Saucedo-Luna et al.

ISEO DE UN BIOPROCESO PARA LA OBTENCIN DE

ETANOL ANHIDRO A PARTIR DE BAGAZO DEL Agave
tequilanaWEBER

Saucedo-luna J.1, Castro-Montoya A. J. 2, Martnez-Pacheco M.1 y Campos-Garca J.1

1

Instituto de Investigaciones Qumico-Biolgicas, 2 Facultad de Ingeniera Qumica, Universidad

Michoacana de San Nicols de Hidalgo, Morelia, Michoacn, Mxico.Tel 3164108 email:
jsaucedo@umich.mx.

RESUMEN
El bagazo de Agave tequilanaWeber es el desecho lignocelulsico que se produce en la
fabricacin del tequila. Debido a su composicin puede ser utilizado en la produccin de
qumicos de alto valor agregado, tal como el etanol. El creciente inters en la utilizacin de
residuos lignocelulsicos se justifica por el bajo costo de estos materiales y su naturaleza
renovable. Por lo anterior, los objetivos que conforman el presente proyecto refieren a la
implementacin de un bioproceso integral que contempla desde la caracterizacin de
bagazo, sacarificacin, la seleccin y obtencin de una cepa fermentadora, la fermentacin
de los hidrolizados, as como, la purificacin y obtencin de etanol anhidro. El anlisis del
bagazo del agave result con 42 % de celulosa, 20 % de hemicelulosa y 15 % de lignina.
Para la sacarificacin del bagazo del agave se utilizaron dos pasos de hidrlisis, un primer
paso de hidrlisis qumica y el segundo, hidrlisis enzimtica. En ambos casos se utiliz el
mtodo de superficie de respuesta para optimizar los resultados. Las condiciones ptimas en
la hidrlisis qumica son 147C, 2 % de H2SO4 como catalizador y 15 min de tiempo de
hidrlisis, el residuo del primer paso se llev a hidrlisis enzimtica, las condiciones ptimas
fueron 40C, 8 % de bagazo y 72 hrs. Con estas condiciones se obtuvieron 25.74 g/50 g de
bagazo tratado, para un rendimiento total de sacarificacin del 83 % con respecto al material
sacarificable. Los hidrolizados del paso anterior se fermentaron utilizando una levadura
obtenida del mismo bagazo del agave (UM-5), obteniendo 9.27 g/50 g de bagazo y
rendimiento de 70.61 % con respecto al terico. La deshidratacin del etanol se realiz con
desplazamiento del azetropo (CaCl2) y mallas moleculares 3 se obtuvo etanol con 98.6 %
w.
Palabras clave: Bioetanol, sacarificacin, biomasa lignocelulsica, hidrlisis.

INTRODUCCIN
El
agave
azul
(Agave
tequilanaWeber) es una planta que se
cultiva extensamente en Mxico, ya que es
la materia prima para la produccin de la
bebida alcohlica denominada tequila.
El bagazo es la fibra residual que se
obtiene despus de que el agave es
sometido al proceso de extraccin de

jugos para la produccin de tequila. Este

residuo representa aproximadamente el
40% del peso total de agave procesado
(Iiguez y col., 2001) y actualmente se
generan alrededor de 1.78x108 kg/ao, de
los cuales la mayora se utiliza como
composta. Relacionando el alto volumen de
generacin de este residuo con las nuevas

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

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Saucedo-Luna et al.

tendencias
de
produccin
de
biocombustibles y/o productos qumicos a
partir de materiales lignocelulsicos, que se
consideran como la nica fuente renovable
con el potencial para suministrar las
demandas energticas a nivel mundial
(Bozell, 2004), surge la idea de evaluar su
factibilidad de conversin a bioetanol.
Cabe mencionar que el proceso de
produccin de etanol a partir de materiales
lignocelulsicos comprende tres etapas:
hidrlisis de los polmeros celulsicos
hacia azcares, fermentacin de estos
ltimos hacia etanol y finalmente la
purificacin y deshidratacin para obtener
etanol anhidro.
Existen estudios de sacarificacin
para otras fuentes de biomasa como son:
bagazo de caa de azcar, residuos de
trigo, sorgo, pastos,
etc. Para estos
materiales
lignocelulsicos
se
han
reportado
diferentes alternativas de
procesamiento,
tales
como:
fsicos
(pulverizacin y pirlisis), fsico-qumicos
(explosin con vapor, amonio y bixido de
carbono) (Prior and Day, 2008), qumicos
(ozonlisis, hidrlisis cida, hidrlisis
alcalina,
deslignificacin
oxidativa,
organosolv), biolgicos y enzimticos (Sun
y Cheng, 2002; Lynd et al., 2005; Ruiz et
al., 2008). De todas estas alternativas la
mejor posicionada desde el punto de vista
econmico es la hidrlisis cida (Wyman,
1994).
La produccin de etanol ha tenido
como objetivo la obtencin de bebidas
alcohlicas para consumo humano
mediante destilacin. El uso del etanol
como materia prima o en la industria
qumica es extenso, pero su obtencin es
mediante la hidratacin cataltica del
etileno
(www.infoagro.go.cr/Agricola/tecnologia/
ATACORI). Recientemente la atencin
regresa a la produccin de etanol por
fermentacin para fines qumicos y

combustibles, debido a la aparicin de

nuevos
procesos
biotecnolgicos
(Hernndez-Salas et al., 2009; Zhao et al.,
2009).
Actualmente en los Estados Unidos
se utiliza maz como materia prima para la
produccin de etanol (Dien, 2002). El
almidn constituye aproximadamente el 70
% del maz, este polmero es roto
fcilmente, obtenindose glucosa la cual
puede fermentarse a etanol. De los residuos
lignocelulsicos se obtiene glucosa de la
celulosa y xilosa de la hemicelulosa. En el
caso de la glucosa la levadura recomendada
para la fermentacin de los hidrolizados es
Saccharomycescerevisiae, mientras que
para los hidrolizados que contienen xilosa
se recomienda levaduras genticamente
modificadas (Matsushika et al., 2008;
Ikram-ul-Haq, 2005). Otros estudios
describen la utilizacin de mezcla de
microorganismos como levaduras/bacterias
que pueden fermentar glucosa y xilosa al
mismo tiempo (Okuda et al., 2008;
Stephanopoulos 2007). Sin embargo, es
necesario explorar en los microorganismos
nativos encontrados en la naturaleza.
La tecnologa de produccin de
etanol se ha desarrollado rpidamente en
los ltimos 30 aos, de tal forma que ha
permitido una disminucin en los costos de
produccin
del
etanol,
de
2.47
dlares/galn en 1978 a 1.43 en 1994y 0.48
en 1999 (McAloon, 2000). Hasta el
momento no se espera reduccin de costos
significativos en base a modificaciones
tecnolgicas, por lo cual utilizar materias
primas de bajo costo es la clave para
reducirlos an ms.
El etanol puede ser utilizado como
combustible de automotores ya sea
mezclado con gasolina o de manera
independiente. Cualquiera de estas
opciones demanda que no haya presencia
de agua por lo que es necesario desarrollar
la tecnologa para su purificacin y lograr

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

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la obtencin de etanol anhidro; sin

embargo, al ser esta etapa la de mayor
consumo energtico de todo el proceso,
cualquier avance en la disminucin de la
energa requerida para la separacin del
etanol impactar de manera sobresaliente
en el rendimiento global del proceso.
Debido a la formacin de un azetropo en
la mezcla etanol-agua no es posible
purificarlo por los mtodos tradicionales de
destilacin, por lo que han surgido
diferentes alternativas como son: la
destilacin extractiva (Maciel y Brito,
1995; Lelkes, 2000), la adsorcin con
diferentes materiales como zeolitas, con los
mismos
materiales lignocelulsicos
[Carmo y Gubulin, 1997 a y b; Beery,
2001),
separacin
con
membranas
polimricas
(Tsuyumoto,
1997;
Jiraratananon, 2002; Kanti, 2004; Dubey,
2005) y la utilizacin de sales inicas para
el desfasamiento y/o ruptura del azetropo
(Iliuta y Thyrion, 1996; Pinto, 2000; Ligero
y Ravagnani, 2003). Existe un nmero muy
grande de esfuerzos que se han generado en
este sentido, sin embargo, no hay un
proceso ya establecido que logre las metas
de disminucin energtica. Por lo que el
presente estudio pretende generar un
bioproceso para la obtencin de etanol
anhidro
utilizando
residuos
lignocelulsicos de Agave procedentes de
la elaboracin del tequila.
MATERIAL Y MTODOS
Material crudo
El residuo de Agave tequilana
Weber fue recolectado de varias plantas
tequileras localizadas en Jalisco, Mxico
(El Quiote, El viejito, el consuelo). Las
muestras del bagazo de agave fueron
lavadas, secada al sol hasta peso constante
y molida a 0.5 mm de dimetro de
partcula. El material obtenido fue

homogeneizado y guardado en bolsas de

polietileno.
Composicin del bagazo
El anlisis de la fraccin principal
se realiz utilizando la hidrlisis cida
cuantitativa descrita por Browning, 1967.
La concentracin de glucosa, xilosa,
arabinosa y etanol en los hidrolizados
durante la sacarificacin y fermentacin
fueron determinados por HPLC con una
columna metacarb 87C de 300 x 7.8 mm
acoplada a una precolumnametacarb 87C
de 50 x 4.6 mm (Varian). El HPLC est
equipado con un refractmetro diferencial
Prostar 350, mdulo de calentamiento
Metatherm y automuestreador (Varian). La
temperatura en la columna se mantuvo en
70 C y el flujo de eluente (agua) fue de 0.6
mL/min. La cuantificacin de los
compuestos se realiz utilizando grficos
de calibracin obtenidos para glucosa,
xilosa, arabinosa y etanol (Sigma, Baker)
obteniendo coeficientes de r2 = 0.99. El
rendimiento de la hidrlisis cida y
enzimtica fue calculada con:

Sacarificacin del bagazo de agave

Hidrlisis cida
La hidrlisis cida se realiz en un
conjunto de reactores automatizados (Parr
Instruments, modelo 5000) de 75 ml cada
uno
(seis
en
total),
controlados
independientemente. Los reactores fueron
cargados con 50 mL (5 g de agave/50 mL),
cido sulfrico (1 a 3 %) y temperaturas de
125 a 175C. Las muestras fueron tomadas
a diferentes tiempos de acuerdo con el
diseo de experimentos. Una relacin de
1:9 (slido: lquido) se mantuvo en todos
los experimentos. Las muestras de los
reactores fueron filtradas y el slido fue
pesado. Los azcares en el hidrolizado

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

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fueron determinados como se describi

antes.
Hidrlisis enzimtica
La hidrlisis enzimtica del bagazo
de agave se realiz utilizando una mezcla
de celulasas, Celluclast 1.5L de
Trichodermaressei y una preparacin de glucosidasasNovozyme
188
de
Aspergillumniger (Novozymes). La dosis
fue de 59 FPU y 25 CBU /g de slidos
totales de Celluclast 1.5L y Novozyme 188
y concentracin de slidos totales de 6 a 14
% w/w. La reaccin se llev a cabo a 40C,
las muestras se centrifugaron, filtraron, el
hidrolizado recolectado y analizado con
HPLC.
Modelado matemtico
Para investigar los parmetros que
afectan el rendimiento de azcares en las
hidrlisis cida y enzimtica, se realiz un
diseo experimental 33 y 32 para la
hidrlisis
cida
y
enzimtica
respectivamente. Las variables en la
hidrlisis cida fueron H2SO4 (1 3 %),
temperatura (125 175C) y tiempo de
hidrlisis (24 72 hrs), la variable de
respuesta fue azcares fermentables. Para
la hidrlisis enzimtica las variables
utilizadas fueron la concentracin de
bagazo (6 14 % w/w), tiempo de
hidrlisis (24 72 hrs) y la variable de
respuesta, rendimiento de la hidrlisis (%).
Se utilizaron variables adimensionales y la
relacin entre valores codificados y
actuales est dada por la siguiente
ecuacin:

xi =

independiente en el punto central y

es
el incremento.
Para describir la relacin entre las
variables se utiliz la ecuacin general de
un polinomio de 2 grado.
Y= 0 + iXi+ iiXi2 + ijXiXj
En donde para la hidrlisis cida,
Y = azcares fermentables (g/L)
Xi,cuando i = 1, H2SO4 (% w/w)
i = 2, tiempo de hidrlisis
i = 3, Temperatura.
Para la hidrlisis enzimtica,
Y = rendimiento de la hidrlisis (%)
Para Xi, cuando i = 1bagazo cargado (%
w/w)
i = 2, tiempo de hidrlisis.
La fidelidad de modelo polinomial
se evalu de acuerdo con el coeficiente de
correlacin r2. Los parmetros del modelo
fueron evaluados estadsticamente por un
anlisis de varianza (ANOVA) y la prueba
de Fisher (F-test) con un nivel de
significancia de 0.05. Los grficos
generados por el modelo polinomial fueron
hechos utilizando StatgraphicsCenturion
XV (Statpoint Technologies, Inc. USA).
Fermentacin de los hidrolizados
Los hidrolizados obtenidos se
inocularon con el microorganismo aislado
del bagazo de agave. El pH de los
hidrolizados se ajust a 5 con Ca(OH)2 y
filtrados con papel Whatman. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a 30C con
8 mL de hidrolizado y 2 mL de cultivo en
medio YPD. La cuantificacin del etanol y
los azcares se determin por HPLC.

Donde xi es el valor codificado de

la variable independiente,
es el valor
actual,
es el valor actual de la variable

Purificacin y deshidratacin del etanol

El etanol obtenido se destil
utilizando el desplazamiento del azetropo
por sales inicas como CaCl2 y
posteriormente se pas por mallas
moleculares. La determinacin del etanol

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

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fue por HPLC y por densmetro digital

(Parrinstruments).

RESULTADOS Y DISCUSIN
Caracterizacin del bagazo de Agave
tequilana Weber variedad azul.
El bagazo de agave se analiz antes
y despus de la hidrlisis qumica, los
resultados se muestran en la siguiente tabla
1.

Hiptesis
El bagazo de Agave tequilana
Weber variedad azul que resulta del
proceso de produccin de Tequila es un
sustrato lignocelulsico viable para la
obtencin de etanol anhidro.

Tabla 1. Composicin del bagazo de agave antes y despus de la hidrlisis cida

Componentes

% en peso base seca(antes)

% en peso base seca(despus)

Celulosa

42 +/- 2

60 % +/- 1

Hemicelulosa

20 +/- 1

No se detect

Lignina

15 +/- 1

25 % +/- 1

Hidrlisis Qumica
Se realiz con tres variables
independientes, temperatura, tiempo y
concentracin de catalizador y una variable
respuesta, azcares fermentables. Se
reporta en este trabajo la hidrlisis
combinada.
El perfil de obtencin de azcares
fermentables se observa en la figura 1
como superficie de respuesta y en la parte
inferior la ecuacin de 2 orden obtenido.
Estimated Response Surface
X3=0.0

Fermentable sugars (g/L)

El contenido de celulosa y
lignina se increment despus del
tratamiento en 47.5 y 44.3 %
respectivamente. Al contrario, la
hemicelulosa fue degradada a sus
monmeros. La conversin de material
fue de 40 %. La diferencia en la
conversin con respecto a datos
reportados por Hernndez-Salas et al.
(2009) puede explicarse debido a la
temperatura
utilizada,
150C,
y
posiblemente a la naturaleza del bagazo
de agave el cual ya fue sometido a un
cocimiento durante el proceso de
elaboracin del tequila y puede tener
importancia en la apertura de la matriz
lignocelulsica, facilitando la catlisis
en la hidrlisis cida.

28
24
20
16
1

12
-1

0
X1

Sacarificacin del material

La sacarificacin se hizo por
hidrlisis qumica, hidrlisis enzimtica
y una combinacin de las anteriores.

-1

X2

sugars
14.0
15.2
16.4
17.6
18.8
20.0
21.2
22.4
23.6
24.8
26.0
27.2

Fig. 1. Superficie de respuesta en la

hidrlisis qumica.

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Azcares fermentables = 25.2446 +

1.79833*X1
0.933056*X2
0.120556*X3 - 5.34389*X1^2 2.76292*X1*X2 + 0.0383333*X1*X3 1.56306*X2^2 + 0.0429167*X2*X3 0.685556*X3^2

En la tabla 2 tenemos los niveles de

las variables codificadas y sus valores
actuales para la hidrlisis qumica y
enzimtica.

Las condiciones ptimas para

este paso fueron: 147C, 2.3% de H2SO4
y 15 min de tiempo de hidrlisis. Con
estas condiciones se obtiene 11.5 g / 50
g de bagazo
Fig. 2. Superficie de respuesta en la
hidrlisis enzimtica
Rendimiento = 55.9756 - 7.7*X1 +
12.865*X2
13.3233*X1^2
5.36375*X1*X2 + 2.59667*X2^2

Hidrlisis enzimtica
La hidrlisis enzimtica se
realiz con una mezcla de enzimas
comerciales
como
se
describi
anteriormente. Los resultados se
aprecian en la figura 2
Las condiciones ptimas para
este paso fueron: 8 % de bagazo de
agave, 40C y 72 hrs de tiempo de
hidrlisis. Permite obtener 12.24 g / 50
g de material tratado.

La tabla 3 muestra los experimentos

de confirmacin del modelo matemtico en
la hidrlisis cida.
La tabla 4 muestra los experimentos
de confirmacin del modelo matemtico en
la hidrlisis enzimtica.

Tabla 2. Valores de las variables en los diferentes niveles en las hidrlisis

Variable
Hidrlisiscida
H2SO4 (%, w/w)
Tiempo (min)
Temperatura (C)
Hidrlisisenzimatica
Bagazo de Agave (%, w/w)
Tiempo (hrs)

-1

niveles
0

X1
X2
X3

1
10
125

2
20
150

3
30
175

X1
X2

6
24

10
48

14
72

smbolo

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

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Saucedo-Luna et al.

Tabla 3. Comportamiento del modelo matemtico de la hidrlisis cida.

Azcaresfermentables (g/L)
X1
(% cat)
1.0
2.0
2.0
3.0

X2
(min)
20
15
20
20

X3
(C)
150
147
150
150

actual

prediccin

residual

18.52
24.90
24.9
21.0

18.12
25.8075
25.24
21.70

0.40
-0.9075
-0.3399
-0.70

error
(%)
2.20
3.51
1.34
3.22

Tabla 4. Comportamiento del modelo matemtico de la hidrlisis enzimtica

Rendimiento de lahidrolisis (%)
X1
(% agave)
8.2
6
10

X2
(hr)
72
48
48

actual

prediccin

residual

75.38
48.61
56.17

74.64
50.3523
55.9756

0.74
-1.7423
0.1944

Las tablas ponen de manifiesto

el ajuste de los modelos matemticos
obtenidos observndose un error
mximo de 3.51% para la hidrlisis
cida y de 3.46% para la enzimtica,
valores que indican la confiabilidad de
las ecuaciones.
Fermentacin de los hidrolizados
Los hidrolizados qumicos y
enzimticos se fermentaron por

error
(%)
0.99
3.46
0.34

separado con la levadura aislada del

bagazo de agave de acuerdo a las
condiciones descritas anteriormente. Los
resultados se presentan en la figura 3.
La fermentacin de los hidrolizados
permite obtener 9.27 g de etanol/ 50 g de
bagazo procesado, lo cual da un
rendimiento del 70 % con respecto al
terico.

Figura 3. Fermentacin de los hidrolizados qumicos y enzimticos por las cepas

etanolognicas
Purificacin y deshidratacin del
etanol
Para la purificacin del etanol se
utiliz destilacin con desplazamiento

del azetropo al utilizar sales de CaCl2.

Los resultados los observamos en la figura
4.

Ciencia Nicolaita No. Especial 2010

[Pgina 7]

Saucedo-Luna et al.

Figura 4. Desplazamiento de azetropo por CaCl2

Al pasar el etanol por mallas
moleculares se obtienen los resultados que
se muestran en la figura 5.

Etanol (%) destilado

Etanol al 92 %

100
90
80
0

10
15
20
Tiempo (min)

25

Figura 5. Deshidratacin de etanol en

mallas moleculares
La utilizacin de CaCl2 en la
destilacin abre la curva de equilibrio
etanol-agua, lo que permite disminuir la
cantidad de platos tericos en la columna
de destilacin hasta un 60%, sin embargo,
al llegar al azetropo los platos tericos
necesarios se hace infinita, por lo cual, se
puede aproximar hasta 95% con este
mtodo y continuar la deshidratacin con
mallas moleculares aprovechando as las
mejores propiedades de ambos mtodos.
CONCLUSIONES
El bagazo de Agave tequilana
Weber contiene 42% de celulosa y 20% de
hemicelulosa, lo que permite considerarlo
como material con alto potencial para

obtener etanol. La hidrlisis combinada es

ms eficiente para sacarificar el bagazo de
agave mostrando rendimientos del 83% con
respecto a los azcares tericos. La
produccin de etanol con levaduras
aisladas autctonas fue de 186 g de
etanol/Kg de bagazo procesado, con un
rendimiento de 70.61% con respecto al
valor terico.
La deshidratacin del etanol es
factible utilizando CaCl2 para desplazar el
azetropo hasta una concentracin de 95%
y de aqu utilizar mallas moleculares hasta
99% o ms.
Agradecimientos
A la Universidad Michoacana de San
Nicols de Hidalgo por la beca otorgada a JSL.
Al CONACYT, por el financiamiento otorgado
para la beca 204395.
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