anticuerpos
6. Lavar completamente la muestra con PBS (pH: 7,0) mediante el uso de una botella de
lavado por 5 minutos.
7. Montar la muestra con un medio de montaje acuoso (Fluorogel II).
8. Ver la muestra en un microscopio de epifluorescencia utilizando 10 campos visuales y
un aumento de 1000X.

32

FIGURAS

Figura 1. La fotografa muestra signos clnicos propios de la

piscirickettsiosis. Se observa abundante cantidad de lceras
correspondientes a P. salmonis en salmn coho cultivados en agua
de mar.

Figura 2. Frotis renal. Se observa abundante cantidad de

microorganismos cocoides correspondientes a P. salmonis en salmn
coho cultivados en agua de mar. Inmunofluorescencia indirecta (IFI).
1000X.

33

Figura 3. Frotis de hgado. Se observa abundante cantidad de

microorganismos cocoides correspondientes a P. salmonis en
salmn coho cultivados en agua de mar. Inmunofluorescencia
indirecta (IFI). 1000X.

Figura 4. Frotis de bazo. Se observa abundante cantidad de

microorganismos cocoides correspondientes a P. salmonis en
salmn coho cultivados en agua de mar. Inmunofluorescencia
indirecta (IFI). 1000X.

34

Figura 5. Frotis de heces. Se observa abundante cantidad de

microorganismos cocoides correspondientes a P. salmonis en
salmn coho cultivados en agua de mar. Inmunofluorescencia
indirecta (IFI). 1000X.

35