Anda di halaman 1dari 9

ISOLASI DNA TANAMAN

ABSTRAK
DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi dua yaitu DNA
intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari dinding sel, membrane sel dan protein,
serta pemurnian DNA. Isolasi DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun
muda kemudian daun tersebut diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman sawi
hijau tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi
DNA dari tanaman Sawi Hijau (Brassica sp.). Hasil setelah penambahan kloroform dan isoamil
alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi terbentuk 2 fase yaitu fase aqoueous dan
organik. Setelah penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA.
Kata kunci : Tanaman, daun Sawi hijau, pemurnian DNA
I. Dasar Teori

Deoxyribo Nucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk
hidup. DNA merupakan senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu
generasi ke generasi selanjutnya. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat
ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas menunjukkan sifat
berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi semikonservatif, dan bebas dari protein
histon. DNA kloroplas penting dalam proses fotosintesis. DNA pada sel tanaman dibagi menjadi
dua yaitu DNA intrakromosomal dan DNA ekstrakromosomal (Donata, 2007).
DNA intrkromosomal merupakan DNA yang ditemukan di inti sel. Sedangkan DNA
ekstrakromosomal merupakan DNA yang ditemukan di sitoplasma sel. Pada sel-sel tanaman
DNA ekstrakromosal ini dapat ditemukan di mitokondria dan kloroplas (Farrel, 2004). Isolasi
DNA merupakan langkah mempelajari DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan
sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian
bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Muladno, 2002).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran
(lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta
pemurnian DNA (Donata, 2007). Terdapat berbagai macam metode isolasi DNA tanaman.
Metode-metode tersebut menggunakan CTAB dan SDS dalam ekstraksi DNA (Donata, 2007).
Beberapa metode isolasi DNA juga menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk
menghasilkan kualitas DNA terbaik. (Pharmawati, 2009). Sering digunakan untuk ekstraksi DNA
tanaman (Yuwono, 2008).
Metode tersebut pada dasarnya memiliki prinsip yang sama, namun ada beberapa hal
tertentu yang biasanya digunakan modifikasi untuk dapat menghancurkan inhibitor yang ada di
dalam masing-masing sumber spesimen. Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan
basa nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang
kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin dan
pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin. Pirimidin terdiri dari
dua jenis, yaitu timin dansitosin (Yuwono, 2008). Nukleus terdiri dari 90 % keseluruhan DNA
seluler. Sisa DNA adalah organel lain seperti mitokondria dan kloroplas (Heldt, 2005).

Karena DNA terdapat pada nukleus, maka perlu adanya metode pelisisan sel sampai
pemanenan sel. Sawi hijau (Brassica sp.) merupakan jenis sayur yang digemari oleh masyarakat
Indonesia. Kelebihan-kelebihan sawi antara lain baik bagi kesehatan tubuh, mampu tumbuh baik
baik di dataran rendah maupun dataran tinggi, tahan terhadap air hujan, dapat dipanen sepanjang
tahun tidak tergantung dengan musim, masa panennya cukup pendek, yaitu sekitar 40 hari
setelah tanam dan sawi mempunyai nilai ekonomi cukup tinggi setelah kubis krop, kubis bunga,
dan brokoli (Ardiana, 2009).
Dengan mengetahui DNA tanaman sawi maka dapat menghasilkan potensi yang cukup
besar untuk menghasilkan varietas-varietas sawi yang unggul yang lebih bernilai ekonomis dan
kompetitif.

Keragaman

varietas

yang

terus

berkembang

sejalan

dengan

sistim

perkembangbiakan tanaman. Namun informasi tentang genetik sawi masih sangat kurang. Oleh
karena itu pada praktikum kali ini mencoba untuk mengisolasi DNA tanaman sawi hijau. Isolasi
DNA sawi hijau ini dilakukan dengan mengambil potongan daun muda kemudian daun tersebut
diekstraksi hingga didapatkan DNA murni dari tanaman sawi hijau tersebut. Praktikum ini
dilakukan dengan tujuan agar praktikan mampu melakukan isolasi DNA dari tanaman Sawi
Hijau (Brassica rapa).
II. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA tanaman adalah alat tulis, mikropipet,
sentrifuga, vortex, waterbath, inkubator, yellow tips, blue tips, freezer, tip steril, tabung mikro 1,5
steril, gunting, timbangan analitik dan kamera.
Bahan yang digunakan adalah daun sawi hijau (Brassica sp.). yang masih muda 0,3 g, 500
L buffer ekstraksi (25 mM EDTA, 250 mM NaCl, SDS 0,5%, 200 mM Tris-HCl pH 7,5),
kloroform dan isoamil alkohol (24:1) sebanyak 1x volum sampel, isopropanol sebanyak 1x
volume sampel, dan 100 L buffer TE.
III.

Metode
Cara kerja untuk isolasi DNA tanaman yaitu pertama dengan menimbang daun sawi hijau

yang masih segar sebanyak 0,3 gram, tanpa pertulangan daun dan batangnya. Kemudian
dimasukan kedalam tabung mikro steril. Setelah itu lunakan daun selama 10 menit pada suhu
ruang, gunakan tip steril untuk menumbuk daun, tanpa penambahan buffer dan tambahkan 500
L bufer ekstraksi (200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS) ke
dalam tabung.

Kemudian kocok selama 5 detik kemudian Inkubasi tabung dalam waterbath pada suhu
600C selama 30 menit dengan tamabahan kloroform:isoamilalkohol (24:1)sebanyak 1x volume
sampel lalu kocok kemudian sentrifuga pada 6.000 x g selama 5 menit dan di ambil supernatan,
kemudian pindahkan ke tabung mikro yang baru, lalu tambahkan isopropanol sebanyak 1x
volume sampel, Kocok kemudian inkubasi pada suhu -20 0C selama 15 menit. Sentrifugasi pada
6.000 x g selama 5 menit, setelah itu supernatan, kemudian ditambahkan 100 L bufer TE dan
simpan pada suhu -200C.
IV.

Hasil dan Pembahasan


Hasil yang didapatkan dari praktikum isolasi DNA tanaman sawi hijau (Brassica sp.) dapat

dilihat pada tabel berikut ini :


No
1

Gambar

Keterangan
Daun

hasil

penumbukan

dan

ditambahkan buffer
ekstraksi
a.

dan

divortex
Daun

ekstraksi
Terbentuk

buffer
2

fase

setelah penambahan
kloroform
isoamil
(24:1)

alkohol
1x

sampel
a.

dan
volum
dan

disentrifugasi.
Fase aqueous
(supernatan
yang

mengandung DNA)
a. Fase organik (debris
dan

protein

terdenaturasi)

yang

Supernatan

yang

telah dipindahkan ke
a.

tabung mikro baru


supernatan

Supernatan
telah

yang

ditambahkan

isopropanol dingin 1
x volum sampel
a.
Terlihat benangbenang tipis DNA
Pelet

yang

telah

ditambahkan dengan
100 L buffer TE
a. buffer TE
b. Pelet (mengandung
DNA)

Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.), langkah
pertama yang dilakukan adalah penghancuran membran dan dinding sel pada daun muda yang
digunakan. Isolasi DNA tanaman ini digunakan daun yang masih muda hal ini dikarenakan
dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga dapat memperbesar
kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita inginkan.
Hal ini diperkuat dengan pernyataan Zubaidah (2004), pada bagian tanaman banyak
memiliki senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA, senyawa polifenol dan polisakarida juga dapat mempengaruhi enzim-enzim
seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim yang mengakibatkan DNA tidak
digunakan dalam praktikum Biologi Molekuler.
Penghancuran bertujuan untuk merusak jaringan yang ada pada sel sehingga
mempermudah bahan-bahan kimia lain yang akan digunakan untuk masuk ke dalam organelorganel sel, dalam hal untuk mengambil DNA. DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali

terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan
flavonoid. Sedangkan DNA dari hewan lebih banyak mengandung protein.
Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel
untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan
seringkali pada beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam
nukleat. Pembukaan sel untuk mengeluarkan asam nukleatnya pada praktikum ini dengan cara
mekanik yaitu digerus dengan tip steril pada tabung mikro atau dapat juga menggunakan bahan
kimia yaitu nitrogen cair untuk mendegradasi dan melarutkan komponen dinding sel.
Pada saat proses destruksi jaringan tanaman dapat menyebabkan degradasi pada DNA
dengan adanya aktivitas enzim endonuklease, karena itu digunakan buffer ekstraksi yang
mengandung senyawa 200 mM Tris-HCl (pH 7.5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, dan 0,5 %
SDS. DNA akan terpisah menjadi suatu larutan dan dapat dimurnikan (dipurifikasi) melalui dua
cara yang umum dilakukan yaitu sentrifugasi dan ekstraksi kimia.
Sampel disentrifugasi dengan kecepatan yang tinggi sehingga komponen yang berukuran
lebih besar atau lebih berat akan mengendap membentuk sedimen pada bagian bawah tabung.
SDS berfungsi untuk melisis dinding sel tumbuhan yang terdapat dalam larutan sampel. Ini
disebabkan karena sifat dari SDS sama dengan sifat dinding sel yang hidrofobik, sehingga terjadi
ikatan diantara keduanya dan menyebabkan dinding sel rusak.
Setelah ditunggu beberapa menit, sampel selanjutnya diinkubasi. Muladno (2002), buffer
lysis ini mengandung EDTA yang berfungsi merusak dinding sel secara kimiawi dengan cara
mengikat ion magnesium berfungsi mempertahankan integritas sel maupun aktifitas enzim
nuclease yang merusak asam nukleat. Kotoran (debris) yang dihasilkan dari aktivitas lysis ini
dibersihkan dengan cara sentrifugasi agar kotoran mengumpul didasar tabung mikro.
Untuk membersihkan protein dan polisakarida dari larutan digunakan kloroform
sedangkan kondisi yang lebih ekstrem, dapat digunakan proteinase. DNA yang telah diekstraksi
dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan komponen penyusun sel lainnya
seperti polisakarida dan protein agar DNA yang didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi.
Tahap selanjutnya yaitu sampel yang telah vortex selama 5 detik dan kemudian
diinkubasikan isolasi pada suhu 60C selama 30 menit, hal ini bertujuan agar enzim bekerja
secara optimal setelah ditambahkan buffer ekstraksi. Kemudian dilakukan ditambahkan

kloroform dan isoamil alkohol (24:1) 1x volum sampel dan disentrifugasi untuk mendapatkan
supernatan.
Terbentuk 2 fase setelah penambahan CIA dan disentrifugasi yaitu fase cair ( supernatan )
dan fase organik. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan Pharmawati, (2009) menyebutkan
bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan
bawah dan fase aquoeus (air) pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase
aquoeus setelah sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan
lipid akan berada pada fase organik.
Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air. Disamping itu, protein
juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik.
Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut
organik. Biasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang
mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik.
Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi
berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke
dalam fase antara kloroform air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut dapat
menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan
terpisah pada lapisan kloroform (Doyle, 1990).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara kloroform-air.
Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan kloroform. Hal ini hanya dapat
dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat
bercampur dengan air. Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke
kloroform untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroformair yang mana protein akan mengalami presipitasi.
Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang
sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.00050.000 bp). DNA kemudian diikat
dari fase aquoeus dengan presipitasi isopropanol (Muladno, 2002). Setelah proses ekstraksi,
DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi. Pada umumnya digunakan isopropanol
dingin untuk mengendapkan, melekatkan dan memisahkan DNA dari larutan.

Pada saat penambahan isopropanol dingin terlihat benang-benang tipis DNA tanaman
berwarna putih yang melayang di larutan tersebut. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi
DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk
pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Menurut Heldt (2005) bahwa presipitasi berfungsi untuk
menghilangkan residu-residu kloroform yang berasal dari tahapan ekstraksi.
Menurut Yuwono, (2008) prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama, menurunkan
kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air yang polar mengelilingi
molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif dari air berinteraksi dengan muatan
negatif pada gugus fosfodiester DNA. Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air.
Isopropanol dapat bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air.
Molekul isopropanol tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat
sehingga isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan
isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA akan
terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan aktivitas molekul air
sehingga memudahkan presipitasi DNA. Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi
akan terpisah dari residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa.
Residu tersebut juga mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan
berada dalam bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet
dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah DNA pekat.
Proses presipitasi kembali dengan isopropanol sebelum pellet dikeringanginkan dapat
meningkatkan derajat kemurnian DNA yang diisolasi (Farrel, 2004).
Tahap selanjutnya yaitu tabung dikocok dan diinkubasi pada suhu -20 0C selama 15 menit.
Hal ini dilakukan untuk optimalisasi kerja isopropanol. Kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 6.000 rpm x g selama 15 menit. Proses sentrifugasi ulangan dilakukan untuk
mendapatkan pellet DNA. Tahap selanjutnya yaitu tabung di sentrifugasi kembali pada kecepatan
6.000 rpm selama 15 menit. Hasil yang didapat yaitu berupa supernatan yang bening dan pelet
(endapan DNA murni) yang berwarna putih terdapat pada dasar tabung.
Kemudian supernatan tersebut dibuang karena DNA berada pada bagian natan. Menurut
Donata (2007) DNA murni yang dihasilkan adalah DNA yang terbebas dari campuran material
dan komponen intraceluler yang mengandung larutan kompleks berupa RNA, protein, lemak dan

karbohidrat. Setelah itu ditambahkan 100 L buffer TE ke dalam tabung yang berisi pelet dan
kemudian disimpan di dalam freezer dengan suhu sekitar -20C.
Ardiana, (2009) menyatakan bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20C
bertujuan agar sampel DNA yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu bermingguminggu. Pharmawati, (2009) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE juga
dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah dibandingkan DNA
sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh RNA dan DNA sangat stabil ketika
disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada suhu -20C.
V.
Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa, praktikan mampu
melakukan isolasi DNA tanaman Sawi hijau (Brassica sp.) dengan cara penghancuran (lisis),
ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti dinding sel, membran sel dan protein,
serta dapat melakukan pemurnian DNA. Pada isolasi DNA ini digunakan daun muda atau pucuk,
hal ini dikarenakan dipucuk daun dapat menekan senyawa polifenol dan polisakarida sehingga
dapat memperbesar kemungkinan keberhasilan untuk melakukan isolasi DNA yang kita
inginkan.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana, D.W. 2009. Teknik isolasi DNA genom tanaman papaya dan jeruk dengan menggunakan
modifikasi buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14(1): 12-16.
Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta kegagalan dalam
PCR dan elektroforesis.Erlangga. Jakarta.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.
Farrel, R.E. 2004. RNA Methodologies: A Laboratory Guide for Isolation and Characterization. Third
Edition. Elsevier Academis Press. London. Hal. 693-705.
Heldt, H. W. 2005. Plant Biochemistry. Third Edition. Elsevier Academic Press. California. Hal. 491Doyle
JJ, Doyle JL. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12: 13-15.
Muladno. (2002). Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pusataka Wirausaha Muda. Bogor
Pharmawati, M. 2009. Optimalisasi ekstraksi DNA dan PCR-RAPD pada grevillea spp. (Proteaceae). Jurnal
Biologi 13(1): 12-16.
Ribeiro RA, Lovato MB. 2007. Comparative analysis of different DNA extraction protocols in fresh and
herbarium specimens of the genus Dalbergia. Genet. Mol. Res. 6: 173-187.
Yuwono, Triwibowo. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Penerbit Erlangga
Zubaidah. 2004. Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten
Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir. Bandung.