Análise da acção do magnésio na respiração mitocondrial e fosforilação

oxidativa por controlo da permeabilidade membranar.

Introdução
Um dos iões mais importantes no organismo humano é o magnésio (Mg2+) devido à sua
actividade reguladora. Encontra-se principalmente no citosol mas certos organitos celulares
possuem-no na sua constituição em menor percentagem.
Entre esses organitos destacamos as mitocôndrias. Estas encontram-se dependentes do
magnésio devido às suas funções no metabolismo mitocondrial, na regulação de actividades
enzimáticas e no transporte de aniões e catiões.
No que toca à regulação de actividades enzimáticas devemos sublinhar que a ATP-
sintetase não funciona na ausência de grandes concentrações de magnésio na matriz
mitocondrial.
Para extrair o magnésio da matriz e poder observar os efeitos na actividade da ATP-
intetase pode-se utilizar o ionóforo de catiões A23187 (A23).

Materiais e Equipamento
 Fracção de mitocôndria vegetal (tubérculo de batata) previamente preparada.
 Sistema de medição de potencial eléctrico (ΔΨ) mitocondrial com eléctrodo de
TPP+.
 Meio de reacção com 250 mM de sacarose, 20 mM de KCl, 2 mM de KH2PO4,
0.05% de BSA, 10 mM de HEPES, (pH 7.0).
 Soluções:
 1 mM de TPP+
 100 mM de ADP
 100 mM de ATP
 1 mM de A23187
 1 M de succinato de K
 100 mM e 250 mM de MgCl2
 100 mM e 250 mM de MnCl2
 100 mM e 250 mM de CaCl2

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 Resultados
1º Ensaio

Legenda 1: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de 5
mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção
constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com
TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram
adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1
µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

2
 2º Ensaio

Legenda 2: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na ausência de
MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção constituído por
sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde
já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram adicionados ao
meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1 µM de
A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

3
 3º Ensaio

Legenda 3: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
0.5 mM de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio de reacção
constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH 7.2 com
TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após estabilização foram
adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato, 300 nmoles de ADP, 1
µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

4
 4º Ensaio

Legenda 4: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP-sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
0.5 mM de CaCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de
meio de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM,
pH 7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após
estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,
300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

5
 5º Ensaio

Legenda 5: Registos obtidos por utilização de um eléctrodo de TPP+ e representativos da

actividade da ATP – sintetase num meio constituído por mitocôndrias vegetais na presença de
2 mM de MnCl2 em vez de MgCl2. As mitocôndrias (0.5 mg) foram adicionadas a 2 ml de meio
de reacção constituído por sacarose 250 mM, KCl 20 mM, BSA 0.05%, HEPES 10 mM, pH
7.2 com TPPCl 3 µM, onde já foi anteriormente adicionado 0.2 mM de ATP. Após
estabilização foram adicionados ao meio de reacção com mitocôndrias 10 mM de succinato,
300 nmoles de ADP, 1 µM de A23187 e, novamente, 300 nmoles de ADP.

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 Discussão
1º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova
fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à primeira. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida mas sem resultados evidentes, isto porque a concentração de
magnésio no meio apresentava um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio
na matriz mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) do magnésio para o
exterior.
Portanto, a 5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 150 nmol ADP foforilado . mg-
1
proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
Taxa de fosforilação = Concentração de ADP
Unidade de Tempo

TF = 300 nM = 150 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1

2 min

2º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, lenta. De seguida
foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial
para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se
novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a da própria
adição do ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a actividade do
A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio existente na matriz
mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da ATP - sintetase.
Portanto, na ausência de magnésio a taxa de fosforilação é de 75 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 75 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
4 min

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 3º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, ligeiramente mais
rápida que a que foi verificada no ensaio anterior. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja
função é retirar o magnésio que existe na matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que
a actividade foi realizada com sucesso adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse
momento verifica-se uma nova fosforilação oxidativa, com uma velocidade significativamente
mais lenta que a primeira. Assume-se então que a actividade do A23 foi exercida com algum
sucesso visto que uma quantidade relativamente notória de magnésio foi removida para o
exterior, apesar de que ainda se manteve bastante na matriz para que a ATP – sintetase pudesse
actuar com algum resultado.
Portanto, a 0.5 mM de magnésio a taxa de fosforilação é de 90.9 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 90.9 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
3.3 min

4º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso
adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento a única alteração registada é a
da própria adição de ADP sem ocorrência de fosforilação oxidativa. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida com sucesso, pois uma grande quantidade de magnésio
existente na matriz mitocondrial foi removida para o exterior, impedindo assim a actuação da
ATP-sintetase.
Portanto, a 0.5 mM de cálcio a taxa de fosforilação é de 200 nmol ADP foforilado . mg-1
proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 200 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
1.5 min

5º Ensaio
Analisando os resultados obtidos podemos assumir que ao serem adicionados os 300
nmoles de ADP ocorreu uma fosforilação oxidativa na matriz mitocondrial, relativamente
rápida. De seguida foi adicionado 1µM de A23 cuja função é retirar o magnésio que existe na
matriz mitocondrial para o meio. Para comprovar que a actividade foi realizada com sucesso

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adicionou-se novamente 300 nmoles de ADP. Nesse momento verifica-se uma nova
fosforilação oxidativa, com uma velocidade semelhante à da primeira. Assume-se então que a
actividade do A23 foi exercida mas sem sucesso, isto porque a concentração de manganésio no
meio apresenta um valor apreciável relativamente à concentração de magnésio na matriz
mitocondrial, não permitindo uma movimentação (significativa) de magnésio para o exterior.
Portanto, a 2 mM de manganésio a taxa de fosforilação é de 125 nmol ADP foforilado .
mg-1 proteína . minuto-1, como se pode comprovar com os cálculos seguintes:
TF = 300 nM = 125 nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
2.4 min

Tendo em conta toda a anterior análise e a seguinte tabela:

Actividade em nmol ADP foforilado . mg-1 proteína . minuto-1
2+
Mg (mM) Succinato
0 75
0,5 90,9
5 150
2+
Ca (mM) Succinato
0,5 200
2+
Mn (mM) Succinato
2 125
(A taxa de fosforilação na ausência de magnésio será menor que a taxa de fosforilação
referente à sua presença ou de manganésio. Na presença de magnésio a taxa aumenta consoante
a concentração de magnésio adicionada).

A conclusão desta experiência é:

O magnésio presente na matriz mitocondrial tem um papel muito importante
relativamente à fosforilação oxidativa como se pode verificar nos ensaios realizados.
No primeiro e terceiro ensaios, devido às quantidades de magnésio presentes no meio a
actividade do A23 não surtirá muitos efeitos. O magnésio existente na matriz mitocondrial não
será transportado para o meio já que as concentrações de magnésio aí existentes são
relativamente elevadas. Assim sendo, o magnésio existente na mitocôndria apresenta uma
concentração apreciável para que a ATP-sintetase exerça a sua função, o que se observa na
fosforilação oxidativa registada.
No segundo ensaio, não existe magnésio no meio. Desta forma o A23 exerce
plenamente a sua função extraindo o magnésio presente na mitocôndria, não ficando magnésio
suficiente para a ATP-sintetase actuar, impedindo a ocorrência de uma nova fosforilação
oxidativa. O mesmo se verifica no quarto ensaio, neste caso a diferença foi que em vez de ser

9
adicionado magnésio ao meio, foi adicionado cálcio. Verifica-se então que o cálcio não pode
substituir o magnésio, porque quando se adiciona A23 o magnésio presente na matriz sofre
transporte para o meio em grande quantidade. Este processo é igual ao que ocorre na ausência
de magnésio no meio.
Contrariamente a este último resultado, no quinto ensaio observa-se que quando se
adiciona manganésio ao meio vai ocorrer uma segunda fosforilação oxidativa, tal como no caso
em que existe magnésio no meio (1º e 3º ensaios). Assume-se então que o manganésio pode
substituir o magnésio no processo de respiração mitocondrial.

Relatório realizado por:

Ana Carina Estrela Maia
Ana Rita Gonçalves Graça
Turma P4
1º Turno

10