Anda di halaman 1dari 5

ACARA I

ISOLASI DNA TANAMAN

Kompetensi : Mahasiswa mengetahui cara mengisolasi DNA dari tanaman

Teori
DNA tanaman, seperti halnya DNA pada eukariotik yang lain merupakan
DNA linier dengan ukuran yang bervariasi pada tiap jenis tanaman. DNA tanaman
mengandung gen-gen yang essensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup
individu tanaman yang bersangkutan. Oleh karena itu, berbagai teknik molekuler
telah dikembnagkan untuk memperoleh DNA tanaman agar dapat digunakan
untuk lebih dapat memehami karakter biologis darai suatu tanaman dari sudut
pandang genetis. Informasi ini penting untuk memanupulasi genom tanaan
khususnya dalam usaha pemuliaan tanaman. Isolasi DNA tanaman secara umum
melalui 3 tahap yaitu pemecahan sel, keluarnya DNA dari nukleus, dan presipitasi
DNA. Metode mengisolasi DNA dari tanaman berbagai macam,namun 3 faktor
utama yang hjarus dipenuhi adalah:
1. Cara dalam menghomogenkan jaringan tanamn khusus dinding sel
2. Komposisis lar buffer yang ditambahkan
3. Penghilangan debrish (kontaminan)

Alat dan Bahan:


Bahan yang dibutuhkan antara lain tanaman sampel Synedrella nodiflora
alkohol 70%, alkohol 96 %, akuades, CTAB (cetyltrimethylammonium bromide),
β-merkaptol, KIA (kloroform: isoamilalkohol= 24:1), isopropanol, bufer TE,
RNAse, amonium asetat.
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah tabung reaksi,
beaker glass, spatula, mikropipet beserta tipnya, tabung mikrosentrifuga 1,5 ml,
vortex, waterbath, mikrosentrifuga, LAF, freezer, dan sarung tangan.
Cara kerja:

1. Daun Synedrella nodiflora dipetik, kemudian disterilisasi permukaan


menggunakan alkohol 70% dan dicuci dengan akuades steril mengalir.

1
2. 0,1 gram sampel daun ditumbuk, kemudian ditambahkan CTAB 650C dan
β-merkaptol 1%.
3. Sampel divortex selama 5 menit, kemudian diinkubasi 650 dalam waterbath
selama 1 jam sambil dishaker.
4. Sampel ditambah KIA sejumlah total volume sampel, kemudian divortex 5
menit dan disentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit.
5. Larutan teratas yang diperoleh diambil, ditambah KIA lalu di disentrifugasi
pada 13000 rpm selama 5 menit.
6. Larutan teratas yang dihasilkan, diambil lalu ditambah isopropanol
sebanyak 2/3 volume larutan, dibolak-balik 10 kali lalu disentrifugasi lagi
pada 13000 rpm selama 5 menit.
7. Supernatan yang dihasilkan dibuang, lalu pelet dilarutkan dalam buffer TE
dengan cara diinkubasi 650 selama 1 jam.
8. Larutan kemudian ditambah RNAse dan diinkubasi 370 selama 30 menit.
9. Larutan kemudian ditambah amonium asetat, dibolak-balik 10 kali dan
alkohol 96%, dibolak-balik 5 kali dan dibiarkan minimal selama 2 jam
dalam freezer pada suhu -200C.
10. Larutan kemudian disentrifugasi pada 13000 rpm selama 2 menit.
11. Pelet yang dihasilkan ditambah alkohol 70%, kemudian disentrifugasi
kembali pada 13000 rpm selama 2 menit.
12. Pelet yang dihasilkan dikeringkan menggunakan LAF selama 1 jam,
kemudian dilarutkan dengan bufer TE.
13. Larutan diinkubasi dalam waterbath 650C selama 1 jam.
14. Larutan DNA yang dihasilkan diukur konsentrasinya menggunakan
spektrofotometer dan disimpan dalam freezer pada suhu -200C.

2
ACARA II
ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

Kompetensi: Mahasiswa mengetahui cara kerja dan prinsip kerja elektroforesis


gel agarosa
Teori:

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA


berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang
biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan
untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000
pasang basa (bp).
Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan
bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA
dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi
fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui
ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar
ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan
etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di
dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Bahan dan Alat

1. DNA marker
2. Sampel DNA (DNA tanaman hasil isolasi)
3. Agarosa
4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml
EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)
5. Akuades
6. Gelas Ukur 1000 ml
7. Labu Erlenmeyer 50 ml
8. Tabung mikrosentrifuga
9. Sarung tangan

3
10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
11. Kertas parafilm
12. seperangkat alat elektroforesis
13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll
tipe 4000; EDTA 120 mM)
14. larutan Etidium Bromid (EtBr)
15. UV transluminator
16. kamera digital
Cara Kerja:
1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE
50x ke dalam 245 ml akuades.
2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan
ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan
hingga larut sempurna.
3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa
(pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-
masing ujung baki)
4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi
hampir menyentuh dasar baki
5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke
tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl
etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena
bersifat karsinogenik).
6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam
baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat.
7. Ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki.
8. Masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis
yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam
seluruhnya dalam TAE).
9. Siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis.

4
10. Masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel
agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu
secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet.
11. Buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang
dimasukkan.
12. Hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa
kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak
demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya).
13. Nyalakan sumber arus, aturlah volatse dan waktu running hingga diperoleh
angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada
sumber arus.
14. Jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run
pada sumber arus.
15. Elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang
ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki
dari tangki elektroforesis.
16. Keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca
hitam di atas UV transluminator).
17. Nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.