Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia, Vol. 10, No.

1, January 2005 ( C 2005)

DOI: 10.1007/s10911-005-2542-5

La supervivencia de las clulas madre mamarias en

suspensin Cultura: Implicaciones para la Biologa de
Clulas Madre y Neoplasia

Hay evidencia creciente de que una variedad de neoplasias incluyendo cncer

de mama puede resultar de la transformacin de las clulas madre y
progenitoras normales. En el pasado, el aislamiento y la caracterizacin de las
clulas madre mamarias ha visto limitado por la falta de sistemas de cultivo
adecuadas capaces de mantener estas clulas en un estado indiferenciado in
vitro. Recientemente hemos descrito un sistema de cultivo en el que las clulas
madre y progenitoras mamarios humanos son capaces de sobrevivir en
suspensin y producir colonias esfricas compuestas de ambas clulas madre y
progenitoras. Observacin reciente de que las clulas madre adultas de otros
tejidos tambin pueden conservar la capacidad de crecimiento en condiciones
independientes de anclaje sugiere un mecanismo comn subyacente.
Proponemos que este mecanismo implica la interaccin entre la va de
sealizacin Wnt cannica y E-cadherina. La va de Wnt se ha implicado en la
auto-renovacin de clulas madre normales in vivo. Adems, hay evidencia de
que la desregulacin de esta va en la glndula mamaria y otros rganos puede
jugar un papel clave en la carcinognesis.
Thus, the development of in vitro suspen- sion culture systems not only
provides an important new tool for the study of mammary cell biology, but
also may have important implications for understanding key molecular
pathways in both normal and neoplastic stem cells.
.
Introduccion
El aislamiento y la caracterizacin de las clulas madre y progenitoras
especficos de tejido ha ganado impulso debido a las importantes ideas que su
estudio puede proporcionar en el desarrollo normal y ESIS carcinognesis. Las
clulas madre adultas se definen por su capacidad de auto-renovacin y
diferenciacin en linajes de clulas presentes en un tejido especfico (1,2).

Auto-renovacin asegura la propagacin del compartimento de clulas madre,

que funcione. En muchos rganos, las clulas madre se dividen lentamente dan
lugar a un trnsito, la amplificacin de la poblacin de clulas progenitoras que
proliferan activamente en respuesta a seales especficas. Estas clulas
indiferenciadas son multipotentes y generan los progenitores linaje restringido
que posteriormente se someten a la diferenciacin terminal (3). Mientras que
las clulas madre mamarias an no se han aislado y caracterizado, su
existencia in vivo en ratones se demostr inequvocamente por su vez sostiene
la morfognesis, la reparacin de tejidos y el mantenimiento. Diferenciacin
genera las clulas especializadas que forman cada rgano y aseguran su
normalidad
En rganos pueden, las clulas madre se dividen lentamente dan lugar a un
trnsito, la amplificacin de la poblacin de clulas progenitoras que proliferan
activamente en respuesta a seales especficas.
Estas clulas indiferenciadas son multipotentes y generan los progenitores
linaje restringido que posteriormente se someten a la diferenciacin terminal.
Mientras que las clulas madre mamarias an no se han aislado y
caracterizado, su existencia en ratones ONU vivo se demostr
inequvocamente por estudios de trasplante en serie
estudios de trasplante en serie (4,5). La evidencia de la existencia de clulas
madre mamarias adultas y las estrategias empleadas por su aislamiento y
caracterizacin fueron revisados a fondo en varios trabajos recientes (6,7). El
objetivo de esta revisin ser en el desarrollo de mtodos para el cultivo de la
mamaria clulas madre / progenitoras adultas y el potencial de la aplicacin de
estos sistemas en biologa de clulas madre.
PROPAGACIN IN VITRO DE clulas madre normales en cultivo en
suspensin.

Lo ideal sera que las clulas madre se purifican por aislamiento directamente a
partir de tejido para evitar los artefactos introducidos por la manipulacin in
vitro (2). La purificacin de las clulas madre se basa en encontrar un nmero
de rasgos morfolgicos y moleculares, incluyendo antgenos de superficie, que
las distinguen de todas las otras clulas en el tejido de inters (8). La mayora
de los protocolos de enriquecimiento de clulas madre / purificacin se basan
en clulas activadas por la clasificacin por fluorescencia (FACS) o inmuno
magntica clasificacin y utilizan conjuntos de anticuerpos contra protenas de
la superficie celular. Cuando no se conoce la firma molecular, que es el caso
para las clulas madre mamarias, la tarea de aislar las clulas madre implica
un proceso tedioso de la deteccin de un gran nmero de marcadores

putativos para identificar los que co-segregar con atributos funcionales de

stemness .
Como definicin de trabajo mnimo, estos atributos incluyen auto-renovacin y
capacidad de generar progenie diferenciada. En la generacin in vivo de un
tejido funcional es la prueba definitiva de la "troncalidad" de cualquier
marcador candidato. Sin embargo, el cribado gran nmero de marcadores
candidatos en ensayos in vivo de trasplante en el fin de encontrar la firma de
clulas madre es poco prctico. Por otra parte, hasta hace poco, la falta de un
sistema de cultivo que al-mnimos para la propagacin de los progenitores
mamarias en un estado indiferenciado ha impedido la prueba de autorenovacin in vitro.
Hemos desarrollado un sistema de cultivo, basado en el trabajo previo en la
biologa de clulas madre neurales, que supera esta incapacidad de los
sistemas anteriores para mantener y propagar clulas madre y progenitoras
mamarias.
En 1992 Reynolds y Weis publicaron un estudio en el que mostraron que las
clulas neuronales aisladas de la zona subventricular de embriones de rata
pueden proliferar en cultivo en suspensin, generando clonalmente colonias
esfricas, que ellos llamaron neuroesferas (9). Un anlisis clonal de
neuroesferas demostr que el 20% de estas clulas, la proliferacin in vitro en
respuesta a EGF y bFGF estimulacin, eran capaces tanto de auto-renovacin y
diferenciacin a lo largo de mltiples linajes, las caractersticas definitorias de
las clulas madre (10). Dos aos ms tarde, el mismo grupo demostr que neural clulas madre / progenitoras de animales adultos tienen la misma
capacidad de propagar in vitro como neuroesferas (11).
Desde entonces, numerosos estudios que utilizan clulas derivadas de o bien el
sistema nervioso central o perifrico, a partir de tejido embrionario y adulto
mostraron que la capacidad de generar neuroesferas in vitro pondiente lates
con el nmero de clulas madre en el tejido de origen (12-14) . Implantado en
el sistema nervioso de un animal husped, neuroesferas generan clulas que
auto renuevan, as como diferenciar y contribuyen a los diversos
compartimientos celulares del receptor cerebro de ani- mal (12,13).
Por lo tanto, estas clulas son capacidades ble de auto-renovacin y
diferenciacin multilinaje, tanto in vitro como in vivo. Este sistema
experimental ha sido una herramienta muy til en la biologa de las clulas
madre neurales. Fue utilizado como un modelo in vitro para el desarrollo
temprano (15,16), para identificar los factores que intervienen en la
determinacin del destino celular y desentraar las vas de sealizacin activos
en las clulas progenitoras tempranas (17-19) tallo y. Una serie de estudios
utilizaron este sistema para el perfil transcripcional comparativo con el fin de

identificar la expresin del gen cambia de autorrenovacin y diferenciacin

subyacente especfica linaje (20-23).
Estos estudios demostraron xito del injerto, la migracin al sitio de la lesin y
diferenciacin de las clulas derivadas de esfera en neuronas funcionales con
grados variables de recuperacin conductual y anatmica. Estos resultados
hacen que el caso para el uso potencial de estas clulas progenitoras,
propagadas in vitro en cultivo en suspensin, en la reparacin de tejidos
daados en vivo. La cultura neurosphere tambin se utiliza rutinariamente
ahora para evaluar el enriquecimiento de clulas madre en los experimentos
usando clulas Sort- ing para la identificacin de marcadores de clulas madre
(12,13). Formacin Neurosphere tambin se utiliz para evaluar el tamao de
la poblacin de clulas madre en el tejido neural de los ratones genticamente
manipulados en los experimentos con el objetivo de investigar el papel de los
genes tales como BMI (23), PTEN (27), LIF y Notch (28,29) en la autorenovacin.

mammospheres no adherentes

Recientemente hemos adoptado el cultivo en suspensin como una estrategia

para el enriquecimiento y la propagacin in vitro
La supervivencia de las clulas madre mamarias en cultivo en suspensin de
clulas madre / progenitoras mamarias humanas (30). Basado en el modelo de
neuroesferas, la hiptesis de que una pequea poblacin de clulas mamarias
con propiedades de clulas madre sera capaz de sobrevivir y proliferar en
ausencia de fijacin a un sustrato exgeno.
Hemos desarrollado un sistema de cultivo en el que las clulas epiteliales
mamarias humanas, aisladas de mammoplasties de reduccin, se cultivan
sobre un sustrato no adhesivo en medio libre de suero en presencia de EGF y /
o bFGF. Bajo estas condiciones, la gran mayora de las clulas se someten a
"anoikis."
Este trmino se aplica especficamente a la apoptosis de las clulas no
transformadas que se produce en ausencia de anclaje a un sustrato. La
hiptesis de que anoikis era una caracterstica de las clulas diferenciadas,
pero que las clulas madre podra sobrevivir en condiciones independientes de
anclaje.
Consistente con esta hiptesis, se encontr que aproximadamente cuatro de
cada 1.000 clulas recin aisladas son capaces de sobrevivir y proliferar, y
formar esferoides multicelulares. Hemos denominado estos esferoides
"mammospheres" en virtud de su parecido con neuro esferas cultivadas a
partir de clulas neuronales primarias. Como es el caso para neuroesferas,
hemos demostrado que mammospheres son altamente enriquecido en las
clulas no diferenciadas, como se demuestra por la capacidad de las clulas
individuales aisladas de mammospheres para generar colonias EAGE
multilingismo cuando se cultivan en presencia de suero en un sustrato de
colgeno que promueve su diferenciacin (Fig. 1 (a)).
Mammospheres primarios contienen ocho veces ms bi-linaje de clulas
progenitoras que las clulas mamarias humanas recin cultivadas.
Mammospheres secundarias y posteriormente pasajes consisten en
virtualmente.
Fig. 1. mammospheres se componen de clulas madre / progenitoras. Clulas
sembradas a densidades clonognicos puede mammosphere derivados de: (a)
la auto renovarse, (b) generar colonias mixtas que contienen clulas de todos
los tres tipos de linaje mamarias (immunostained con marcadores especficos
de linaje, ductal epitelial-ESA, marrn; mioepiteliales-CD10, prpura ; alveolar,

beta-casena-rojo) (c) generar estructuras complejas en cultivo 3D Matrigel, (d)

generar excrecencias-alveolar ductales in vivo.

78 Dontu y Wicha aliado 100% progenitores unipotentes. Adems, la mayora

de los progenitores bipotentes son capaces para generar colonias de la ATE
que contienen los tres linajes de la glndula mamaria de adultos,
mioepiteliales, epitelio ductal, y las clulas epiteliales alveolares
Tambin hemos demostrado que mammospheres contienen clulas capaces de
generar clonalmente estructuras funcionales complejos en sistemas de cultivo
3D reconstituy en Matrigel (Figs. 1 (c) y 2).

Auto-renovacin de una poblacin celular dentro de mammospheres se

demostr utilizando un ensayo en el que las clulas individuales de
mammospheres son capaces de generar esferas de segunda generacin y
posteriores (Fig. 1 (b)). Hemos demostrado que mammospheres se generaron
por clonacin usando retroviral marcado. Adems, hemos demostrado que
mammospheres derivados de estas clulas a pases tambin tienen mltiples
potencial de diferenciacin potente. These results resem- ble those reported
for neurospheres (10,31) and are consistent with a model in which the
mammosphere- forming cell represents a mammary stem cell which
undergoes limited self renewal and then gives rise to mammary progenitors
still capable of multi-lineage differentiation (32). Clonal experiments in which
spheres were grown from single cells and single mam- mospheres were
passaged, suggest that one or two self-renewal divisions are involved in
the formation of a single mammosphere
Este nmero limitado de divisiones de auto-renovacin est de acuerdo con la
mayora de los estudios con clulas madre adultas, que indicar que la
expansin de la poblacin madre adultas no se produce fcilmente ex vivo,
presumiblemente debido a las divisiones celulares asimtricas cinticas que
dan lugar a una gran nmero de progenitores y clulas diferenciadas y un
pequeo nmero fijo de clulas madre. Our findings indicate that mammary
stem cells are contained in the small pop- ulation of cells that are anchorage
independent and survive suspension culture to proliferate and differ- entiate
into mammary progenitor cells (30).
Para determinar si la capacidad de las clulas para formar mammospheres se
correlaciona con el enriquecimiento en clulas progenitoras, hemos probado la
capacidad de formacin de esferas de la poblacin lateral (SP) de las clulas
epiteliales mamarias (30). SP representa una subpoblacin de clulas capaces
de exclusin de colorantes, tales como rodamina y Hoechst, debido a la

expresin de protenas transportadoras, tales como BCRP (protena de

resistencia de cncer de mama pro-) y glicoprotenas P (33). Se ha demostrado
que la fraccin de SP hematopoyticas y clulas neurales contiene la
repoblacin de clulas madre a largo plazo (34).
Este fenmeno tambin ha sido recientemente demostrada para las clulas
mamarias de ratn con propiedades SP, que puede regenerar la glndula tras
el trasplante (35). En nuestro estudio SP y no-SP poblacin tincin de las
clulas no cultivadas fueron separadas por FACS y se colocan en cultivo en
suspensin. Slo las clulas contenidas en la fraccin SP eran capaces de la
formacin de mammosphere en cultivo en suspensin as como la generacin
de colonias multilinaje sobre sustratos de colgeno (30).
Con el fin de evaluar la composicin celular de esferas mamogrficas
utilizamos inmunotincin con marcadores especficos para las clulas
mamarias diferenciadas de epitelio luminal (ESA, Muc1, citoqueratina 18) y
mioepiteliales linajes (CD10, ASMA, citoqueratina 14, al- pha 6 integrina) .
Algunos de estos marcadores fueron iden- tificado en estudios previos como
asociadas con clulas bi-potentes progenitoras (ESA, alfa 6 integrina) (36,37) o
madre mamarias / clulas progenitoras (citoqueratina 5). Mammospheres
contenan clulas positivas para alfa 6 integrina, citoqueratina 5 y CD10, la ESA
y citoqueratina 14 (30).
ER y PR expresin tambin fue detectable mediante inmunotincin en
mammospheres y en colonias generados a partir de mammospheres
sembraron en un sustrato de colgeno. Una subpoblacin de las clulas ER
positivos tambin fue positiva para el marcador de proliferacin Ki67 acin, lo
que indica que estas clulas pueden dividir in vitro. Despus de 5-7 das de
cultivo en una expresin de ER sustrato colgeno ya no se detect, lo que
sugiere que es downregulated durante diferenciadas acin in vitro
(observaciones no publicadas).
Hemos encontrado recientemente que, cuando se trasplantan en la almohadilla
de grasa mamaria limpiado de NOD / ratones SCID, mammospheres generado
excrecencias limitados con las caractersticas morfolgicas y celulares de la
estructura alveolar humano una mamario ductal (Figs. 1 (d) y 2). Tan slo 500
mammospheres trasplantados (10,000-25,000 clulas) generaron crecimientos
salidas, en ausencia de fibroblastos humanos. Mejora de injerto se obtuvo
mediante el uso de mammospheres combinados con fibroblastos mamarias
humanas, como se describe por Kuperwasser et al. (38). Se requerir titulacin
experimentos cin para determinar el enriquecimiento absoluta en la actividad
de reconstitucin de las clulas de la glndula mammosphere derivada.
Hemos utilizado el sistema de cultivo mammosphere para delimitar las vas de
sealizacin implicadas en la especificacin de destino celular de las clulas

madre / progenitoras mamarias, como Notch y Sonic Hedgehog (32). Ensayos

de ING US- para auto-renovacin y diferenciacin in vitro que desarrollamos
con este sistema, que mostraron que la sealizacin Notch regula las
decisiones del destino celular en la glndula mamaria en varias etapas de
desarrollo distintas. Renovacin Notch activacin aumenta auto de clulas
madre mamarias, as como la actuacin sobre la supervivencia de las clulas
madre mamarias en cultivo en suspensin 79 Fig. 2. (a)
Estructura ductal alveolar desarrollado plenamente crecido en Matrigel a partir
de una mammosphere secundaria, inmunotieron con marcadores especficos
de linaje (clulas mioepiteliales se tien de color rojo con rojo CD10-Texas y
clulas epiteliales ductales se tien verde con ESA-FITC) (b) Igual que a, mayor
magnificacin.
(ck) mammospheres generan crecimientos en la almohadilla de grasa mamaria
despejado. Tincin Todo el montaje (rojo carmn) y H & E secciones de tejido a
travs de una almohadilla de grasa mamaria de ratn: sin despachar [(c) y (f)],
se aclar, no implantado [(d), (g)], aprobado e implantado con mammospheres
derivados de clulas epiteliales mamarias humanas [(E), (h), (k)]. La
inmunotincin utilizando especfica humana de anticuerpos ESA - seccin de
tejido a travs de una glndula mamaria de ratn (i), la glndula mamaria
humana (j), el ratn se aclar la grasa-pad implantados con mammospheres
humanos (k). 80 clulas progenitoras Dontu y Wicha para promover la adopcin
de la mi- destino celular mioepiteliales en un paso posterior, durante la
diferenciacin. De Sonic hedgehog tambin va parece tener un papel en la
regulacin de auto-renovacin de las clulas madre mamarias, probablemente
tambin interactuar con la va de Notch.
Con base en las observaciones de que las clulas madre embrionarias, as
como al menos dos tipos de clulas madre / progenitoras a partir de tejido
neural y el tejido mamario, tienen la capacidad de sobrevivir y proliferar en una
manera independiente de anclaje, se especula que el cultivo en suspensin
podra ser utilizado como un mtodo para aislar clulas madre adultas /
progenitoras de otros tejidos. De hecho esto fue confirmado recientemente en
el caso de la piel (39), cardaca (40), y las clulas madre del odo interno (41)
que ha generado el mismo tipo de colonias esfricas en cultivos en suspensin,
compuestas de clulas con propiedades funcionales madre y progenitoras
flotante.

Clulas madre del cncer y esferas TUMORALES

Nosotros y otros han propuesto recientemente un modelo en
el que la carcinognesis mamaria es impulsado por clulas

madre tumoral derivadas de mutado madre adultas o clulas

progenitoras (7,42). Este modelo se basa en el concepto
ampliamente aceptado que el cncer surge a travs de una
serie de mutaciones que pueden ocurrir durante muchos aos.
Dado que las clulas madre adultas estn dividiendo
lentamente, clulas de larga vida con una alta capacidad de
proliferacin, que son capaces de acumular las mltiples
mutaciones que se producen durante la carcinognesis (1,42).
La exposicin a agentes que daan durante largos perodos de
tiempo, pueden acumularse y propagar las mutaciones
inducidas por los agentes txicos genotipos.
Estas clulas madre o progenitoras transformadas pueden a
su vez convertirse en "las clulas madre del cncer", que
mantienen o adquirir propiedades funcionales presentes en
las clulas madre normales, incluyendo la capacidad de
autorrenovacin y diferenciacin. Las mutaciones acumuladas
en el "cncer de clulas madre" interrumpen el estricto
control de estas funciones de clulas madre, en ltima
instancia conduce a la desregulacin de la auto-renovacin,
que impulsa el proceso de tumorignesis, y para la
diferenciacin aberrante, que genera la heterogeneidad
celular encontrado en los tumores. La existencia de las clulas
madre del cncer se demostr por primera vez en neoplasias
hematolgicas y, ms recientemente, en los tumores slidos
(43-46). En un comentario anterior analizamos con ms
detalle las caractersticas funcionales compartidas por las
clulas madre normales y clulas cancerosas, como la
capacidad de auto-renovacin, capacidad de diferenciarse, la
telomerasa activa, la activacin de anti vas de apoptosis, el
aumento de la actividad de transporte de membrana, la
independencia de anclaje y capacidad de migrar (4).
Comparando el perfil transcripcional de madre / clulas
progenitoras tempranas con la de las clulas ms

diferenciadas del epitelio mamario, propusimos que la primera

se asemeja ms a la de las clulas de cncer que el segundo.
Esta observacin sugiere una mentira circuitos moleculares
comprensin que hace que las clulas transformadas con ms
facilidad que las clulas diferenciadas madre. Un
acontecimiento clave en la transformacin puede ser la
desregulacin de vas tales como la auto-renovacin, que ya
son activos en las clulas madre.
La evidencia directa de la existencia de las clulas madre del
cncer se proporcion por primera vez por el trabajo del grupo
de John Dick en neoplasias hematolgicas (43). Ellos
demostraron la presencia de una poblacin de clulas madre
de cncer en las leucemias humanas, lo que representa una
fraccin muy pequea de la poblacin leucmica total, que
era capaz de transferir la enfermedad a ratones
inmunodeprimidos. Adems, las clulas madre leucmicas
compartieron la expresin de los marcadores fenotpicos con
clulas madre hematopoyticas normales. Basndose en
estos estudios, propusieron que los diferentes fenotipos
leucmicas el resultado de mutaciones particulares en
poblaciones de clulas madre hematopoyticas, lo que result
en la diferenciacin aberrante de estas clulas (43,47).
En colaboracin con el grupo de Clarke presentamos
recientemente evidencia de la existencia de las clulas madre
del cncer de mama hombre humano (45). La citometra de
flujo se utiliz para separar subpoblaciones de clulas en base
a su expresin de marcadores de superficie. Una subpoblacin
de clulas tumorales, con el fenotipo CD44 + CD24- lineage-,
que posee caractersticas altamente tumorignicas, era que
identific. El subconjunto tumorignico, que representa una
minora de la poblacin celular total dentro de un tumor, se
defini por los mismos marcadores en la mayora de los

tumores examinados. Tan slo 200 de estas clulas formado

consistentemente tumores en ratones NOD / SCID.
En contraste, la mayor parte del tumor, que con- clulas
contenidas con diferentes fenotipos de la superficie celular, no
pudo formar tumores incluso cuando decenas de miles de
clulas fueron inyectadas. Con el fin de determinar si este
sistema experimental meramente seleccionado para un
subconjunto altamente tumorignico de las clulas, se analiz
el fenotipo de tumores producidos en ratones NOD / SCID por
las clulas tumorignicas prospectivamente aisladas. Los
resultados mostraron que la pequea poblacin de clulas
tumorignicas fue capaz de regenerar toda la heterogeneidad
fenotpica encontrado en el tumor inicial.
Estos hallazgos apoyan un modelo de clulas madre de la
carcinognesis, en el que una pequea poblacin de clulas
oncognicas, con fenotipo definible, es capaz de dar lugar a
ms de supervivencia de las clulas madre mamarias en
cultivo en suspensin 81 clulas oncognicas, as como la
popu tumor mayor - mento, sin propiedades oncognicas. Por
lo tanto, las clulas madre tumorignicas, al igual que sus
contrapartes normales, son capaces de someterse tanto autorenovacin y diferenciacin.
La existencia de un fenotipo de clulas madre de cncer en
los tumores cerebrales Tambin se ha sugerido por dos grupos
que utilizaron en el cultivo in vitro de clulas tumorales
cerebrales en suspensin, como neuroesferas (46,48). Singh y
colaboradores utilizaron este sistema experimental para
identificar clulas madre del cncer de varios tumores
cerebrales humanos (46). Su estudio mostr una correlacin
entre la capacidad de auto-renovacin de las clulas madre
del cncer, demostrado por la formacin de la esfera, y la
agresividad clnica de los tumores cerebrales de los que
proceden estas clulas. Tambin demostraron que estas

clulas madre cer cnceres de tumores cerebrales tenan la

capacidad de generar progenie diferenciada in vitro, similar al
tumor a partir del cual se aislaron las clulas.
Ms recientemente, han demostrado que las clulas madre
del cncer de cerebro, expresando la clula madre de CD
marcador neuronal 133 son capaces de formar tumores en
ratones NOD / SCID, mientras que CD 133 clulas negativas
no (47) son. Por otra parte, cuando se inyectan en animales,
clulas CD 133+ generaron tumores heterogneos
compuestos por dos CD 133+ y las clulas CD133-.
Curiosamente, slo CD 133+ clulas eran capaces de formar
neuroesferas.
Por lo tanto, como hemos demostrado previamente para el
cncer de mama, el modelo de clulas madre de la
carcinognesis tambin se aplica a los cnceres de cerebro.

Cmo las clulas madre EVITAR "anoikis" - un modelo

terico

Una cuestin fundamental es si la independencia anclaje de

las clulas madre normales no es ms que un fenmeno in
vitro. El mecanismo molecular responsable de esta propiedad
tambin juegan un papel en el comportamiento de clulas
madre in vivo? Vamos a especular ms sobre esta ltima
posibilidad y proponer un mecanismo que podra coordinar
proliferacin y la supervivencia du- rante diferenciacin de
clulas madre / progenitoras con la adhesin clula-clula y la
integracin en la arquitectura del tejido maduro. La
supervivencia de las clulas individuales en cultivo en
suspensin implica la supervivencia en la ausencia de
interaccin clula-matriz y interacciones clula-clula.

Interacciones clula-matriz
Nuestro anlisis de mammosphere mostr la presencia de
molculas de la matriz incluyendo tenascina, decorina y
laminina (30). Curiosamente, la decorina y tenascina estn
presentes en la glndula mamaria embrionaria, mientras que
la laminina tambin est presente en la membrana basal de la
glndula adulto, lo que sugiere que la formacin de
mammosphere puede recapitular algunos de los eventos que
se producen durante el desarrollo embrionario y mamaria
temprana in vivo. Parece que las clulas que escapan anoikis,
representados principalmente por las clulas madre y las
clulas progenitoras tempranas, posiblemente, sintetizar y
matriz extracelular depsito, creando un nicho in vitro que
apoya su supervivencia y la proliferacin en suspensin.
Sin lugar a dudas, las interacciones-estroma epitelial tambin
estn involucrados en la generacin del nicho del desarrollo
de clulas madre in vivo. Recientes observaciones por grupo
de Weinberg (38), as como la nuestra, demuestran que el
estroma mamario potencia en gran medida el crecimiento y la
diferenciacin del epitelio mamario humano (a partir de
fragmentos epiteliales y mammospheres) en ratones NOD /
SCID.
Las interacciones entre las clulas mammosphere iniciadoras
y su progenie y entre los componentes celulares y
extracelulares de las esferas, dictan los tipos de divisiones
(auto renovacin vs. diferenciacin) y el destino de la clula
adoptadas por las clulas (linaje compromiso Ment). Queda
por determinar en qu medida este comportamiento
recapitula acontecimientos que ocurren en vivo. Uno podra
especular que la sealizacin iniciada por las molculas de la
matriz se acopla conjuntos especficos de integrinas
expresadas por las clulas progenitoras mamarias, pro- mover
su supervivencia. Sealizacin a travs de receptores de

factores de crecimiento presentes en estas clulas,

probablemente, tambin juega un papel importante en la
supervivencia celular. La supervivencia de las clulas de RCE
cnceres en los sitios de metstasis puede emplear
mecanismos similares. Una advertencia importante de la
extrapolacin de datos in vitro a los eventos en vivo se ha
ilustrado recientemente en el sistema neuroesfera. En
condiciones in vitro alterado la especificacin potencial y
destino de las clulas progenitoras neurales, la generacin de
clulas totipotentes, no vistos en vivo (49).
Interacciones clula-clula
Interacciones clula-clula son cruciales para la supervivencia
de las clulas epiteliales, tanto in vitro como in vivo. Un
componente importante de este proceso es E-cadherina (50).
La prdida de este mecanismo de adherencia es
probablemente involucrados en la apoptosis masiva que se
produce durante la involucin mamaria, despus de la
lactancia (51).
Curiosamente, la resistencia de las clulas mamarias madre /
progenitoras a la apoptosis durante la involucin conserva las
poblaciones que regeneran la glndula
82 Dontu y Wicha durante los embarazos posteriores. Ecadherina es un miembro de una familia de un solo paso
transmembrana glicoprotenas que desempea un papel en el
establecimiento de clulas polarizacin dad y la morfologa de
los tejidos (50).
La principal do- extracelular de cadherina E interacta
homotypically con una molcula de E-cadherina en una celda
adyacente. El dominio citoplsmica de E-cadherina est
vinculada a la citoesqueleto a travs de la interaccin con las
cateninas. Una interaccin importante es con beta-catenina,
una molcula en la va de sealizacin Wnt cannica. La

conexin entre la E-cadherina y la sealizacin de Wnt y su

papel en el desarrollo normal de mama y ESIS carcinognesis
fue objeto de una revisin reciente excelente (52). Vamos a
discutir este sentido desde la perspectiva de la carcinognesis
que resulta de dereg- autorrenovacin ulated de las clulas
madre o renovacin auto adquirido por las clulas
progenitoras tempranas. Beta-catenina est presente en dos
localizaciones celulares.
En asociacin con la E-cadherina, que forma las uniones
adherentes. En el citoplasma, beta-catenina est presente en
un complejo con protenas tales como la poliposis
adenomatosa coli (APC) y axina. Ante la falta de sealizacin
de Wnt, catenina beta es fosforilada y especfica para la
degradacin (53). Cuando se activa Wnt, en fosforilada
translocacin beta-catenina al ncleo, donde se une y activa
los factores de transcripcin TCF LEF, que entonces se activa
una variedad de genes diana aguas abajo, incluyendo c-Myc y
ciclina D1 (54,55). Recientemente se ha propuesto que el
equilibrio entre la beta-catenina presente en las los
adherentes junc- y que participen en la actividad
transcripcional es controlada por el grupo de APC intracelular
(56). Por otra parte, la evidencia de estudios de Drosophila
indica que APC regula la orientacin del cabezal y la divisin
celular asimtrica (57).
Una correlacin inversa entre la E-cadherina y la sealizacin
de Wnt se ha observado en diversos tejidos y rganos,
durante el desarrollo, as como en los cnceres (58). En
algunos cnceres epiteliales humanos, las mutaciones de
genes de cadherina E-Pro- sealizacin de Wnt mote, como se
juzga por la deteccin de beta-catenina nuclear en el tejido
tumoral (58). Tambin se ha demostrado que la E-cadherina
puede mediar la supresin del crecimiento por la inhibicin de

la sealizacin de beta-catenina, en una manera dependiente

de la adherencia (59).
En las clulas epiteliales mamarias cultivadas, la inhibicin de
la E-cadherina agregacin celular dependiente predispone a la
muerte celular. En estudios in vivo, utilizando ratones
transgnicos y el sistema de recombinasa Cre / lox, demostr
que alve- diferenciacin olar durante la lactancia es
dependiente de la expresin de E-cadherina (60). Por otra
parte, como se indic anteriormente, la alteracin de la
adhesin celular E-cadherina-dependiente probablemente
inicia el programa de apoptosis durante la involucin
mamaria. La interaccin de la E-cadherina con beta-catenina
parece Medi comi estos procesos. Adems, estudios
recientes proporcionan evidencia de un mecanismo inverso,
beta-catenina / Lef1 supresin a saber nuclear mediada por Ecadherina expresin durante el desarrollo normal de los
folculos pilosos en ratones (61). Los autores proponen que la
regulacin a la baja de la E-cadherina puede a su vez
perpetuar la va de sealizacin Wnt, mediante el aumento de
la piscina de la beta-catenina transcripcionalmente
competente.
El equilibrio cambiante entre los niveles de E-cadherina y
citoplsmico beta-catenina, bajo el control de la sealizacin
de Wnt, podra remodelar las junc- celulares, coordinando la
proliferacin celular con adhe- sin de clulas durante la
diferenciacin. Especulamos que las clulas madre y
progenitores tempranos, a diferencia de su progenie ms
diferenciado, no dependen de interacciones clula-clula para
la supervivencia. En apoyo de esta hiptesis es la capacidad
de una variedad de clulas madre / progenitoras para
sobrevivir en cultivo en suspensin, como se discuti
anteriormente. Por otra parte, las pequeas clulas de luz
mamarias (SLC), descritos por Smith y Chepko (62), cree que

tallo o clulas progenitoras tempranas, polaridad falta y

contactos de membrana especializadas con las clulas
vecinas. La ausencia de las protenas de unin brecha,
incluyendo conexinas, en las clulas progenitoras mamarias
se describi por Trosko et al. (63).
La utilizacin, el perfil transcripcional de mammospheres as
como clulas diferenciadas derivadas de mammospheres,
encontramos que E-cadherina se incrementa el nivel triple
expresin diferenciacin ing durante, mientras que los
represores de la E-cadherina Caracol y Slug son
downregulated de tres y dos veces, respectivamente (30). En
ausencia de las uniones adherentes y E-cadherina, la mayor
parte de la beta-catenina se localiza en el citoplasma.
Sealizacin a travs de los resultados de la va Wnt en la
actividad transcripcional de beta-catenina mediada que activa
diferentes conjuntos de genes, lo que se traduce en la autorenovacin y diferenciacin. El resultado probablemente
depende de las seales que modulan la respuesta va Wnt y
las interacciones con otras vas implicadas en ficacin destino
especificado. Mientras se produce la diferenciacin, la Ecadherina ex compresin aumenta progresivamente, adherens
forman uniones y los mecanismos antiapoptticos estn
regulados abajo. Nuclear beta-catenina y su actividad cional
transcripcin disminucin (Fig. 3).
En consecuencia, las clulas diferenciadas no son capaces de
migrar, dependen de la adhesin clula-clula para su
supervivencia, proliferacin y eRate menos. A favor de los
cambios sion este gen escenario expresin inducida por la
beta-catenina transactivacin muestran upregulation de cMyc, ciclina D1 (proliferacin), estromelisina-1, MMP 7 y Twist
(migracin) y en la Fig. 3. Conexin Wnt-E-cadherina en
clulas madre auto-renovacin, la diferenciacin y la
carcinognesis. Los niveles de beta-catenina

transcripcionalmente activa y la membrana E-cadherina estn

inversamente correlacionados y cambian progresivamente
durante la diferenciacin. En respuesta a la sealizacin de
Wnt, madre / progenitoras de clulas E-cadherina es
downregulated, la catenina beta recin sintetizado se dirige
hacia la piscina citoplasmtica y se transloca al ncleo, donde
se regula la auto-renovacin. Durante la diferenciacin, la
expresin de E-cadherina aumenta progresivamente y betacatenina es reclutado al sitio uniones adherentes, la
disminucin de la piscina de citoplasmtica beta-catenina
disponible para la actividad transcripcional
La activacin anormal de los resultados de la sealizacin de
Wnt en un aumento de la auto-renovacin de las clulas
madre o clulas progenitoras tempranas. Mutaciones
posteriores pueden dar lugar a la iniciacin y progresin del
cncer.
84 Dontu y Wicha en la regulacin de la E-cadherina, Ephrin y
BMP4. Adems, Fujita et al. informaron que estos eventos
estn bajo la regulacin hormonal, e implican el receptor
trogen es- (64). Ellos mostraron que en la glndula mamaria
expresin de E-cadherina est regulada por el receptor de
estrgeno a travs de MTA3, un componente de la / NuRD
complejo represor transcripcional Mi-2 que es un inhibidor
regulada ER de Snail, una represin sor de E- cadherina (64).
Durante la carcinognesis un evento clave puede ser
representado por una activacin anormal de ING sealizacin
Wnt, lo que resulta en un aumento de la auto-renovacin de
las clulas madre o clulas progenitoras tempranas. La va de
Wnt se ha asociado tanto con el desarrollo normal de la
glndula mamaria, desde las primeras etapas de la formacin
de anlage a la diferenciacin terminal durante la lactancia (de
65-68). Adems, la creciente evidencia apunta a un vnculo
entre la sealizacin de Wnt y neoplasia mamaria (69-71). Por

otra parte, parece que el papel de la activacin de Wnt en la

auto-renovacin de clulas madre podra ser la base de su
potencial oncognico (72).
Un nmero de estudios han proporcionado recientemente
evidencia de un papel directo de la sealizacin de Wnt en la
auto-renovacin de hematopoyticas normales, epidrmico, y
las clulas madre del intestino (73-76). El papel de Wnt de
sealizacin en la auto-renovacin de clulas madre
mamarias fue sugerido por estudios recientes de Alexander et
al. que utilizan ratones transgnicos para demostrar que la
sobreexpresin de ligandos Wnt en el estroma mamario o
activa beta-catenina en el epitelio mamaria conduce a un
mayor nmero de clulas madre mamaria (77). Un vnculo
directo entre la autorrenovacin de vstago / clulas
progenitoras y la carcinognesis fue sugerido por el estudio
de Li et al. que demostr en un modelo de ratn que la
expresin de los componentes de la va de sealizacin Wntinduce preferentemente cnceres de mama derivadas de
clulas progenitoras mamarias (70).
Mutaciones posteriores favorecidos por el aumento de la
actividad proliferativa pueden ocurrir durante la iniciacin y la
progresin del cncer. Sin embargo, algunos de los rasgos que
confieren selectiva ventaja de crecimiento a las clulas
cancerosas y contribuyen a la invasin y metstasis locales
son atributos normales de las clulas madre. La observacin
de que los mecanismos epigenticos pueden ser responsables
de alteraciones tales como la prdida de E-cadherina, durante
la carcinognesis es consistente con esta hiptesis.

CONCLUSIONES
En este artculo, hemos revisado el desarrollo de sistemas de
cultivo basados en suspensin para la propagacin de las
clulas madre y progenitoras de la glndula mamaria, as
como de otros rganos. La capacidad de las clulas madre
normales, as como sus homlogos malignos, para sobrevivir
en cultivo en suspensin sugiere un mecanismo molecular
comn que tambin puede tener importancia para el
comportamiento de las clulas madre in vivo. Se discute la
evidencia que sugiere que la va de sealizacin Wnt y de las
interacciones E-cadherina-beta-catenina puede jugar un papel
clave en la auto-renovacin de clulas madre normal y
diferenciacin, as como la supervivencia. Adems, se est
acumulando evidencia de que la desregulacin de esta ruta
desempea un papel importante en una variedad de
neoplasias, incluyendo cncer de mama. Estas neoplasias, a
su vez, puede ser accionado por un pequeo componente de
clulas madre dentro de los tumores. Este componente de
clulas madre, resistentes a los tratamientos convencionales,
puede contribuir a la recada despus de la terapia. La
inhibicin de las vas, tales como la sealizacin de Wnt,
puede por tanto llegar a ser una nueva estrategia teraputica
para dirigir selectivamente esta poblacin de clulas sistant
re-.

Agradecimientos:
Debo dar las gracias al Dr. Michael Clarke para ayudardiscusin ful, Dr. Kathleen Ignatoski, Dr. Suling Liu, el Dr. Ilia
Mantle, y el Dr. Nam-shik Ahn para su revisin crtica de este

trabajo. Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones

Nos. CA66233 y CA101860.