TCNICAS DE SIEMBRA e

INCUBACIN

En la naturaleza los mo no se encuentran

aislados, sino integrados en poblaciones
mixtas
Para llevar a cabo el estudio de estos mo y de
sus propiedades, es necesario separar unos de
otros y trabajar con especies aisladas,
obtenindose cultivos axnicos o puros
Un cultivo axnico o puro es aquel que
contiene un solo tipo de mo y que procede
generalmente de una sola clula, el
crecimiento de sta origina en un medio
slido una masa de clulas fcilmente visible
que recibe el nombre de colonia

 Para obtener cultivos axnicos a partir de una

poblacin microbiana mixta se utilizan las
denominadas tcnicas de aislamiento

TCNICAS DE SIEMBRA
Un inculo es una cantidad suficiente y
representativa del mo problema
El paso de una muestra microbiana a un medio
de cultivo, ya sea lquido o slido, se den siembra
o inoculacin
El paso de una muestra microb. de un medio de
cultivo a otro se den resiembra

Antes de sembrar se procede a la toma del

inculo que es una operacin simple pero
requiere alguna atencin:
AQU SE INCLUIRA TODO LO QUE YA
SABEMOS SOBRE TRABAJAR EN
CONDICIONES DE ESTERILIDAD
PARA PROTEGERNOS A NOSOTROS Y A LA
MUESTRA

TIPOS DE SIEMBRA
A.- SIEMBRA EN MEDIO LQUIDO
A.-1. Si la transferencia se va a realizar a un
caldo estril utilizando el asa de siembra,
escobilln o hisopo, este se introduce en el
medio lquido y se agita para disolver el
contenido del inculo.

A.-2. Con pipeta, se toma un volumen

determinado de muestra problema
aadindolo en el tubo con el medio de
cultivo lq, homogeneizndolo posteriormente
por rotacin entre las manos

En los cultivos lq no tiene lugar la

formacin de colonias, por lo tanto se
examinar la existencia de enturbiamiento, la
formacin de una pelcula o velo sobre la
superficie, la aparicin de sedimento en el
fondo del tubo, etc.
Estos cultivos permiten la obtencin de una
masa microbiana grande, con elevado n de
mo.

B.- SIEMBRA EN MEDIO SLIDO

B.-1. SIEMBRA EN TUBO
B.-1.1 Siembra por estra en tubos con medio
inclinado
Con el asa de siembra tomar los mo de muestra e
inocular el tubo realizando un movimiento de zigzag en la superficie. El proceso se inicia en el
fondo y se va avanzando hacia arriba por el rea
inclinada
Este mtodo es utilizado para conservar cepas
durante cortos perodos de tiempo, as como
para la realizacin de ciertas pruebas bioqumicas

B. 1. 2 Siembra por picadura

Se suele hacer con hilo de
siembra el cual se introduce en la
zona central del tubo
verticalmente hasta el fondo y se
saca por el mismos orificio
Se utilizan para realizar pruebas
bioqumicas, para comprobar si
un mo es o no mvil, ya que en el
primer caso se observar que el
crecimiento difunde alrededor de
la zona donde se hizo la picadura,
de ah la importancia de sacar
por el mismo orificio el hilo

B.-1.3. Siembra por picadura y estra

Consiste en la utilizacin de las 2 tcnicas
anteriormente descritas
Se lleva a cabo cuando el medio es slido y
est inclinado, 1 se realiza la siembra por
picadura y posteriormente la siembra por
estra
Se emplea para ciertas pruebas bioqumicas

B.2. EN PLACA
En funcin del objetivo que se desee
conseguir, hay varios tipos de siembra en
placa.
B.-2.1. Siembra masiva en placa
Siembra en superficie
1. Se toma en condiciones aspticas el
inculo con pipeta estril o con micropipeta,
0,1 ml
2. Se aade al centro de una placa petri que
contiene un medio de cultivo slido

3. Se homogeniza con esptula Driglasky por la

tcnica del rastrilleado:
Se le induce a la placa un movimiento de
rotacin mientras que con la otra mano se
rastrillea con movimiento de vaivn hasta que
se nota, por la resistencia al rastrilleo que
todo el inculo se ha absorbido por el medio
Se suele utilizar esta tcnica para el recuento
de mo aerobios, cuando se utiliza como
medio de cultivo PCA (Plate Counting Agar)

 Siembra en profundidad = Siembra previa al

vertido en placa = Tcnica de Barry
1. En una placa petri vaca se deposita un
pequeo volumen conocido de muestra
2. Se aade el medio de cultivo fundido y
atemperado aproximadamente a 45C
3. Se mezclan ambos por rotacin suave de la
placa, para que los mo se distribuyan
homogneamente, permitiendo el desarrollo
de colonias separadas por todo el agar

 Una variante de esta tcnica consiste en

inocular el medio de cultivo fundido y
atemperado, contenido en un tubo, con un
determinado volumen de muestra. La
homogenizacin se realiza por rotacin del
tubo entre las manos o con una agitador,
antes de verterlo en la placa
En ambos casos, tras la homogenizacin, se
deja enfriar el medio hasta que solidifique y
despus se incuba

B.2.2.Siembra en placa para aislamiento

Tiene por finalidad obtener colonias aisladas,
cuya posterior resiembra nos dar un cultivo
puro o axnico
Las siembras para aislamiento utilizan todas,
medio de cultivo slido
Dependiendo de la tcnica de sembrado
podemos distinguir multitud de variantes,
algunas de ellas son:

B.2.2.1 SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN

ESTRA MLTIPLE.
1. Se toma la muestra con el asa de siembra
estril y se deposita en uno de los extremos
2. Se hace una primera estra en zig-zag muy
junta que ocupe aproximadamente 1/3 de la
placa
3. Flameamos el asa de platino y giramos
ligeramente dicha placa y hacemos una 2
estra en esa direccin tocando la estra
anterior slo al principio.

4. Se vuelve a flamear de nuevo el asa y se

procede de igual manera repitiendo la
operacin 4 o 5 veces, teniendo en cuenta que
el ltimo tramo se efectuar hacia el interior
de la misma

El resultado son colonias cada vez ms

separadas como consecuencia de que cada
vez se va arrastrando y separando ms la
muestra, ya que en cada giro se arrastran
menos bacterias con el asa

B.2.2.2 SIEMBRA EN 4 CUADRANTES

1. Se divide la placa en 4 cuadrantes (con un
rotulador en el reverso de la placa)
2. Se deposita el inculo en uno de los 4
cuadrantes y se siembra en estra
3. Sin flamear el asa, se realiza la misma
operacin sucesivamente en los 3 cuadrantes
girando cada vez la placa 90
4. En cada uno de ellos se sembrar el inculo
que queda adherido al asa, tras la siembra
anterior

Observamos que en el
ltimo cuadrante las
colonias estn ms
aisladas o separadas.

INCUBACIN DE MICROORGANISMOS
Incubacin= es el acondicionamiento
ambiental de los medios de cultivo ya
inoculados para favorecer la multiplicacin y
crecimiento de los mo
Las condiciones de incubacin (tiempo, T y
atmsfera) depende de cada mo
Aunque existen condiciones especiales de
cultivo la mayora de mo crecen en 24-48h a
35 y en atmsfera aerbica

A.- TEMPERATURA
Existe siempre una T para cada mo donde su
proliferacin es ideal y fuera de sta, o no
crecen o lo hacen mucho ms despacio
En funcin de la T ptima de crecimiento los
mo se clasifican:
-Mesfilas: son la mayora y su T pt. est
entre 35-44C.
-Psicrfilas: pueden crecer a T muy bajas
incluso por debajo de 0C
- Termfilas: crecen entre 50-55C e
incluso pueden tolerar hasta 100C

B.- PRESENCIA DE OXGENO Y CO2

1. Aerobios estrictos: necesitan O2 para vivir
2. Microaerfilos: crecen bien a tensiones bajas
de O2 pero no se desarrollan a elevadas
concentraciones del mismo
3. Anaerobios estrictos: la atmsfera debe
carecer totalmente de O2
4. Hay mo que requieren para su crecimiento
una mayor concentracin de CO2 a la
existente en la atmsfera

C.- TIEMPO
Generalmente inferior a una semana,
habitualmente de 24-48h
D.- HUMEDAD
E.- INFLUENCIA DE LA LUZ
Normalmente las bacterias crecen mejor en
ambientes oscuros. La luz y las radiaciones UV
inhiben el crecimiento e incluso matan a los
mo.