MUTAGNESIS LETAL COMO NUEVA ESTRATEGIA ANTIVIRAL

Investigador principal: Miguel ngel Martnez de la Sierra

Centro: Fundaci irsiCaixa
Duration: 3 years

MEMORIA FINAL

1. Resumen del proyecto

La variabilidad gentica del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1

(VIH-1) es uno de los principales obstculos para la prevencin y control
de la enfermedad viral. Las pruebas realizadas recientemente sugieren
que un incremento en el ndice de mutaciones durante la replicacin viral
puede conducir a una prdida de infectividad viral, en un proceso conocido
como mutagnesis letal, el cual puede constituir una nueva estrategia
antiviral. El objetivo de la presente propuesta fue estudiar el efecto de los
agentes mutagnicos, solos o en combinacin con inhibidores
antirretrovirales, en la replicacin viral. Se utilizarn como sistemas de
modelo los VIH-1 que muestren diferentes valores de eficacia biolgica
relativa. Los anlisis incluyeron el efecto de los tratamientos en la
infectividad viral, la complejidad del espectro de mutantes y la distribucin
de las mutaciones a lo largo del genoma viral, en particular en poblaciones

pre-extincin. Tambin se analizaron las frecuencias de mutacin y el

escape de inhibidores en relacin con el incremento de mutagnesis. Los
resultados obtenidos han permitido evaluar las posibilidades de la
mutagnesis letal como estrategia antirretroviral.
La aparicin de cepas resistentes a los inhibidores del VIH contina
acosando las terapias actuales para el tratamiento del SIDA. Proponemos
un nuevo enfoque teraputico basado en el aumento del ndice de
mutaciones del VIH. El extraordinario alto ndice de mutacin del VIH
sugiere que la poblacin viral existe cerca del umbral para la viabilidad
viral (Domingo Virology 2000, 270: 251). As, un incremento en el ndice
de mutacin puede provocar que la poblacin de virus alcance un umbral
de error ms all del que la poblacin puede mantener debido a una
prdida de capacidad de replicacin viral e infectividad. Este enfoque est
respaldado por predicciones tericas y tambin estudios experimentales
con varias investigaciones. (Reseas en Domingo Virology 2000, 270:
251). En concreto, el resultado de los tratamientos mutagnicos fue la
extincin ocasional, no sistemtica, del VIH-1. (Loeb et al. PNAS 1999,
96: 1492). Estos resultados sugieren que la combinacin de un inhibidor
antirretroviral, para reducir la carga replicativa de virus, con un agente
mutagnico podra ser ms eficaz en la produccin de extincin viral que
la utilizacin de un agente mutagnico por s solo. (Pariente et al. J Virol
2001, 75: 9723). Con el fin de demostrar esta posibilidad hemos
estudiado lo siguiente:

1 . El efecto de agentes mutagnicos, por s solos o en combinacin con

inhibidores antirretrovirales, en la replicacin del VIH-1.
2 . El efecto de diferentes tratamientos mutagnicos en la infectividad
viral, la complejidad del espectro de mutantes y la distribucin de las
mutaciones a lo largo del genoma viral.

3 . La robustez funcional de proteasa del VIH-1 por evolucin in vitro. Se

ha utilizado la hipermutagnesis in vitro para generar una librera de
proteasa de VIH-1 mutada aleatoriamente.

2. Resultados

Los resultados que obtuvimos utilizando el compuesto mutagnico 5-OHdC

mostraron que combinaciones de este mutgeno con AZT eran ms
eficaces que el mutgeno por s solo llevando al HIV-1 a su extincin
(mutagnesis letal). Primero se utilizaron clulas mononucleares de
sangre perifrica (CMSP) o clulas MT4 con el fin de evaluar la toxicidad
(CC50) de las clulas del mutgeno mediante el ensayo MTT. En base a
estos resultados, se seleccion la concentracin subtxica del mutgeno
(CC50 2mM) para posteriores experimentos. Los cultivos de clulas MT4
ex vivo de la cepa HXB2 de laboratorio se cultivaron con y sin 2mM 5OHdC (500 TCID50, MOI 0,01), por s solo o en combinacin con
concentraciones IC50 de AZT (0,01mM). Pasos en presencia de un
frmaco (por ejemplo, AZT, o 5-OHdC) fallaron en la extincin sistemtica
de la replicacin VIH-1 de alta eficacia biolgica despus de 16
transferencias en serie. Sin embargo, se observ la extincin sistemtica
del VIH-1 despus de utilizar una combinacin del agente mutagnico 5OHdC con AZT. Estos resultados demuestran que las combinaciones de
agentes mutagnicos con inhibidores antirretrovirales pueden conducir
sistemticamente a la extincin del VIH-1.
Con el fin de poner a prueba el papel de la eficacia biolgica del VIH-1 en
la mutagnesis letal, analizamos dos aislados de VIH-1 diferentes del
mismo paciente (por ejemplo, tipo salvaje, cepa F96; y la resistencia al
multifrmaco posterapia F98). La eficacia biolgica del aislado F98
altamente mutado fue 4 veces inferior al del tipo salvaje F96 (es decir,
25% y 96% relativo al virus de tipo salvaje utilizado como control;

nuestro grupo public estos datos en colaboracin con Weber et al. 2003
Journal of General Virology, 84: 2217). No se observ una extincin del
VIH-1 F96 o del F98 en presencia de 5-OHdC por s solo hasta despus de
5 pasos (5 semanas). Para probar si los aislados F96 y F98 podan ser
extinguidos en CMSP en presencia de 5-OHdC por s solo, se realiz una
nueva serie de transferencias secuenciales. En las dos series en las que el
aislado F98 se propag en cultivos tratados de 5-OHdC, no se detect el
antgeno p24 hasta pasados 10 pasos. Resulta interesante que en los dos
cultivos tratados de 5-OHdC en los que se propag el F96, el virus fue
detectado a lo largo de los 16 pasos realizados. Estos resultados
demuestran la influencia de la eficacia biolgica viral en la determinacin
de la extincin del virus mediante un aumento de la frecuencia de
mutacin. Adems, las cepas VIH-1 resistentes a frmacos con una
capacidad de replicacin daada pueden ser ms susceptibles a la
mutagnesis letal, haciendo de ste un concepto muy atractivo para
utilizarlo en pacientes infectados con el VIH-1 en terapia de rescate.
Asimismo, hemos comenzado a realizar un cribaje para compuestos
nuevos que son mutagnicos al VIH-1. En concreto, hemos empezado a
probar derivativos de 1-(2-deoxi-beta-D-eritro-pentofuranosil)-imidazola4-hidracida (Strobel et.al. ChemBioChem 2002 3, 1251- 1256). Los
estudios realizados con estos compuestos implican una colaboracin
cientfica con la Dra. Sylvie Pochet (Instituto Pasteur, Paris). Hasta ahora,
hemos identificado un compuesto (LDXXIII4H) que muestra un IC50 de
3mg/ml. En estos momentos estamos caracterizando el espectro de
mutantes generado por este compuesto.
Por ltimo, hemos construido una librera de proteasas de VIH-1
aleatoriamente mutadas, la cual contiene al menos 104 variantes
diferentes de proteasa de VIH-1. Aqu las generaciones de enzimas activas
provenientes de la cepa HXB2 de laboratorio, fueron generadas por
hipermutagnesis iterativa (Martinez et al. EMBO J 1996, 6: 1203),
producindose la sustitucin de un 15-20% de aminocido. Esta
consecuencia demuestra la robustez funcional de esta enzima. Mediante la
4

introduccin superficial de mltiples mutaciones, la hipermutagnesis

iterativa nos permite generar protenas activas utilizando un modo
inexplorado por seleccin natural. Para analizar esta amplia coleccin de
proteasas mutantes se utiliz un sistema de cribaje gentico basado en el
fago lambda instalado en nuestro laboratorio (Martinez et al. Antimicrob
Agents Chemother 2000, 44: 1132, Cabana et al. Virology 2002, 300: 71,
Fernandez et al. Journal of Virology 2007 5, en prensa; Parera et al. Mol.
Biol. Evol. 2007, en prensa). Hasta ahora hemos aislado 1.358 variantes.
El anlisis de 107 clones mutantes simples, que cubra un 90% de los
residuos aminocidos de proteasa de VIH-1, demostr que el 55% de
mutaciones simples aleatorias resultaron letales con slo un 2% de los
clones incrementando la eficacia cataltica de la enzima. Los resultados
que hemos obtenido son relevantes respecto al ndice de introduccin de
alelos deletreos en genomas en la historia evolucionaria, y en la
tolerancia de organismos a la carga mutacional (Parera et al. Mol. Biol.
Evol. 2007, en prensa).

3. Relevancia y posibles implicaciones clnicas de los resultados

finales obtenidos

El objetivo final de la presente terapia antirretroviral es suprimir la

replicacin del VIH-1 tanto como sea posible y por el mayor tiempo
posible. Mantener entre bajos e indetectables los niveles de ARN del VIH
en el plasma ayudara a prevenir la progresin del SIDA y minimizar el
riesgo de aparicin de variantes del VIH resistentes a los frmacos
utilizados. Sin embargo, los tratamientos con una combinacin de
antirretrovirales (ARV) no inhiben por completo la replicacin del VIH, y
presumiblemente conducen a un fallo del tratamiento. Adems, existe una
extensa resistencia cruzada entre las tres clases de frmacos poseedores
de autorizaciones largas en la Comunidad Europea (como los inhibidores

de transcriptasa inversa nuclesidos/nucletidos, NRTI; inhibidores de

transcriptasa inversa no-nuclesidos, NNRTI; e inhibidores de proteasa,
IP). Ahora mismo la clase de inhibidor de fusin (IF) slo incluye un
frmaco con autorizacin completa aunque se ha probado que existe una
reaccin cruzada entre las mutaciones de resistencia y otro IF
actualmente en ensayos

clnicos de fase III. Existe, pues, una necesidad

sustancial de disear y disponer de nuevas estrategias antirretrovirales. A

pesar de que hemos descrito la utilizacin de la mutagnesis letal como
un enfoque antiviral potencial, se han realizado pocos estudios enfocados
al uso de este concepto contra el VIH-1. Puede que una de las mayores
preocupaciones sea encontrar anlogos nuclesidos que hagan aumentar
el ndice de mutacin del VIH-1, representando una toxicidad mnima para
las clulas humanas. Los resultados que hemos obtenido sugieren que una
combinacin de agentes mutagnicos (por ejemplo, 5-hidroxideoxicitidina
(5-OHdC) y frmacos antivirales (AZT, por ejemplo) podra incrementar la
frecuencia de extincin viral, y permitir la utilizacin de concentraciones
subtxicas del frmaco mutagnico. Adems, las cepas de VIH-1
resistentes a frmacos con la capacidad de replicacin daada pueden ser
ms susceptibles a la mutagnesis letal, haciendo de ste un concepto
muy atractivo para utilizarlo en pacientes infectados con el VIH-1 en
terapia de rescate.

4. Publicaciones

Tapia N, Fernndez G, Gmez-Mariano G, Parera M, Clotet B, QuionesMateu M, Domingo E and Martnez MA. (2005). Combination of a
mutagenic agent with a reverse transcriptase inhibitor results in
systematic inhibition of HIV-1 infection. Virology, 338:1-8.

Parera M, Ibaez A, Clotet B and Martinez MA. (2004). Lack of evidence

for protease evolution in HIV-1 infected patients after two years on
suppressive HAART. Journal of Infectious Diseases, 18: 1444-51.

Gimnez-Barcons M, Ribera M, Llano A, Clotet B, Est JA and Martnez MA

(2005). Analysis of chemokine and cytokine expression in HIV-1 and GB
virus-C co-infected patients. Clinical Infectious Diseases, 40: 1342-1349.
Sabariegos R, Jimnez-Barcons M, Tapia N, Clotet B, and Martnez MA
(2006). Human immunodeficiency virus type 1 sequence homology
requirements to escape from short interfering RNAs. Journal of Virology,
80: 571-577.

Fernndez G, Llano A, Esgleas M, Clotet B, Est JA and Martnez MA

(2006).Purifying selection of CCR5-tropic HIV-1 variants in AIDS subjects
that have developed syncytium-inducing CXCR4-tropic viruses. Journal of
General Virology, 87, 1285-1294.

Parera M, Fernndez G, Clotet B and Martnez MA. HIV-1 protease

catalytic efficiency effects caused by random single amino acid
substitutions. Mol. Biol. Evol. 2007, en impresin.