Sterilisasi Alat dan Bahan

PERCOBAAN 1
STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI
I.

Tujuan Percobaan

1. Memahami prinsip sterilisasi

2. Mengetahui dan memahami jenis-jenis metoda sterilisasi
3. Melakukan sterilisasi alat dan bahan yang digunakan pada pengujian mikrobiologi
4. Menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian mikrobiologi
II.

Teori Dasar
Steril adalah istilah yang menunjukan kondisi tanpa mikroorganisme hidup.
Mikroorganisme hidup adalah organisme yang dapat berbiak dibawah kondisi optimum untuk
pertumbuhannya (Jutono, dkk. 1990).
Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang ada, sehingga
jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada lagi jasad renik yang dapat berkembang biak.
Sterilisasi harus dapat membunuh jasad renik yang paling tahan panas yaitu spora bakteri
(Fardiaz, 1992).
Sterilisasi secara umum adalah metode destruksi semua bentuk organisme hidup.
Sterilisasi ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi pada alat dan bahan yang
digunakan pada pengujian mikrobiologi oleh bakteri/ virus dari lingkungan sekitar.
Pada prinsipnya sterilisasi dapat dilakuakan dengan 3 cara yaitu secara mekanik, fisik dan
kimiawi.

1. Sterilisasi secara mekanik (filtrasi)

Sterilisasi dengan menggunakan saringan yang berpori sangat kecil (0.22 mikron atau
0.45 mikrob) sehingga mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk
sterilisasi bahan yang peka panas, misalnya larutan enzim dan antibiotik.
2. Sterilisasi secara fisik
a.

Sterilisasi panas lembab

1)
2)
3)
4)
5)

Pemanasan basah biasanya dilakukan didalam autoklaf atau aterilisator uap yang mudah
diangkat dengan menggunakan uap air jenuh bertekanan pada suhu 1210C selama 15 menit
(Hadioetomo, 1985). Cara pemanasan basah dapat membunuh jasad renik atau mikroorganisme
terutama karena panas basah dapat menyebabkan denaturasi protein, termasuk enzim-enzim
didalam sel (Fardiaz, 1992).
Metode ini digunakan untuk :
Larutan dengan pembawa air
Alat-alat gelas
Pembalut untuk bedah
Penutup karet dan plastik
Media untuk pekerjaan mikrobiologi

b. Sterilisasi panas kering

Dibandingkan pemanasan basah, pemanasan kering kurang efisien dan membutuhkan
suhu yang lebih tinggi serta waktu lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa
kelembaban maka tidak ada panas laten (Hadioetomo, 1985).
Pemanasan kering dapat menyebabkan dehidrasi sel dan oksidasi komponen-komponen di
dalam sel (Fardiaz, 1992). Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang
membasahi bahan atau alat yang disterilkan, selain itu peralatan yang digunakan untuk sterilisasi
uap kering lebih murah dibandingkan uap basah (Lay dan Hastowo, 1992). Pemanasan kering
sering dilakukan dalam sterilisasi alat-alat gelas di laboratorium, dimana menggunakan oven
dengan suhu 160-1800C selama 1,5-2 jam dengan sistem udara statis (Fardiaz, 1992).
c.

Sterilisasi dengan Radiasi

1) Radiasi ionisasi
Radiasi ionisasi adalah radiasi yang mengandung energi yang jauh lebih tinggi daripada
sinar ultraviolet. Oleh karena itu mempunyai daya desinfektan yang lebih kuat. Salah satu contoh
radiasi ionisasi adalah sinar gamma yang dipancarkan dari kobalt-10 (Fardiaz, 1992). Radiasi
dengan sinar gama dapat menyebabkan ion bersifat hiperaktif (Lay dan Hastowo, 1992).
2) Radiasi sinar ultra violet
Sinar ultra violet dengan panjang gelombang yang pendek memiliki daya antimikrobial
yang sangat kuat. Daya kerjanya adalah absorbsi oleh asam nukleat tanpa menyebabkan
kerusakan pada permukaan sel. Kerusakan tersebut dapat diperbaiki bila disinari dengan berkas
yang mempunyai gelombang yang lebih panjang (Lay dan Hastowo, 1992).
3. Sterilisasi secara kimiawi
Menurut Lay dan Hastowo (1992), bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu
yang tinggi dapat disterilkan secara kimiawi dengan menggunakan gas. Bahan kimia yang sering
digunakan antara lain :
1) Alkohol, daya kerjanya adalah mengkoagulasi protein. Cairan alkohol yang umum digunakan
berkonsentrasi 70-80 % karena konsentrasi yang lebih tinggi atau lebih rendah kurang efektif.
2) Khlor, Gas khlor dengan air akan menghasilkan ion hipokloride
yang akan
mengkoagulasikan protein sehingga membran sel rusak dan terjadi inaktivasi enzim.

3) Yodium, daya kerjanya adalah bereaksi dengan tyrosin, suatu asam amino dalam emzim atau
protein mikroorganisme.
4) Formaldehida 8 % merupakan konsentrasi yang cukup ampuh untuk mematikan sebagian
besar mikroorganisme. Daya kerjanya adalah berkaitan dengan amino dalam protein mikrobia.
5) Gas etilen oksida, gas ini digunakan terutama untuk mensterilkan bahan yang dibuat dari
plastik.
Sterilisasi dengan bahan kimia digunakan alkohol 70 %. Menurut Gupte (1990), etil
alkohol sangan efektif pada kadar 70 % daripada 100 % dan ini tidak membunuh spora.
Sterilisasi dengan alkohol dilakukan pada proses pembuatan kultur stok dan teknik isolasi.
Alkohol 70 % disemprot-kan pada tangan praktikan dan alat-alat seperti makropipet dan mikropipet. Menurut Volk dan Wheeler (1988), alkohol bila digunakan pada kulit kontaknya terlalu
pendek untuk menimbulkan banyak efek germisida dan alkohol segera menguap karena sifatnya
mudah menguap. Namun alkohol dapat menyingkirkan minyak, partikel debu, dan bakteri.
Menurut Gupte (1990), alkohol 70 % dapat menyebabkan denaturasi protein dan koagulaasi.
No
.
1

Metode
Sterilisasi dengan filtrasi

Sterilisasi panas lembab

Sterilisasi panas kering

Sterilisasi radiasi

Sterilisasi gas

Kelebihan

Kekurangan

Dapat digunakan
untuk
media
berwujud cair
Ada tetesan uap
Lebih
efisien air pada alat dan
dalam waktu
bahan
yang
disterilkan
Memerlukan
Tidak ada uap air temperatur yang
yang
menetes tinggi dan waktu
pada alat dan yang lama.
bahan
yang Belum tentu dapat
disterilkan
membunuh semua
bakteri
Dengan panjang
Sinar UV dapat
gelombang yang
menyebabkan
pendek,
kerusakan
hati,
mempunyai daya
kanker, dan lainantimikrobal yang
lain
kuat.
Waktu sterilisasi
tergantung pada
keberadaan
kontaminasi
kelembaban,
temperatur
dan
konsentrasi etilen

oksida.
III.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan :

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Autoclave
Erlenmeyer
Tabung reaksi
Cawan petri
Botol media
Gelas ukur
Labu takar
Gunting

9. Kertas label
10. Benang kasur
11. Selotip
12. Kapas
13. Stirrer
14. Alumunium foil
15. Kain kasa
Bahan yang digunakan :
1. Nutrient Agar (NA)
2. Nutrient Broth (NB)

IV.

Prosedur Percobaan
1. Persiapan dan sterilisasi alat
Siapkan alat-alat yang akan disterilkan.
2. Pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer
Timbang Nutrient Agar (NA) dan Nutrient Broth (NB). Kemudian masukkan kedalam
erlenmeyer yang berbeda. Masukkan 200 ml aquades kedalam erlenmeyer yang berisi NA dan
100 ml aquades kedalam erlenmeyer yang berisi NB. Lalu masukkan stirrer dan panaskan.
Setelah larutan menjadi jernih, diamkan sebentar. Tutup dengan kapas dan alumunium foil
kemudian ikat dengan benang kasur dan diberi etiket. Lalu masukkan kedalam autoclave untuk
disterilisasi. Setelah 15 menit, dinginkan pada suhu kamar. Hasil diamati setelah 24 jam.

V.

Data Pengamatan
Alat-alat yang disterilisasi dengan autoclave :

erlenmeyer = 2 buah

tabung reaksi = 10 buah

Labu takar = 3 buah

Gelas ukur = 2 buah

Pipet ukur = 1 buah

Cawan petri = 10 buah

Tabel 2. Hasil pengamatan
Media

Data Pengamatan
Sebelum
NA

Aquades
5,6006 gr
200 ml
(serbuk
kuning)
(larutan

bening)
NA

NB

NB
Aquades
0,8018 gr

+
100 ml
serbuk

kuning (larutan bening) muda

Sesudah
Larutan kuning muda
Setelah dipanaskan sampai
mendidih, larutan menjadi
berwarna kuning bening.
Setelah disterilisasi dengan
autoclave, larutan tetap
berwarna kuning bening
tetapi terdapat uap air
dalam erlenmeyer.
Setelah 24 jam, larutan
memadat menjadi agar
berwarna kuning muda dan
terdapat sisa uap air dalam
erlenmeyer.
Larutan sedikit keruh
Setelah dipanaskan, larutan
menjadi bening.
Setelah disterilisasi dengan
autoclave, larutan tetap
bening dan terdapat uap air
dalam erlenmeyer.
Setelah 24 jam, larutan
tetap bening dan tidak
terdapat sisa uap air.
Setelah dibandingkan

dengan NB Kontrol terlihat

perbedaan :
NB Kontrol larutannya
keruh
karena
tidak
disterilisasi.
Hal
ini
menandakan adanya bakteri
dalam larutan
NB larutannya
bening
menandakan tidak adanya
kontaminasi oleh bakteri
(steril).
VI.

Pembahasan
Sebelum melakukan pratikum mikrobiologi, alat-alat yang akan digunakan harus
disterilkan terlebih dahulu. Hal ini dilakukan untuk mencegah terkontaminasinya alat dan bahan
yang digunakan karena dalam praktikum mikrobiologi berhubungan dengan mikroorganisme
yang sangat kecil. Alat-alat yang disterilkan diantaranya erlenmeyer, tabung reaksi, pipet ukur,
cawan petri, gelas ukur, dan labu takar. Semua alat tersebut disterilisasi dengan menggunakan
autoclave pada suhu 1210C selama 15 menit.
Mekanisme kerja autoclave :
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan mendidih
dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf. Setelah semua udara dalam
autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf
naik. Pada saat tercapai tekanan dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer
mulai menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas dimatikan dan
tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf tidak boleh dibuka sebelum
tekanan mencapai 0 psi.
Mekanisme penghancuraqn bakteri oleh uap air panas adalah karena terjadinya denaturasi
beberapa protein esensial dari organisme tersebut. Protein dapat terdenaturasi karena sebagian
besar komponen dari bakteri adalah protein dan protein bersifat tidak btahann panas. Karena
sterilisasi ini menggunakan uap air panas sebagai agen pensterilnya sehingga saat alat-alat
dikeluarkan dari autoclave banyak sekali tetesan uap air yang mengenai alat. Oleh karena itu,
seharusnya alat-alat tersebut dimasukan kedalam oven untuk dikeringkan. Tapi hal ini tidak
dilakukan karena waktu yang diperlukan tidak mencukupi.

Percobaan selanjutnya dilakukan pembuatan media serta larutan pengencer. Pembuatan media
Nutrien Broth (NB) didahulukan dibanding media Nutrien Agar (NA) ini di dasarkan pada
komposisi dari masing-masing media,karena nutrien broth tidak mengandung agar maka akan
lebih mudah larut dan membutuhkan waktu yang relatif lebih cepat di bandingkan nutrien agar
yang mengandung banyak agar dalam komposisinya.
NB
+
0,8018 gr

Aquades
100 ml

serbuk kuning (larutan bening)

muda
Saat NB dilarutkan oleh aquades menghasilkan larutan yang agak keruh. Hal ini menunjukkan
bahwa larutan tersebut masih belum steril. Sebelum dipanaskan, stirrer dimasukkan kedalam
erlenmeyer untuk membantu proses pengadukan larutan. Larutan NB dapat dipanaskan
menggunakan kompor gas atau hot plate stirrer, tetapi jangan sampai overheat, karena akan
terbentuk busa dan memuai
sehingga tumpah). Pemanasan dilakukan pada suhu 1200C. Setelah dipanaskan larutan menjadi
jernih. Pemanasan ini dilakukan agar dihasilkan larutan yang homogen. Kemudian botol media
ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Selanjutnya di masukkan kedalam autoclave.
Sterilisasi dilakukan pada suhu 1210C selama 15 menit. Setelah disterilisasi larutan tetap jernih
dan terdapat uap air dalam erlenmeyer.
NA
+ Aquades
5,6006 gr
200 ml
(serbuk kuning) (larutan bening)
Seperti pada media NB, media NA pun ditambahkan aquades untuk selanjutnya dipanaskan
dengan suhu yang berbeda yaitu 1250C sampai larutan agak mendidih. Hal ini dilakukan karena
dalam komposisi NA terdapat komponen agar yang bila didiamkan pada suhu kamar bisa
memadat, sehingga dipanaskan sampai memdidih agar larutan menjadi homogen. Jadi jika media
dimasukkan kedalam tabung reaksi, dan dibuat posisi datar atau miring maka akan memadat
dengan sempurna. Kemudian botol media ditutup dengan kapas dan alumunium foil. Selanjutnya
di masukkan kedalam autoclave. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121 0C selama 15 menit. Setelah
disterilisasi larutan tetap jernih dan terdapat uap air dalam erlenmeyer.
Setelah proses sterilisasi kedua botol media didiamkan selama 24 jam. Hal ini dilakukan karena
bakteri dapat membentuk koloni dalam waktu kurang lebih 24 jam. Media NB selanjutnya
dibandingkan dengan NB kontrol dan terlihat perbandingan sebagai berikut :
NB kontrol

: Larutan keruh karena tidak disterilisasi, hal ini menandakan adanya bakteri

dalam larutan (tidak steril).

NB

: Larutan jernih, hal ini menandakan dalam media tersebut tidak terdapat

kontaminan (steril).
Sedang pada media NA larutan memadat menjadi agar berwarna kuning muda dan terdapat sisa
uap air didalamnya. Sisa uap air ini terbentuk karena saat penutupan botol media tidak diikat
dengan benang kasur sehingga saat proses streriliisasi dalam autoklaf penutup alumunium foil
terlepas dari botol media.
VII.

Kesimpulan

1.

Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan sporasporanya.
2. Ada lima Metoda-metoda sterilisasi : sterilisasi lembab, sterilisasi kering, sterilisasi filtrasi,
sterilisasi gas, dan sterilisasi radiasi.
3. NA larutanya memadat jadi agar, berwarna kuning muda, NB larutanya jernih yang menandakan
larutanya steril.
VIII.
1.
2.

Daftar Pustaka
http://youyoecreativeinc.blogspot.com/2008/11/laporan-mikrobiologi-pertanian.html
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/11/bab-3-sterilisasi.html