HEMATOLOGIA
Volumen 9 - N 1, 2005
Automatizacin en hematologa
Nilda E. Fink
Ctedra de Hematologa, Departamento de Ciencias Biolgicas,
Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata.
47 y 115, 1990 La Plata, Argentina. E-mail: fink@biol.unlp.edu.ar
RESUMEN
Gran parte de la prctica del laboratorio hematolgico
se relaciona con observaciones que incluyen la identificacin de tipos de clulas y la interpretacin de la composicin de las poblaciones celulares sanguneas. Esta revisin describe la metodologa empleada en los instrumentos automatizados para el estudio hematolgico convencional, incluyendo la medicin de Hb, recuento de
glbulos rojos e ndices eritrocitarios, el recuento de
plaquetas, el recuento total y diferencial de glbulos
blancos y reticulocitos. Se describen las diversas tecnologas utilizadas para realizar las mediciones, ejemplificando su uso en los contadores hematolgicos automatizados modernos disponibles comercialmente.
Palabras claves: Automatizacin, Hematologa, Sistemas analticos, Tecnologa
REVISIN
AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
TABLA 1
Algunas caractersticas de autoanalizadotes hematolgicos modernos*
Tipo
Fabricante
Instrumento
Recuento diferencial
de leucocitos de
2-3 regiones
Abbott
ABX
Bayer
BD Bio-sciences
Beckman-Coulter
Roche
De alto volumen
Abbott
ABX
Bayer
Beckman-Coulter
Sysmex
Ao de
aparicin en US
Instalados al
2000 en US
Cell-Dyn 1200
Cell-Dyn 1700 y 1700CS
Micros 60
ADVIA 60
QBS Star
Coulter Ac-T series
Coulter Ac-T diff y diff 2
Coulter Onyx/Onyx AL
KX21
K-4500
1999
1995
1998
1999
1999
1996
1999
1994
1999
1995
110
2800
81
50
Nd
500
800
1300
100
nd
Cell-Dyn 3200
Cell-Dyn 3700
Cell-Dyn 4000
Pentra 60c+
Pentra 120 Retic
ADVIA 120
Coulter GEN-S
Coulter HmX
Coulter STKS
Coulter MAXM
Sysmex SF3000-Alpha 3000
Sysmex SF3000-Alpha
Sysmex SE9500/SE
Sysmex SE9500 Alpha 2
Sysmex SE9500R/SE
Sysmex XE2180/XL
1997
1999
1997
2000
1999
1998
1996
1999
1989
1991
1996
1997
1994
nd
1997
2000
>700
>300
>350
0
18
500
>1100
>100
>2600
>2100
100
nd
350
nd
350
nd
nos, entender crticamente las evaluaciones emprendidas por otros usuarios. Este aspecto no ser tratado en esta revisin, pero el lector puede remitirse MA
Fernndez Alberti y col4.
El desarrollo automatizado del recuento y la medicin del tamao de las clulas sanguneas parte de
tcnicas de recuento simple, que fueron descriptas en
la segunda mitad del siglo XIX y que fueron usadas
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TABLA 2
Recuento de clulas sanguneas en los primeros instrumentos
Caractersticas
Apertura-impedancia
Dispersin de luz
Coulter, 1956
Pasaje a travs de un orificio estrecho
Crosland-Taylor, 1953
Pasaje por una corriente estrecha por
flujo hidrodinmico
Haz de luz que atraviesa la corriente
de clulas
Cambios en la salida de un fotmetro,
contados electrnicamente
Fig. 2: Contadores de apertura-impedancia. La impedancia se mide entre un electrodo negativo dentro del tubo con orificio y el electrodo positivo en la dilucin de las clulas de la sangre. El rea delimitada por
lnea de puntos muestra la zona sensora por donde pasan las clulas. :
resistividad del electrolito, m: resistividad del electrolito modificada por
la partcula.
En el instrumento descripto por Coulter7, las clulas son conducidas a travs de un estrecho orificio,
detectndose los cambios de impedancia (Fig. 2).
La impedancia es efectivamente medida en la
zona sensora situada entre los electrodos colocados
a ambos lados del orificio. As, las clulas funcionan
como aislantes frente a los diluyentes salinos, de
modo que la impedancia aumenta transitoriamente
a medida que las clulas pasan a travs de la zona
sensora. Los cambios de impedancia transitorios producen impulsos elctricos que pueden ser contados.
Estos instrumentos han sido llamados contadores de
apertura-impedancia.
El instrumento descripto por Crosland-Taylor8
se basaba en hacer que las clulas pasen a travs
de un delgado haz de luz. La zona sensora estaba
restringida parcialmente por la estrechez del haz
de luz y por el pasaje de clulas en una corriente
de lquido muy delgada. A medida que las clulas
pasan a travs de la zona sensora, interceptan el
haz de luz que se dispersa, pudiendo ser colecta-
AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
Fig. 3: Contadores por dispersin de luz. La luz de la fuente lser se dirige hacia un foco y luego se dispersa. Una barrera impide la llegada de
luz al fotodetector. Cuando una clula entra en el foco, dispersa la luz,
que as pasa por fuera de la barrera, e impacta en el detector.
Las mejoras en la capacidad de medir el tamao tambin significa que es ms fcil discriminar entre diferentes tipos de clulas, por ejemplo las plaquetas
grandes pueden ser discriminadas ms fcilmente de
los eritrocitos pequeos.
En la prctica, para hacer el recuento celular tanto los sistemas de apertura-impedancia como los de
dispersin de luz son adecuados para contar eritrocitos, plaquetas o leucocitos totales. Sin embargo, es
necesario tener en cuenta cules son los requerimientos bsicos para un recuento exacto de cualquier tipo
de clula5:
-
El primer requisito es fcil de alcanzar, procurando que la sangre est bien mezclada antes del anlisis. En la actualidad, la mayora de los instrumentos
hacen esto en forma automtica y luego hacen las
diluciones con exactitud, generalmente por medio de
sistemas basados en jeringas calibradas.
El segundo requerimiento es ms difcil de lograr
en un instrumento automatizado. La mayora de los
fabricantes han elegido medir los recuentos por unidad de tiempo en lugar de la unidad de volumen de
dilucin. Por lo tanto, tales sistemas tienen que ser
calibrados para convertir los recuentos por unidad de
tiempo a recuentos por unidad de volumen.
El tercer requerimiento es de dificultad intermedia. Puede parecer excesivo afirmar que las clulas
deben ser contadas una vez, pero el problema es que
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Es l mtodo ms uniforme en todos los instrumentos y presenta dos opciones de uso comn (Tabla 3).
La primera es convertir la hemoglobina en
cianmetahemoglobina (HiCN) y luego medir la
absorbancia alrededor de 540 nm. En la prctica, sin
embargo, el tiempo del ciclo de los instrumentos disponibles en el mercado es tan corto que puede impedir que la conversin total se produzca por completo y que los derivados intermedios sean medidos.
La conversin a HiCN requiere el uso de un reactivo
TABLA 3
Fundamento de varias determinaciones hematolgicas en autoanalizadores de uso frecuente.
Instrumentos
Analito
Abbott
Bayer
Beckman
Coulter
Sysmex
Hemoglobina:
- Mtodo automatizado
HiCN
HiCN con Hb
celular directa
Absorcin a 546 nm
Citometra de flujo
HiCN
LSS-meta-Hb
Absorcin a 525 nm
Impedancia
Absorcin a 555 nm
Corriente directa
Peroxidasa y
densidad nuclear
1-99,9
Tecnologa VCS de
Coulter 3-D
0-99,99
Corriente directa y
frecuencia de radio
0-99,9
Optico
impedancia
Umbral fijo de
Impedancia
Indices ptico y
refractario que
permiten la
discriminacin
0,005-3000
Exactitud de
umbrales fijos en
la deteccin por
parmetro nico
0-999
Umbrales no fijos
que permiten la
discriminacin
- Mtodo de deteccin
Leucocitos totales
Leucocitos: diferencial
Leucocitos: linealidad
(109/L)
Plaquetas
Absorcin a 546 nm
Dispersin ptica/
fluorescencia
Dispersin ptica/
fluoresencia
0-250
0-999
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HCM
VCM
Puede observarse que un VCM subestimado causar una CHCM sobrestimada. Por esto, con los modernos contadores sanguneos, rara vez se observa que
la CHCM descienda marcadamente en la deficiencia
de hierro severa, como sucede cuando las mediciones
de Hb y hematocrito son hechas en forma manual y
la CHCM se calcula usando la frmula:
CHCM =
Hemoglobina
Hematocrito centrifugado
10
de los equipos de Bayer que llevan a la esfericidad
las clulas con un volumen constante y luego miden
el volumen celular a partir de la lectura mediante un
sistema de dispersin de luz, donde la misma incide
con dos ngulos diferentes. Despus, proceden a
transformar esas seales mediante un algoritmo especial basado en la dispersin ptica de partculas
esfricas dielctricas10.
En estos casos suele aplicarse la teora de Mie que
relaciona la dispersin de luz con el volumen y el
ndice de refraccin interno11. El uso prctico de la
teora de Mie proviene de observar la dispersin de
luz en cada clula individual, con un ngulo pequeo (2-3) y uno grande (5-15). La dispersin con un
ngulo pequeo est afectada primariamente por el
volumen y la dispersin con un ngulo grande, por
el ndice de refraccin interno, aunque cada uno est
afectado por ambos. Sin embargo, si ambos ngulos
de dispersin son ploteados uno contra el otro, la
posicin de cualquier impulso puede ser derivada
para medir el volumen y la concentracin de Hb de
la clula. Promediando las mediciones sobre muchas
clulas, se pueden derivar los valores medios que
equivalen al VCM y la CHCM5.
Como mencionamos antes, los cambios de forma
de los eritrocios deformados anormalmente en los
analizadores por apertura-impedancia, afectan la estimacin del VCM, la CHCM y el hematocrito. La
introduccin de la focalizacin hidrodinmica en los
equipos de apertura-impedancia, tales como el
Sysmex SE9500, parece reducir el efecto del cambio
de forma y de deformabilidad. En ese sentido, los
equipos de Beckman Coulter, particularmente para
CHCM, parecen estar afectados por no poseer esa
adaptacin10.
Reticulocitos
Los recuentos de reticulocitos teidos con varios
colorantes pueden realizarse en un instrumento automatizado, diseado para ese propsito, tal como el
Sysmex R3000, o en un citmetro de flujo convencional. Recientemente otros contadores hematolgicos
han incorporado una opcin de recuento de reticulocitos, en los que stos deben ser coloreados de
modo independiente y luego son introducidos dentro del contador para su anlisis.
En el caso de mediciones hechas con colorantes
fluorescentes, de acuerdo con la intensidad de fluorescencia, los reticulocitos se pueden dividir en tres
sectores que representan estadios diferentes de maduracin. El estadio ms joven, muy fluorescente, es
un indicador temprano de recuperacin, que aparece antes de un recuento de reticulocitos total elevado. Un alto recuento de elementos muy fluorescentes
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AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
11
maria o reactivas, trombocitopenia o cambios notorios en los eritrocitos. Una forma de estimular el inters y aumentar el conocimiento de los responsables
en la evaluacin correcta de preparaciones sanguneas y frotis de mdula sea es la discusin peridica de extendidos de inters especial. Un anlisis cuidadoso de frotis sanguneo es una herramienta muy
til para la evaluacin clnica. Por otro lado, la triada
de factores formada por la importancia, el gasto y el
error aleatorio llev a los directores de laboratorios
y a los ingenieros industriales a la conclusin de que
la automatizacin del recuento diferencial proporcionara informacin ms exacta, adems de reducir los
costos y los errores.
En relacin al almacenamiento de muestras de
sangre para hacer los frotis preparados con sangre
anticoagulada por EDTA, conservados durante no
ms de 60 minutos a temperatura ambiente, muestran pocos cambios comparados con los que se preparan inmediatamente despus de obtener la sangre.
Se pueden discernir cambios tres horas despus, y entre 6 y 8 horas posteriores a la extraccin, los cambios son notorios. Los leucocitos se vacuolan y muchos muestran cambios nucleares degenerativos,
mientras que las concentraciones de leucocitos y de
plaquetas disminuyen. Todo esto ocurre a mayor velocidad si la temperatura ambiente es ms alta y se
retrasa si la sangre se mantiene a 4C1.
Para el recuento diferencial visual de leucocitos,
las clulas individuales se clasifican adecuadamente
cuando se estudian en las etapas ms maduras. Sin
embargo, es difcil medirlas adecuadamente en frotis
sanguneos debido a la gran variacin en las fracciones numricas de poblaciones celulares. Los recuentos diferenciales visuales se realizan de modo rutinario en 100-200 clulas nucleadas. El coeficiente de
variacin al contar los leucocitos ms frecuentes (es
decir, linfocitos y neutrfilos) puede ser mayor al
25%, pero el de las clulas que ocurren en fracciones
numricas menores al 10% (es decir, eosinfilos y
monocitos) puede ser de hasta del 100%. La obtencin de resultados exactos de clulas que se presentan en fracciones numricas menores al 1% (es decir,
eritrocitos nucleados o basfilos) es prcticamente
imposible ya que el total de clulas evaluadas es de
100-200 (Tabla 4).
A pesar de estas limitaciones, el recuento diferencial visual constituye el estndar para comparar resultados obtenidos con analizadores hematolgicos
automatizados. El papel del examen visual de frotis
sanguneos sigue siendo importante en el laboratorio clnico, ya que los analizadores hematolgicos automticos pueden rechazar un alto porcentaje de
muestras consideradas como anormales que deben
evaluarse visualmente1.
12
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TABLA 4
Error de muestreo y variabilidad estadstica de recuentos
porcentuales en los recuentos diferenciales proporcionales*
N total de
clulas contadas
100
200
1000
10000
4-16
6-14
9-11
9.4-10.6
21-39
24-36
27-33
29-31
40-60
43-57
47-53
49-51
* Rango 95%
Fig. 6: Recuento diferencial leucocitario, usando dispersin de luz (vertical) y tincin de peroxidasa (horizontal). Los basfilos se estiman independientemente porque se superponen con los monocitos.
AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
Para el recuento diferencial de leucocitos automtico, el anlisis de imgenes tiene una aplicacin muy
limitada y de comercializacin reducida. En principio,
el anlisis de imagen automatiza y reproduce el recuento diferencial visual. Los frotis sanguneos se analizan con ptica de alta velocidad en una plataforma
controlada por computadora. Se simulan los criterios
del diferencial visual con algoritmos, enumerando las
subpoblaciones celulares en forma ms reproducible
y cuantitativa. Varios contadores de leucocitos por anlisis de imagen fueron producidos durante los aos 70
y al principio de los 80 (Lara de Corning Medical
Instruments, Hematrak de Geometric Data, Dic 4 de
Coulter Electronics, ADC-500 de Abbott Diagnostics).
Fueron desplazados del mercado por contadores ms
rpidos y completos1.
En los sistemas comerciales disponibles actualmente, se hacen recuentos de clulas sanguneas automticos incluyendo al menos un recuento diferencial de
blancos de cinco subclases. Estos analizadores usan
tecnologa sofisticada y constituyen un equipamiento
de ltima generacin que se integra a los laboratorios
de rutina. Las muestras sanguneas son procesadas en
sistemas de muestreo cerrados, usan sistemas automticos de lectura para la identificacin por cdigo de
barras y tienen interfases con el sistema de informacin del laboratorio para introducir las pruebas requeridas, los datos identificatorios del paciente y la obtencin de resultados. Procesan grandes cantidades de
muestras (ms de 100 por hora), se pueden seleccionar variantes que cubren un rango amplio de opciones informatizadas como es el establecimiento de alarmas, acumulacin de datos de control interno y produccin de resultados grficos de materiales de control interno y de muestras de pacientes.
13
En relacin con los aspectos tecnolgicos, es importante conocer qu informacin brindan los diferentes sistemas y qu tecnologa usan de acuerdo
con los distintos mtodos descriptos por los fabricantes. La capacidad y confiabilidad de los instrumentos para recuentos diferenciales evoluciona continuamente.
Actualmente, luego de que se ha usado el recuento diferencial por ms de 25 aos, la confiabilidad y
la exactitud del instrumental automatizado ha alcanzado niveles muy altos. Por ello, donde se dispone
de los mismos no es conveniente reemplazarlos por
el recuento manual basado en la revisin de solo 100
clulas. Cada laboratorio debe establecer criterios
para revisar los extendidos, basado en las alarmas del
instrumento, pero por lo general la revisin est ms
relacionada con la observacin de la morfologa de
eritrocitos o de plaquetas que a un problema en el
recuento diferencial leucocitario.
Pero a pesar de estos avances, an hay necesidad de examinar el extendido sanguneo para determinar la naturaleza de un recuento anormal de poblaciones leucocitarias y de la morfologa de
plaquetas y de eritrocitos. En 1994 se recomend,
luego de un estudio definitivo, no informar discriminadamente los neutrfilos en banda de los
neutrfilos totales y que era aconsejable usar el nmero absoluto de neutrfilos para detectar una infeccin. Hay dos indicaciones para la revisin de un
extendido en caso de recuentos leucocitarios normales, como el caso de un neonato con fiebre y pacientes con sospecha de fiebre tifoidea. La deteccin de
un recuento alto de neutrfilos en banda, asociado
a un recuento de neutrfilos normal, tiene un valor
clnico significativo14.
Una adicin interesante a la artillera diagnstica
de los nuevos contadores es la inclusin del dispositivo para hacer extendidos como el includo en el
Coulter GEN-S. El instrumento puede ser programado para producir extendidos centinela automticamente
cuando aparece cualquier alarma para eritrocitos,
plaquetas y glbulos blancos con datos identificatorios
includos15. Otro dato interesante es la graficacin de
eritrocitos no lisados como en los Sysmex NE 8000 que
permite detectar clulas resistentes a la lisis como es
el caso de las clulas en diana15.
Otra consecuencia del mejoramiento continuo del
instrumental es que se ha podido ampliar el uso de
las alarmas. Por ejemplo si no hay clulas inmaduras
o blastos, no hay necesidad de revisar el extendido
para buscar anormalidades en los neutrfilos a menos que el porcentaje de neutrfilos exceda el 90%.
As, a comienzos de los aos 90 en un centro
asistencial de agudos se hacan 100 revisiones manuales y esta cifra baj a 13%14-16.
14
Clulas madres o troncales
La concentracin de las clulas madres o troncales
(stem cells) es alta en mdula sea, en tanto que en
sangre perifrica es baja y pueden ser recolectadas
despus de tratar al paciente con quimioterapia seguida de factores de crecimiento, para aumentar su
concentracin.
Cuando se las recolecta por afresis es necesario
cuantificar la cantidad en sangre perifrica. Esto se
hace por inmunofluorescencia usando anticuerpo
monoclonal anti-CD34 FITC. Esta prueba requiere
tiempo y a veces no est disponible. Como estas clulas (stem cells) contienen pocos lpidos y son resistentes a la lisis por detergentes, pueden ser medidas
usando impedancia y radiofrecuencia tal como ha
sido desarrollado recientemente10. Esta prueba requiere poco tiempo comparado con las 2-3 h de la
citometra de flujo.
Ancho de la distribucin del volumen y de la
concentracin de hemoglobina eritrocitaria
Adems de estimar VCM es posible producir
histogramas que muestren el ancho de la distribucin
del volumen de eritrocitos (RDW). Tales histogramas
son tiles para medir la anisocitosis y para caracterizar situaciones en las que dos poblaciones eritrocitarias estn presentes, por ejemplo en la deficiencia de hierro que responde al tratamiento.
Si se utiliza una dispersin de luz de ngulo
dual es posible medir la concentracin de hemoglobina individual de un eritrocito y construir
histogramas que muestren el ancho de la distribucin de la concentracin celular de hemoglobina
(HDW).
Ancho de distribucin del volumen plaquetario
(PDW)
Este parmetro puede ser usado para determinar
el recuento de plaquetas as como para medir el volumen medio de la plaqueta y la anisocitosis plaquetaria. As, los contadores hematolgicos automatizados ofrecen un rango de los llamados nuevos
parmetros, tales como anisocitosis eritrocitaria y
plaquetaria, volumen medio de plaquetas y otros
ms que reflejan otras caractersticas de los
eritrocitos, plaquetas y leucocitos. Desafortunadamente, la mayora de estos parmetros tienden a ser
especficos de un instrumento y la comparacin de
los parmetros del mismo nombre puede resultar
pobre entre diferentes instrumentos, an del mismo
fabricante. Es probable que por esta razn hayan
encontrado poca aplicacin en la hematologa
diagnstica.
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15
AUTOMATIZACIN EN HEMATOLOGA
Todos los instrumentos de ltima generacin tienen buena conformidad con los requerimientos generales listados arriba y tienen relativamente pocas caractersticas distintivas.
Al seleccionar un contador uno puede requerir
desde un equipo que haga un bajo nmero de muestras por hora a un instrumento que resuelva un gran
nmero en el mismo lapso. Los comentarios siguientes tienen que ver con los equipos que procesan un
gran nmero de especmenes. Si se va a trabajar con
una poblacin anormal de pacientes, el nmero de
alarmas para el recuento manual es crtico si se quiere reducir la intensa labor de revisin manual de extendidos de sangre perifrica. Hay equipos que tradicionalmente tienen muchas alarmas tanto para datos normales como anormales, en particular para recuentos plaquetarios y para leucocitos inmaduros.
Para ello se introdujeron nuevas tecnologas y la posibilidad de contar con los cut off puestos por el usuario. Dependiendo de los equipos, la revisin de los
extendidos es cada vez menos requerida.
Tambin para reducir el trabajo, hay equipamientos que hacen marcado de extendidos
automticamente. Por otra parte, los hay para el
escaneo automtico de extendidos, anlisis de imgenes y proyeccin en monitor a color y de alta resolucin que hacen que la microscopa sea una actividad cada vez ms lejana, en los laboratorios que poseen esa tecnologa.
Se le han agregado otras funciones a los contadores automticos como el estudio de antgenos de diferenciacin en la superficie celular o marcadores
linfocitarios o el anlisis diferencial de clulas de
mdula sea. Es de remarcar que estos estudios conviene hacerlos con un citmetro de flujo destinado a
tal fin, con personal especializado. De todas formas
si se dispone de ese instrumental, esos estudios tienen un valor importante para el mdico. Hay argumentos a favor de que agregar mucha informacin
confunde al clnico y debe ser as ya que hay
parmetros como el VCM y RDW que an hoy resultan poco familiares.
A partir de los aos 90, particularmente en Japn,
se generaron sistemas de laboratorio de tercera generacin que estaban basados en dos conceptos claves
como la consolidacin y la integracin que permitieron
combinar distintas teconologas o estrategias analticas e integrar instrumental con dispositivos pre y
ABSTRACT
Most of the practices in the laboratory of
hematology are related with observations that include
the identification of cells and the interpretation of the
composition of blood cell populations. In this work,
the methodology used in automated instruments for
the conventional blood examination is reviewed,
including the measurement of hemoglobin, erythrocyte
count and erithrocyte indexes, platelets count, total
and differential leukocyte count, and reticulocytes.
Different technologies used for those measurements
are described, with examples of automated
hematology analyzers used, available in the market.
Key words: Automation, Hematology, Analytical
systems, Technology
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