Boletim de Pesquisa 88

e Desenvolvimento

ISSN 1679-6543
Dezembro, 2013

Determinao de Acares Redutores

pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico:
Histrico do Desenvolvimento do Mtodo
e Estabelecimento de um Protocolo para o
Laboratrio de Bioprocessos

Acar reduzido
(grupo carbonil livre)

cido 3,5-dinitrosaliclico

Acar oxidado
(grupo carboxil)

Condies alcalinas
Aquecimento

cido 3-amino, 5-dinitrosaliclico

ISSN 1679-6543
Dezembro, 2013
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuria
Embrapa Agroindstria Tropical
Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 88
Determinao de Acares
Redutores pelo cido
3,5-Dinitrosaliclico: Histrico

do Desenvolvimento do Mtodo e
Estabelecimento de um Protocolo para
o Laboratrio de Bioprocessos
Natlia Moura de Vasconcelos
Gustavo Adolfo Saavedra Pinto
Fernando Antnio de Souza Arago

Embrapa Agroindstria Tropical

Fortaleza, CE
2013

Unidade responsvel pelo contedo e edio:

Embrapa Agroindstria Tropical
Rua Dra. Sara Mesquita 2270, Pici
CEP 60511-110 Fortaleza, CE
Fone: (85) 3391-7100
Fax: (85) 3391-7109
www.cnpat.embrapa.br
cnpat.sac@embrapa.br
Comit de Publicaes da Embrapa Agroindstria Tropical
Presidente: Marlon Vagner Valentim Martins
Secretrio-Executivo: Marcos Antnio Nakayama
Membros: Jos de Arimatia Duarte de Freitas, Celli Rodrigues
Muniz, Renato Manzini Bonfim, Rita de Cassia Costa
Cid, Rubens Sonsol Gondim, Fbio Rodrigues de Miranda
Reviso de texto: Marcos Antnio Nakayama
Normalizao bibliogrfica: Rita de Cassia Costa Cid
Figura da capa: Gustavo A. S. Pinto
Editorao eletrnica: Arilo Nobre de Oliveira
1a edio (2013): verso eletrnica

Todos os direitos reservados

A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em parte, constitui
violao dos direitos autorais (Lei no 9.610).
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)
Embrapa Agroindstria Tropical
Vasconcelos, Natlia Moura de.
Determinao de acares redutores pelo cido 3, 5-dinitrosaliclico: histrico do
desenvolvimento do mtodo e estabelecimento de um protocolo para o laboratrio
de bioprocessos / Natlia Moura de Vasconcelos, Gustavo Adolfo Saavedra Pinto,
Fernando Antnio de Souza Arago. Fortaleza: Embrapa Agroindstria Tropical,
2013.
29 p. : il. ; 14,8 cm x 21 cm. (Boletim de pesquisa e desenvolvimento /
Embrapa Agroindstria Tropical, ISSN 1679-6543 ; 88).
1. Acares redutores. 2. cido 3,5- dinitrosaliclico. 3. Espectrofotometria.
I. Pinto, Gustavo Adolfo Saavedra. II. Arago, Fernando Antnio de Souza. III. Ttulo.
IV. Srie.
CDD 547.23

Embrapa 2013

Sumrio

Resumo.......................................................................4
Abstract.......................................................................6
Introduo....................................................................7
Material e Mtodos......................................................10
Resultados e Discusso................................................15
Concluso..................................................................22
Referncias................................................................23

Determinao de Acares
Redutores pelo cido
3,5-Dinitrosaliclico: Histrico

do Desenvolvimento do Mtodo e
Estabelecimento de um Protocolo para
o Laboratrio de Bioprocessos
Natlia Moura de Vasconcelos1
Gustavo Adolfo Saavedra Pinto2
Fernando Antnio de Souza Arago3

Resumo
A determinao de acares redutores uma atividade de rotina em
diferentes laboratrios de pesquisa. A anlise espectrofotomtrica,
baseada no emprego do cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS), simples
e robusta, permitindo em um dia de trabalho a quantificao de um
grande nmero de amostras. Apesar de os trabalhos de Bernfeld (1955)
e Miller (1959) terem sistematizado duas variaes dessa anlise e
serem amplamente citados, na maioria dos casos so desconhecidos
de seus usurios, e seu contedo, pouco seguido. O desconhecimento
origina modificaes e pseudoverdades sobre o mtodo, que aparecem
de forma aleatria, mas possuem elevado poder de disseminao e
mutao. Dessa forma, os objetivos deste trabalho foram realizar
um levantamento histrico da evoluo do mtodo, avaliar alguns
pontos crticos para sua execuo, decorrentes da vivncia diria, bem
como propor uma reduo no volume de reagentes utilizados e de
resduos gerados. Os resultados confirmam a robustez do mtodo e sua
1

Engenheira de alimentos, tcnica do Laboratrio de Bioprocessos da Embrapa Agroindstria Tropical,

Fortaleza, CE, natalia.vasconcelos@embrapa.br
2
Qumico, D.Sc. em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, pesquisador da Embrapa
Agroindstria Tropical, Fortaleza, CE, gustavo.saavedra@embrapa.br
3
Engenheiro-agrmono, D.Sc. em Melhoramento Gentico Vegetal, pesquisador da Embrapa
Agroindstria Tropical, Fortaleza, CE, fernando.aragao@embrapa.br

capacidade de utilizao para um grande nmero de amostras dirias,

desde que seguidas algumas recomendaes. Tambm possvel
propor com segurana a utilizao de menores volumes de reagentes,
o que implica menor gerao de resduos se comparado ao descrito nos
artigos de Bernfeld (1955) e Miller (1959).
Termos para indexao: acares redutores, cido 3,5-dinitrosaliclico,
espectrofotometria.

Determination of Reducing
Sugars by 3,5-Dinitrosalicylic
acid: Historical Development of
the Method and Establishment of
a Protocol to the Laboratory of
Bioprocess

Abstract
Determination of reducing sugars is a routine activity for different
research labs. Spectrophotometric analysis based on the use of 3,5dinitrosalicylic acid (DNS), is simple and robust, allowing for a working
day quantification of a large number of samples. The works of Bernfeld
(1955) and Miller (1959), which having two systematic variations of
this analysis, are widely cited, however in most cases are not known
to his users. Ignorance leads modifications and called truths about
the method, which appear randomly, but have high power to spread
and "self-mutation". The objectives of this study were to assess the
historical evolution of the method, to evaluate some critical points for
its execution resulting from daily experience, as well as to propose a
reduction in the volume of reagents used, then the waste generated.
The results confirm the robustness of the method and its usability for a
large number of samples daily since followed some recommendations.
It is also possible to safely propose the use of smaller volumes of
reagents, which leads to a reduction in waste generation compared to
that described in the articles by Bernfeld (1955) and Miller (1959).
Index terms: reducing sugars, 3,5-dinitrosalicylic acid,
spectrophotometry.

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Introduo
Sumner (1921) desenvolveu o mtodo para determinao de acares
redutores em urina de pacientes com e sem diabetes, baseado na
capacidade de o cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) ser reduzido pela
glicose a composto nitroamino anlogo (cido 3-amino-5-nitrosaliclico),
altamente colorido (Figura 1). Esse composto aromtico absorve
fortemente a luz, sendo possvel, assim, estabelecer uma relao direta
entre a medida colorimtrica e a quantidade de acares redutores
presente (GONALVES, 2010). No mtodo relatado por Sumner
(1921), 1,0 mL de amostra era misturado com 1,0 mL de soluo 2%
de DNS e 2,0 mL de soluo de NaOH 1,5%. A mistura homogeneizada
deveria ser aquecida por 5 minutos a 100 oC, para em seguida ser
resfriada, e diluda a 25 mL.
Acar reduzido
(grupo carbonil livre)

Acar oxidado
(grupo carboxil)

Condies alcalinas
Aquecimento
Figura 1. Reao utilizada para a determinao espectrofotomtrica de acares
redutores, baseada na converso do cido 3,5-dinitrosaliclico em seu anlogo
reduzido.

Sumner (1924) apresentou modificaes ao mtodo decorrentes de

3 anos de aperfeioamento, as quais consistiram de: introduo do
tartarato duplo de sdio e potssio (ou sal de Rochelle), alterao
das quantidades de reagentes utilizadas e sua unificao em uma
nica soluo. Segundo o autor, as modificaes possibilitaram:
a preveno da destruio de parte das molculas de acar pelo
oxignio que dissolvido durante o processo de aquecimento; o
aumento da quantidade de cor gerada, propiciando melhor deteco de
pequenas quantidades de glicose; e estoque do reagente por perodo
indeterminado.

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Dessa forma, Sumner (1924) indicou que o reagente deve ser

preparado a partir de 300 mL de soluo hidrxido de sdio 4,5%,
livre de carbonato (o que se consegue com reagente novo, 800 mL de
soluo 1% de cido 3,5-dinitrosaliclico e 255 g de sal de Rochelle.
Para a anlise, 1,0 mL de amostra passaria a ser misturado a 3,0 mL do
reagente. As condies de reao (tempo e temperatura) bem como a
diluio para leitura no foram alteradas.
A adio de fenol foi proposta visando aumentar a quantidade de cor
gerada. Apesar de no apresentar nenhuma atividade redutora sobre
as molculas de DNS, o fenol incrementa a quantidade de cor gerada
pela glicose, podendo chegar a 300% (SUMNER, 1925). Contudo, a
cor gerada na presena de fenol no apresenta estabilidade. Quando
em repouso, a qualidade da cor pode mudar em contato com o ar. Para
prevenir essa alterao indesejvel, pequenas quantidades de bissulfito
de sdio devem ser incorporadas ao sistema. Para esse novo reagente,
10 g de fenol cristalizado devem ser dissolvidos em 22 mL de soluo
10% de hidrxido de sdio, para em seguida o volume ser completado
a 100 mL. A cada 69 mL da soluo alcalina de fenol, devem-se
adicionar 6,9 g de bissulfito de sdio, para ento ser adicionada a
soluo descrita em Sumner (1924).
Sumner (1934) utiliza o mtodo de DNS para determinao de atividade
de invertase, em substituio a medidas polarimtricas; porm, no
introduz novas modificaes. Contudo, Bernfeld (1955), ao transpor o
mtodo para determinao da atividade de e -amilases, retornou ao
descrito por Sumner (1924), retirando o fenol e o bissulfito de sdio,
mas passou a utilizar a proporo de 1:1 entre amostra (2,0 mL) e
soluo reacional (2,0 mL).
Miller (1959) traz um extenso estudo sobre o uso do DNS na
determinao de acares redutores, focando na perda de parte
dos acares redutores durante o teste, fato observado tanto por
seu grupo quanto por outros, mas nunca at ento investigado. Seu
trabalho teve como ponto de partida o de Sumner (1925) e, ao final,
props um mtodo otimizado, segundo o qual o reagente modificado
deve conter 1% de cido 3,5-dinitrosaliclico, 0,2% de fenol, 0,05%

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

de bissulfito de sdio e 1% de hidrxido de sdio. Ao contrrio de

todos os demais procedimentos, Miller (1959) indica que todos os
reagentes slidos devem ser adicionados e dissolvidos sob agitao
simultaneamente no volume equivalente de soluo de hidrxido de
sdio. A marcha analtica tambm foi alterada. Nela, 3 mL de amostra
so homogeneizados com 3 mL do reagente modificado e aquecidos
em banho de gua fervente por 15 minutos. O aumento do tempo foi
recomendado, pois, com 5 minutos, o desenvolvimento da cor no
seria completo. Logo aps o aquecimento, mas antes do resfriamento
dos tubos temperatura ambiente, 1 mL de soluo 40% de sal de
Rochelle deve ser acrescentado e homogeneizado. A presena do sal de
Rochelle na composio do reagente foi apontada como a explicao da
perda parcial de molculas de glicose.
Desde ento, os trabalhos de Bernfeld (1955) e Miller (1959) sobre
o uso do DNS para a determinao de acares redutores tornaram-se
clssicos na literatura cientfica, tendo sido citados, at final de junho
de 2012, respectivamente por 3.332 e 8.174 artigos listados na base
Web of Science. No meio acadmico brasileiro, o artigo de Miller
(1959) comumente citado em artigos, dissertaes e teses.
No entanto, apesar de essas duas referncias serem citadas nas
metodologias analticas, em muitos casos elas nem sempre so
literalmente seguidas. J presenciamos laboratrios utilizarem variantes
de Miller (1959) distintas do trabalho original em preparo do reagente,
tempo de reao e volume de ajuste para leitura. Diversas variaes,
muitas delas oriundas de adaptaes prticas laboratoriais, surgiram
ao longo do tempo. Elas no representam metodologias referenciveis,
uma vez que, em sua maioria, no existem relatos experimentais
publicados, ou sequer escritos, das modificaes realizadas.
Concomitantemente s modificaes no relatadas, tambm surgem
lendas laboratoriais, capazes de se perpetuarem com a transmisso
do conhecimento intralaboratorial de um usurio mais antigo para
um mais novo. Essas lendas podem, ainda, ultrapassar as paredes de
determinado laboratrio, indo para outro, ou outros. Algumas dessas
lendas tambm se referem estabilidade da mistura reacional antes e

10

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

depois da reao de formao de cor. Diversas vezes, a incerteza dos

analistas quanto a essa questo j foi presenciada por ns. Alguns
afirmam que a amostra pode permanecer em contato com o reagente
antes da reao de formao de cor por perodo indeterminado, j
outros sugerem que isso s pode ocorrer aps a reao. Ghose (1987)
afirma que as misturas submetidas fervura podem ser deixadas em
repouso por uma quantidade razovel de tempo antes da leitura, e que
amostras no submetidas a esse processo se deterioram gradualmente.
Contudo, o autor no estima a quantidade de tempo em que as
amostras permanecem ou no estveis.
Juntamente com as questes tcnicas referentes ao mtodo propriamente
dito, tm surgido preocupaes com o passivo ambiental de cada
anlise, que pode ser bastante significativo, dependendo da demanda
do laboratrio. O descarte desses compostos em guas residuais deve
ser desencorajado, uma vez que, numa escala de 0 a 4 do Diagrama de
Hommel, o cido 3,5-dinitrosaliclico apresenta nvel 3 de riscos sade,
enquanto o fenol representa nvel 4 (NATIONAL..., 2007).
Dessa forma, este trabalho avaliou a variante metodolgica de Bernfeld
(1955) em uso nos laboratrios da Embrapa Agroindstria Tropical,
a fim de melhorar a qualidade dos resultados obtidos, averiguar
a possibilidade de reduzir o volume de reagentes utilizados (e,
consequentemente, o passivo gerado) e descrever detalhadamente a
metodologia a ser empregada.

Material e Mtodos
Procedimentos gerais
Os procedimentos descritos neste item no sofreram variaes em sua
execuo durante a conduo deste trabalho.
Preparo do reagente cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS)
Para um volume final de 1.000 mL, 10 g de cido 3,5-dinitrosaliclico
devem ser adicionados a 200 mL de uma soluo 2 M de hidrxido de

11

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

sdio recm-preparada (soluo A). Em paralelo, 300 g de tartarato

duplo de sdio e potssio devem ser dissolvidos em 500 mL de gua
destilada (soluo B), sob aquecimento e agitao constantes. Ainda
nessas condies, deve-se adicionar a soluo A sobre a soluo B at
a completa dissoluo do DNS. Aps resfriamento, transferir a mistura
para balo volumtrico de 1.000 mL e aferir o volume com gua
destilada. O reagente deve ser armazenado em frasco de polipropileno
etiquetado, datado, ao abrigo da luz.
Obs. 1: normal que o DNS no dissolva na soluo alcalina e forme
pelotas que se depositam no fundo do recipiente.

Marcha analtica
Transferir alquota de volume conveniente de cada amostra para
tubos de ensaio. Adicionar volume igual do reagente DNS a cada
tubo. A mistura deve ser agitada vigorosamente. Os tubos devem ser
levados para banho-maria com gua em ebulio (100 C) pelo tempo
determinado para o experimento. A reao interrompida imergindo
os tubos em banho de gua fria. A mistura ser diluda com gua
destilada. Aps homogeneizao, realizar a leitura da intensidade da cor
em espectrofotmetro a 540 nm, contra uma amostra de calibrao,
usualmente chamada de branco.
Obs. 2: A agitao para homogeneizao das duas solues (amostra e
DNS) muito importante. No faz-la ou faz-la de forma suave
pode acarretar na ocorrncia de duas fases. A reao de formao
de cor somente ir ocorrer na interface e, com isso, mascarar
totalmente o resultado.
Obs. 3: A amostra de calibrao (branco) utilizada para zerar a
absorbncia no equipamento. Para prepar-la, substituir a amostra
por gua destilada e seguir o procedimento descrito na marcha
analtica. O branco deve sempre receber o mesmo processamento
das demais amostras durante as anlises.
Obs. 4: Na marcha analtica, tempo de reao e diluio final do sistema
no foram detalhados, uma vez que so alguns dos parmetros
alvos do presente estudo, sendo definidos no item Resultados e
Discusso.

12

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

O clculo da concentrao de grupos redutores totais (GRT), em g L-1

deve ser realizado de acordo com a Equao 1:
GRT = abs x f x d

(Eq. 1)

em que:
abs mdia das absorbncias lidas.
f fator de concentrao.
d inverso da diluio da amostra.
Soluo-me e curva-padro de glicose
Para o preparo da soluo-me de glicose, pesar 1,0 g de glicose
anidra e transferir analiticamente para balo volumtrico de 1,0 L. Aps
dissoluo, aferir o volume com gua destilada.
A partir da soluo-me de glicose 1,0 g L-1, preparar solues com
concentraes variando de 0,1 g L-1 a 0,9 g L-1 de glicose, conforme
Tabela 1.
Transferir alquotas de volume conveniente de cada soluo preparada,
incluindo a soluo-me, para tubos de ensaio. Seguir o procedimento
indicado na marcha analtica e realizar a leitura da intensidade da cor
em espectrofotmetro a 540 nm, lembrando-se de fazer a amostra de
calibrao (branco).
Tabela 1. Exemplo de preparo das solues diludas de glicose, usadas na
elaborao da curva-padro, a partir da soluo-me de glicose 1,0 g L-1.
Soluo de glicose (mL)
10
20
30
40
50
60
70
80
90

gua destilada (mL)

90
80
70
60
50
40
30
20
10

Concentrao final (g L-1)

0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9

Inserir em planilha a absorbncia no eixo Y contra a concentrao de

glicose (g L-1) no eixo X (Figura 2). A partir da equao da reta, calcular
o fator de concentrao (Equao 2). Os valores da equao somente
se aplicam ao intervalo testado.

Absorbncia

13

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Concentrao (g L -1)

Fator =

1
coef. angular

(Eq. 2)

Itens da metodologia submetidos avaliao

Os pontos a seguir referem-se a alguns dos questionamentos surgidos
no laboratrio ao longo da utilizao do mtodo de determinao de
GRT por DNS.
Todas as anlises foram conduzidas em triplicata.
Estabilidade da mistura reacional antes da reao de formao de cor
Uma soluo de glicose 1,0 g L-1 foi utilizada como amostra. Para
anlise, 1,0 mL da amostra foi adicionada a 1,0 mL do reagente em
6 conjuntos de tubos de ensaio. Aps homogeneizao, os tubos
foram deixados em repouso por 0, 15, 30, 60, 90 e 120 minutos.

14

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

A reao de formao de cor foi realizada aps cada perodo de tempo

determinado, segundo a marcha analtica em banho-maria a 100 C por
5 minutos. O volume de cada tubo foi completado para 10 mL com
gua destilada. Aps homogeneizao, a leitura da absorbncia foi
realizada em espectrofotmetro Varian Cary 50, a 540 nm, com auxlio
do software Cary WinUV no mdulo Simple Reads. Para cada conjunto
de tubos, preparou-se uma amostra de calibrao.
Estabilidade da intensidade de cor na mistura aps a reao
Utilizou-se soluo de glicose 1,0 g L-1 como amostra. Para anlise,
1,0 mL da amostra foi adicionada a 1,0 mL do reagente em tubo
de ensaio. A reao de formao de cor ocorreu de acordo com a
marcha analtica em banho-maria a 100 C por 5 minutos. O volume
de cada tubo foi completado para 10 mL com gua destilada.
Aps homogeneizao, a intensidade da cor foi avaliada em
espectrofotmetro Varian Cary 50, a 540 nm, com auxlio do software
Cary WinUV no mdulo Scanning Kinetics, com o qual se mediu a
absorbncia a cada 15 segundos durante um perodo de 240 minutos
temperatura ambiente. Antes da leitura da amostra, o equipamento foi
calibrado com amostra branco.
Tempo de reao para formao da cor
Nesta etapa, utilizaram-se amostras com concentraes de grupos
redutores variadas, oriundas de diferentes experimentos realizados no
laboratrio. A reao de formao de cor foi feita em banho-maria a
100 C por 5 e 15 minutos. Para cada tempo de reao, preparou-se uma
amostra de calibrao. O volume de cada tubo foi completado para 10 mL
com gua destilada. Aps homogeneizao, a leitura da absorbncia foi
realizada em espectrofotmetro Varian, modelo Cary 50, a 540 nm, com
auxlio do software Cary WinUV no mdulo Simple Reads.
O clculo da concentrao de grupos redutores totais foi realizado a
partir de curvas-padro elaboradas para os tempos de reao avaliados
(5 e 15 minutos), conforme descrito anteriormente.
Reduo de volume da mistura reacional
Foi avaliado se a alterao do volume final gerado, sem mudana na

15

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

proporo entre as diferentes solues empregadas, causa impacto

no resultado da anlise. Para tanto, utilizaram-se amostras com
concentraes de grupos redutores variadas, oriundas de diferentes
experimentos realizados no laboratrio.
Cada amostra foi analisada das seguintes formas:
1,0 mL de amostra foi adicionado sobre 1,0 mL de reagente
DNS. Aps homogeneizao, reao e resfriamento, o volume
final foi completado para 10,0 mL com gua destilada.
0,5 mL de amostra foi adicionado sobre 0,5 mL de reagente.
Aps homogeneizao, reao e resfriamento, o volume final
foi completado para 5,0 mL com gua destilada.
A amostra de calibrao foi feita nas mesmas condies de cada forma.
A reao de formao de cor foi feita em banho-maria a 100 C por
5 minutos, antes da adio de gua destilada, sendo interrompida
pela imerso dos tubos em banho frio. A mistura de cada tubo foi
completada com gua destilada para um volume final conforme
determinado no incio do experimento. Aps homogeneizao, a
intensidade da cor foi lida em espectrofotmetro Varian Cary 50,
a 540 nm, com auxlio do software Cary WinUV no mdulo Simple
Reads.

Resultados e Discusso
Estabilidade da mistura reacional antes do aquecimento
Dentro da rotina de laboratrio, trabalha-se com um nmero elevado de
amostras, muitas vezes realizando a anlise em duplicata ou triplicata,
o que consome um grande tempo de preparo e processamento, mesmo
para uma marcha analtica relativamente simples. Alis, quanto mais
simples a anlise, maior a tentao do analista em aumentar o nmero
de amostras que trabalha por vez, criando uma certeza, nem sempre
verdadeira, de otimizao de seu tempo na bancada. O mtodo
de quantificao de grupos redutores por DNS, devido sua baixa
complexidade, um bom exemplo desse fato.

Trabalhar com muitas amostras simultaneamente no vivel, pois,

considerando que, no primeiro tubo, a amostra passa mais tempo
homogeneizada com o reagente de DNS do que a amostra presente
no segundo tubo de ensaio, a diferena de tempo de contato pode ser
elevada. Simulando essa situao, avaliou-se o efeito do tempo de
contato entre os reagentes sobre a gerao de cor.
possvel verificar que ocorre uma reduo gradual nos valores da
absorbncia medida que o tempo de contato aumenta. Nota-se
inclusive um padro de decaimento linear (Figura 3), levando a reduo
de aproximadamente 7,3% na absorbncia lida na primeira hora e a
mesma proporo na segunda hora.
Os dados obtidos confirmam a observao de Ghose (1987) sobre
a deteriorao progressiva da amostra aps homogeneizao com
reagente de DNS. Embora no explique o motivo dessa deteriorao, o
autor indica submeter a mistura reacional ao aquecimento o mais rpido
possvel. Sumner (1924) e Miller (1959) indicam que essa degradao
ocorre pela oxidao do acar devido ao oxignio dissolvido no
reagente de DNS, onde o meio muito alcalino. Miller (1959) sugere
purgar o meio reacional com N2 por 2 minutos antes da reao. Essa
soluo pouco prtica, pois eleva o custo e dificulta e aumenta o
tempo da anlise. Dessa forma, a recomendao de Ghose (1987)
mais vivel.

Absorbncia

16

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Tempo (min)

Figura 3. Avaliao da estabilidade da mistura reacional antes da reao de

formao de cor.

Recomendamos: a) fazer, no mximo, seis amostras por vez, em

duplicata ou triplicata; b) distribuir todas as amostras cujos grupos
redutores se pretende quantificar, e suas replicatas, primeiro nos tubos,
para em seguida adicionar o reagente de DNS; c) aps a adio do
reagente, homogeneizar a mistura reacional; d) apenas iniciar a adio
do reagente de DNS com a gua do banho-maria em fervura.

Estabilidade da intensidade de cor na mistura aps a

reao
Por outro lado, analisar, por vez, nmero reduzido de amostras
contraproducente. O trabalho se arrasta, levando a inevitvel acmulo
de amostras a serem processadas, comprometendo ainda o espao
para armazenamento desse material, bem como a prpria gerao de
resultados. A fim de trabalhar com nmero maior de amostras, apesar
da limitao de seis por bloco de aquecimento, recomenda-se, aps
o aquecimento, resfriar, diluir e guardar as amostras reagidas para
determinao da absorbncia junto com as amostras de outros blocos.
Dessa forma, o ponto chave verificar se a cor produzida estvel ao
longo do tempo. Foi possvel verificar que a mistura reacional apresenta
valores de absorbncia muito similares durante perodo de 4 horas
temperatura ambiente (Figura 4). A reduo da intensidade de cor
estimada, a partir de regresso linear, foi de 0,5% aps este perodo.
0,70
0,60

Absorbncia

17

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00

30

60

90

120

150

180

210

240

270

Tempo (min)

Figura 4. Avaliao da estabilidade da mistura reacional depois da reao de

formao da cor.

18

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Assim, recomenda-se: a) organizar as anlises em blocos, de maneira

que as amostras sejam submetidas ao aquecimento em grupos (at seis
amostras em duplicata ou triplicata); b) diluir as amostras com gua
destilada, homogeneizar e reservar at o final do processamento do
ltimo bloco; c) realizar a determinao de absorbncia no perodo de
at 4 horas do final do primeiro bloco.

Avaliao do tempo de reao para formao da cor

Este item entrou em discusso pela divergncia observada entre a
referncia citada, tanto pelo nosso laboratrio como por tantos outros
(MILLER, 1959), com o que executado na prtica, que muito similar
metodologia descrita por Bernfeld (1955). Composio de reagente,
proporo amostra/reagente e tempo de reao so, na maioria dos
laboratrios, iguais a Bernfeld (1955).
Miller (1959), embora inicialmente utilizasse o tempo de 5 minutos
para o aquecimento, na apresentao do mtodo ajustado indicou
15 minutos. Segundo o autor, o tempo de aquecimento maior foi
necessrio para que a reao fosse concluda, porm no mostrou
qualquer experimento que suportasse essa sugesto. Mais uma
vez, o que vivenciamos neste e em outros laboratrios que esse
detalhe, como outros pontos da metodologia de Miller, no levado
em considerao, apesar de todos referenciarmos seu trabalho para a
anlise de acares redutores por DNS.
As repeties aquecidas por 15 minutos apresentaram maior intensidade
de cor formada do que as aquecidas por apenas 5 minutos (Tabela 2).
Utilizando as respectivas curvas-padro de 5 ou 15 minutos,
observou-se tambm que o maior tempo de reao sempre estimou
valores superiores de concentrao de grupos redutores. As mdias das
concentraes de grupos redutores foram diferentes e significativas
ao nvel de 5% segundo o teste t de Student (Tabela 3). Esses dados
corroboram a sugesto de Miller (1959), de que o tempo de aquecimento
maior necessrio para que seja observado completo desenvolvimento da
cor e, consequentemente, melhore a preciso do mtodo.

19

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Tabela 2. Mdias das absorbncias para os tempos de reao de 5 e 15 minutos.

Amostra
A1

Tempo (min)
5
15
5
15
5
15
5
15
5
15
5
15
5
15
5
15

A2
A3
A4
A5
A6
A7
A8

Mdias das absorbncias

0,2614
0,2992
0,3628
0,4178
0,3891
0,4404
0,3738
0,4144
0,4206
0,4755
0,3240
0,3691
0,2774
0,3144
0,3106
0,3490

Tabela 3. Comparao entre mdias da concentrao de glicose (mg L-1)

considerando o tempo de reao de 5 e 15 minutos, pelo teste t de Student para
mdias pareadas.
Amostra A
Estatstica

Amostra B

Mdia (amostras 5 min)

13.055,88

12.976,15

12.317,93

5.372,59

5.339,78

5.068,92

Mdia (amostras 15 min)

13.807,39

13.827,23

13.292,47

5.895,82

5.904,29

5.675,95

18

18

18

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

1,00

-11,71

-13,98

-12,69

-13,55

-12,91

-14,42

2,36

2,36

2,36

2,11

2,11

2,11

<0,01

<0,01

<0,01

<0,01

<0,01

<0,01

Nmero de amostras
r (correlao de Pearson)
tcalculado
ttabelado 5% (bicaudal)
Probabilidade (bicaudal)

Dessa forma, recomenda-se que o tempo de aquecimento, tanto para a

montagem da curva-padro, quanto para anlise das amostras, seja de
15 minutos.

20

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Avaliao da reduo de volume da mistura reacional

No laboratrio onde este estudo foi conduzido, o volume de resduos de
DNS gerado por ms est em torno de 50 litros, o que resulta em um
volume de 600 litros de resduos de uma nica anlise gerado por um
laboratrio a cada ano.
O descarte indiscriminado de resduos no ambiente resulta em
contaminao dos cursos dgua, do solo, da fauna e da flora.
O descarte adequado, por sua vez, traz um impacto econmico
mensurvel. O manejo e a destinao final correta de resduos implicam
o emprego de importante material humano e financeiro. Portanto, a
reduo no volume gerado representa economia em diversos aspectos,
como tempo, espao fsico e dinheiro.
Muitos laboratrios utilizam a proporo de 1:1 (amostra e reagente
DNS) como indicada tanto por Miller (1959) quanto Bernfeld (1955),
embora utilizem volumes distintos de um ou ambos os artigos. O
volume de gua adicionado aps a reao tambm varia de local para
local. No caso deste estudo, foi adicionado 1 mL do reagente a 1 mL
da amostra e, aps o aquecimento, completou-se o volume para 10 mL
com gua destilada, para em seguida homogeneizar e realizar a leitura.
A reduo de 50% no volume da amostra empregado anteriormente,
reagente DNS e gua destilada, mantendo a proporo de 1 para 1, no
alterou a concentrao determinada de GRT, segundo a comparao
entre mdias pelo teste t de Student, ao nvel de significncia de 5%
(Tabela 4).
Dessa forma, recomenda-se utilizar 0,5 mL de reagente DNS sobre
0,5 mL de amostra, completando o volume para 5,0 mL com gua
destilada.

27.817,98

28.042,20

10

1,00

-0,89

3,25

0,33

Mdia (amostras 1:1)

Nmero de amostras

r (correlao de Pearson)

tcalculado

ttabelado 5% (bicaudal)

Probabilidade (bicaudal)

Mdia (amostras 0,5:0,5)

Estatstica

0,50

3,25

-0,70

1,00

10

28.269,45

28.043,53

Amostra A

0,49

3,25

-0,72

1,00

10

27.511,44

27.286,73

0,67

2,73

0,44

>0,99

34

4.470,07

4.658,28

0,62

2,73

0,52

>0,99

34

4.506,29

4.730,06

Amostra B

0,61

2,73

0,51

>0,99

34

4.385,46

4.602,41

0,84

2,90

-0,20

1,00

18

5.763,60

5.732,59

0,94

2,90

0,07

1,00

18

5.810,31

5.820,92

Amostra C

0,95

2,90

0,06

1,00

18

5.654,51

5.663,83

Tabela 4. Comparao entre mdias da concentrao de glicose (mg/L) considerando o volume 0,5:0,5 e 1:1 (amostra:DNS),
pelo teste t de Student para mdias pareadas.

21
Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do
Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

22

Determinao de Acares Redutores pelo cido 3,5-Dinitrosaliclico: Histrico do

Desenvolvimento do Mtodo e Estabelecimento de um Protocolo para o Laboratrio
de Bioprocessos

Concluso
A determinao de grupos redutores pelo mtodo do cido
3,5-dinitrosaliclico (DNS), seguindo o descrito por Bernfeld (1955),
com a modificao no tempo de reao introduzida por Miller (1959)
e observando os passos e modificaes indicadas neste Boletim de
Pesquisa, representam uma ferramenta robusta e prtica para a rotina
laboratorial com grande volume de amostras a serem processadas.
Seguindo o exposto, a forma mais adequada de referenciar a
metodologia de determinao de acares redutores por DNS, sem
utilizar fenol e bissulfito de sdio, a apresentada por Bernfeld (1955),
com modificaes introduzidas por Miller (1959) e consolidadas neste
trabalho. No caso de usar esses dois reagentes, indica-se continuar
utilizando Miller (1959).

Referncias

BERNFELD, P. Amylases, and . Methods in Enzymology, v. 1, p. 149-157, 1955.

GHOSE, T. K. Measurement of cellulose activities. Pure & Applied Chemistry, v. 59, n. 2,
p. 257-268, 1987.
GONALVES C.; JASSO, R. M. R.; GOMES N.; TEIXEIRA J. A.; BELO I. Adaptation of
dinitrosalicylic acid method to microtiter plates. Analytical Methods, v. 2, p. 2046-2048,
2010.
MILLER G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, v. 31, p. 426, 1959.
NATIONAL FIRE PROTECTION ASSOCIATION. Standards system for the identification of
the hazards of materials for emergency: NFPA 704. Massachusetts, 2007.
SUMNER J. B. Dinitrosalicylic acid: a reagent for the estimation of sugar in normal and
diabetic urine. The Journal of Biological Chemistry, v. 47, p. 5-9, 1921.
SUMNER J. B. The estimation of sugar in diabetic urine, using dinitrosalicylic acid. The
Journal of Biological Chemistry, v. 62, p. 287-290, 1924.
SUMNER J. B. A more specific reagent for the determination of sugar in urine. The
Journal of Biological Chemistry, v. 65, p. 393-395, 1925.
SUMNER J. B.; HOWEL S. F. A method for determination of saccharase activity. The
Journal of Biological Chemistry, v. 108, p. 51-54,1934.