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CURVA PATRN PARA DETERMINACIN ESPECTROFOTOMTRICA

DE AMONIO
I.

INTRODUCCIN
El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la
utilizacin de tcnicas analticas que permitan su determinacin
cualitativa y cuantitativa, as como su caracterizacin fsico-qumica y
biolgica. Uno de los mtodos ms sencillos, accesibles, tiles y
utilizados es la espectroscopa, en general, y la espectroscopa
ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y cuantificar
biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo de
reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y
forman un producto coloreado que permite detectarlo en muestras
complejas.
El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las
molculas para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro
del espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que
una molcula puede absorber y la eficiencia con la que se absorben
dependen de la estructura atmica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza inica, constante dielctrica), por lo que dicha
tcnica constituye un valioso instrumento para la determinacin y
caracterizacin de biomolculas.
Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en
forma de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos
vitales como la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz
(considerada como energa) es absorbida por una molcula se origina
un salto desde un estado energtico basal o fundamental, E1, a un
estado de mayor energa (estado excitado), E2. Y slo se absorber la
energa que permita el salto al estado excitado. Cada molcula tiene
una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del resto de
molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas longitudes
de onda presenta una molcula -esto es, su espectro de absorcinconstituye una sea de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula
en forma excitada libera la energa absorbida hasta el estado energtico
fundamental.
En espectroscopa el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de
radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son
invisibles. En espectrofotometra de absorvancia se utilizan las regiones
del ultravioleta (UV cercano, de 195-400nm) y el visible (400-780nm).

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II. OBJETIVOS
Preparar soluciones acuosas de sulfato y diluirlas e al
concentracin deseada.
Leer la Absorbancia de un conjunto de soluciones patrn de
sulfato de amonio.
Graficar la curva patrn Absorbancia-ppm amonio.
Aplicar el mtodo de los mnimos para obtener la ecuacin de
ppm de amonio en funcin de la Absorbancia.
III. FUNDAMENTO TEORICO
EL MTODO DE NESSLER
Emplea una solucin alcalina de yoduro de potasio y mercurio que acta
sobre el amonio presente en la muestra, formando un compuesto
coloreado el cual se mide la Absorbancia a una longitud de onda de
380nm en un espectrofotmetro. El reactivo de Nessler debe ser recin
preparado y se debe determinar una curva patrn cada vez que se
prepare dicho reactivo.
La curva patrn sirve para determinar la concentracin de una sustancia
en una muestra, tendiendo la lectura de Absorbancia en un
espectrofotmetro. Esta tcnica analtica permite evaluar en un gran
nmero de muestras en un tiempo mucho menor, comparado con
mtodos volumtricos o gravimtricos.
Es un marco de referencia que se construye de cantidades conocidas de
una sustancia (por ejemplo la albmina srica bovina) que se utiliza
para determinar la cantidad de protenas presente en una muestra
incgnita.

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ESPECTROFOTOMETRIA
La espectrofotometra es el
mtodo de anlisis ptico ms
usado en las investigaciones
biolgicas.
El
espectrofotmetro
es
un
instrumento
que
permite
comparar
la
radiacin
absorbida o transmitida por
una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad
conocida de la misma sustancia.

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Todas las sustancias pueden absorber energa radiante, aun el vidrio
que parece ser completamente transparente absorbe longitud de ondas
que pertenecen al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la
regin del infrarrojo.
La absorcin de las radiaciones
ultravioleta, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las
molculas, y es caracterstica
para cada sustancia qumica.
Cuando la luz atraviesa una
sustancia, parte de la energa es
absorbida; la energa radiante no
puede producir ningn efecto sin
ser absorbida.
El color de las sustancias se debe a que stas absorben ciertas
longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas y solo dejan
pasar a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no absorbida.

MTODOS FOTOMTRICOS DE ANLISIS

NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA
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La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se

propaga en forma de ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:
Longitud de onda: es la distancia entre dos mximos de un ciclo
completo del movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en
nanmetros (nm) y sus equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0
= 10-9 m.
Frecuencia: es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la
longitud de onda., y se mide en ciclos por segundo o hertzios.
Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes
discontinuos de E. La E de un fotn depende de la frecuencia y de
la longitud de onda, segn la siguiente expresin.
Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E
radiante, desde los rayos de longitud de onda corta hasta las
ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias
regiones, las ms interesantes para nosotros son:
Regin Ultravioleta: = 10-380 nm

Regin Visible:

Regin Infrarroja:

= 380-780 nm
= 780-30.000 nm

En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca

contiene todo el espectro de longitudes de onda. Si interacciona con
una molcula puede ser dispersada o absorbida.
FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA
A. FENMENO DE ABSORCIN
Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado
fundamental interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma
en una partcula en estado excitado. La molcula absorbe la E de la
onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual a la E de
la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h). La partcula en
estado excitado tiende a volver de forma espontnea a su estado de
reposo desprendiendo la E absorbida en forma de calor.
Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el
nombre de cromgeno, tiene un determinado espectro de absorcin. El
espectro de absorcin es un grfico donde se representa en ordenadas
la Absorbancia y en abscisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la
espectrofotometra de absorcin.

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Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la
sustancia estudiada absorbe la mayor cantidad de luz (a mayor cantidad
de luz, mayor cantidad de sustancia).
B. FENMENO DE EMISIN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado
fundamental produciendo la emisin de energa radiante. En este caso,
lo que se mide es la energa emitida y, en este fenmeno se basa la
fotometra de llama o la fluorescencia.
LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta
prdida de intensidad, debido a la absorcin por parte de la sustancia.
Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la
luz transmitida:
T = Is / I0; %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el

solvente. Para evitar este error se hace una primera medida con una
solucin de referencia o BLANCO, que contiene todos los posibles
compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta
medida inicial y se harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida
del blanco.
La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque
la relacin entre A y la concentracin de una solucin es directamente
proporcional y la de la T es inversamente proporcional.
La relacin entre la Absorbancia y la transmitancia es la siguiente:
Si l %T = 100
A = 2-log T = 2-log 100 = 0
Si l %T = 0
A = 2-log 0 =
En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias,
pero el aparato lo que mide realmente es %T que luego transforma a
Absorbancia.

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LEY DE BEER
La Absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la
concentracin y a la longitud del paso de la luz.
A = . b. c
Siendo:
A: Absorbancia. No tiene unidades.
: el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de
absorcin. Es constante para un compuesto dado siempre que se fijen
condiciones de longitud de onda, de pH, de temperatura, de solventes,
etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).
b: es la longitud de paso de la luz, en cm.
c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L.
La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la
Absorbancia de una sustancia podemos averiguar su concentracin y
esto lo podemos hacer de dos formas:
Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2
soluciones, una problema (P) y una estndar (S), podemos
establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:
A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la
representacin grfica en un eje de coordenadas de la
Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de
abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida
y se determinan sus A, construyndose la curva de calibrado, que
es una recta. Una vez ensayadas las soluciones problemas, su
concentracin se averigua por interpolacin de las A de las
soluciones problema en la curva de calibracin.
Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de
concentraciones del cromgeno entre las cuales existe una
relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin.
Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de
linealidad se deja de cumplir la Ley de Beer, convirtindose la
recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los
lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente
baja de cromgeno. En esta situacin, hay que diluir la muestra
para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad.
Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y
sistemas fotomtricos estables, este factor se puede mantener
constante, siendo slo necesario ensayar las muestras problema
multiplicando la A resultante por el factor F.
TIPOS DE ESPECTROMETRA
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ESPECTROMETRA DE ABSORCIN
La espectrometra de absorcin es una tcnica en la cual la energa de
un haz de luz se mide antes y despus de la interaccin con una
muestra. Cuando se realiza con lser de diodo ajustable, se la conoce
como espectroscopia de absorcin con lser de diodo ajustable. Tambin
se combina a menudo con una tcnica de modulacin, como la
espectrometra de modulacin de longitud de onda, y de vez en cuando
con la espectrometra de modulacin de frecuencia a fin de reducir el
ruido en el sistema.
ESPECTROMETRA DE FLUORESCENCIA
La espectrometra de fluorescencia usa fotones de energa ms elevada
para excitar una muestra, que emitir entonces fotones de inferior
energa. Esta tcnica se ha hecho popular en aplicaciones bioqumicas y
mdicas, y puede ser usada con microscopa confocal, transferencia de
energa entre partculas fluorescentes, y visualizacin de la vida media
de fluorescencia.
ESPECTROMETRA DE RAYOS X
Cuando los rayos X con suficiente frecuencia (energa) interaccionan con
una sustancia, los electrones de las capas interiores del tomo se
excitan a orbitales vacos externos, o bien son eliminados
completamente, ionizndose el tomo. El "agujero" de la capa interior
se llena entonces con electrones de los orbitales externos. La energa
disponible en este proceso de excitacin se emite como radiacin
(fluorescencia) o quitar otros electrones menos enlazados del tomo
(efecto Auger). La absorcin o frecuencias de emisin (energas) son
caractersticas de cada tomo especfico. Adems, para un tomo
especfico se producen pequeas variaciones de frecuencia (energa)
que son caractersticas del enlace qumico. Con un aparato apropiado
pueden medirse estas frecuencias de rayos X caractersticas o energas
de electrones Auger. La absorcin de rayos X y la espectroscopia de
emisin se usan en qumica y ciencias de los materiales para determinar
la composicin elemental y el enlace qumico.
La cristalografa de rayos X es un proceso de dispersin. Los materiales
cristalinos dispersan rayos X en ngulos bien definidos. Si la longitud de
onda de los rayos X incidentes es conocida, se pueden calcular las
distancias entre planos de tomos dentro del cristal. Las intensidades de
los rayos X dispersados dan informacin sobre las posiciones atmicas y
permiten calcular la organizacin de los tomos dentro de la estructura
cristalina.
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ESPECTROMETRA DE LLAMA
Las muestras de solucin lquidas son aspiradas en un quemador o una
combinacin de nebulizador/quemador, desolvatadas, atomizadas, y a
veces excitadas a un estado electrnico de energa ms alta. El uso de
una llama durante el anlisis requiere combustible y oxidante,
tpicamente en forma de gases. Los gases combustibles comunes que se
usan son el acetileno (etino) o el hidrgeno. Los gases de oxidante
suelen ser el oxgeno, el aire, o el xido nitroso. Estos mtodos son a
menudo capaces de analizar elementos metlicos en partes por milln,
billones, o posiblemente rangos ms bajos de concentracin. Son
necesarios detectores de luz para detectar la luz con informacin que
viene de la llama.
* Espectrometra de emisin atmica. Este mtodo usa la excitacin de
la llama; los tomos son excitados por el calor de la llama para emitir
luz. Este mtodo suele usar un quemador de consumo total con una
salida de incineracin redonda. Se utiliza una llama de temperatura ms
alta que la usada en la espectrometra de absorcin atmica para
producir la excitacin de tomos de analito. Ya que los tomos de
analito estn excitados por el calor de la llama, no es necesaria ninguna
lmpara elemental especial. Puede usarse un policromador de alta
resolucin para producir una intensidad de emisin contra el espectro
de longitud de onda por encima de un rango de longitudes de onda que
muestran lneas de excitacin de elementos mltiples. O bien puede
usarse un monocromador en una longitud de onda determinada para
concentrarse en el anlisis de un solo elemento en una cierta lnea de
emisin. La espectrometra de emisin de plasma es una versin ms
moderna de este mtodo.
* Espectrometra de absorcin atmica (a menudo llamada AA). Este
mtodo usa un nebulizador pre-quemador (o cmara de nebulizacin)
para crear una niebla de la muestra, y un quemador en forma de ranura
que da una llama de longitud de ruta ms larga. La temperatura de la
llama es lo bastante baja como para no excitar los tomos de la muestra
de su estado basal. El nebulizador y la llama se usan para desolvatar y
atomizar la muestra, pero la excitacin de los tomos de analito se
realiza mediante lmparas que brillan a travs de la llama en varias
longitudes de onda para cada tipo de analito. En la absorcin atmica, la
cantidad de luz absorbida despus de pasar por la llama determina la
cantidad de analito en la muestra. Suele usarse un horno de grafito para
calentar, desolvatar y atomizar la muestra con el fin de obtener una
mayor sensibilidad. El mtodo del horno de grafito tambin puede
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analizar algn slido o muestras mezcladas. A causa de su buena
sensibilidad y selectividad, es un mtodo que todava se usa para el
anlisis de ciertos microelementos en muestras acuosas (y otros
lquidos).
* Espectrometra de fluorescencia atmica. Este mtodo usa un
quemador con una salida de incineracin redonda. La llama se usa para
solvatar y atomizar la muestra, y una lmpara emite luz a una longitud
de onda especfica en la llama para excitar los tomos de analito. Los
tomos de ciertos elementos pueden entonces fluorescer, emitiendo luz
en diferentes direcciones. La intensidad de esta luz fluorescente sirve
para cuantificar la cantidad del elemento analizado en la muestra.
Tambin puede usarse un horno de grafito para la espectrometra de
fluorescencia atmica. Este mtodo no es tan comn como el de
absorcin atmica o el de emisin de plasma.
ESPECTROMETRA DE EMISIN DE PLASMA
Es similar a la emisin atmica por llama, y la ha sustituido en gran
parte.
* Espectrometra de plasma de corriente contnua (DCP). Un plasma de
corriente contnua se crea por una descarga elctrica entre dos
electrodos. Es necesario un gas de apoyo al plasma, y el ms comn es
el argn. Las muestras pueden ser depositadas en uno de los
electrodos.
* Espectrometra de emisin ptica por descarga luminiscente (GD-OES)
* Espectrometra de emisin plasma-atmica acoplada inductivamente
(ICP-AES)
* Espectrometra de ruptura inducida por lser (LIBS), tambin llamada
espectrometra de plasma inducida por lser (LABIOS)
* Espectrometra de plasma inducida por microondas (MIP)
ESPECTROMETRA DE CHISPA O ARCO
Se usa para el anlisis de elementos metlicos en muestras slidas.
Para materiales no conductores, se usa polvo de grafito para hacer
conductora la muestra. En los mtodos de espectroscopia de arco
tradicionales se usa una muestra slida que es destruida durante el
anlisis. Un arco elctrico o chispa se pasan por la muestra,
calentndola a alta temperatura para excitar los tomos. Los tomos de
analito excitado emiten luz en varias longitudes de onda que pueden ser
detectadas mediante mtodos espectroscpicos comunes. Ya que las
condiciones que producen la emisin por arco no son controladas
cuantitativamente, el anlisis de los elementos es cualitativo. Hoy da,
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las fuentes de chispa con descargas controladas bajo una atmsfera de
argn permiten
que este
mtodo
pueda
ser considerado
eminentemente cuantitativo, y su uso est muy extendido en los
laboratorios de control de produccin de fundiciones y aceras.
ESPECTROMETRA VISIBLE
Muchos tomos emiten o absorben la luz visible. A fin de obtener un
espectro lineal fino, los tomos deben estar en fase gaseosa. Esto
significa que la sustancia tiene que ser vaporizada. El espectro se
estudia en absorcin o emisin. La espectroscopia de absorcin visible a
menudo se combina con la de absorcin ultravioleta (espectroscopia
UV/Vis). Aunque esta forma pueda ser poco comn al ser el ojo humano
un indicador similar, todava se muestra til para distinguir colores.
ESPECTROMETRA ULTRAVIOLETA
Todos los tomos absorben en la regin ultravioleta (UV) ya que estos
fotones son bastante energticos para excitar a los electrones externos.
Si la frecuencia es lo bastante alta, se produce la fotoionizacin. La
espectrometra UV tambin se usa para la cuantificacin de protenas y
concentracin de ADN, as como para la proporcin de protenas y ADN
en una solucin. En las protenas se encuentran generalmente varios
aminocidos, como el triptfano, que absorben la luz en el rango de
280nm. El ADN absorbe la luz en el rango de 260nm. Por esta razn, la
proporcin de Absorbancia 260/280nm es un buen indicador general de
la pureza relativa de una solucin en trminos de estas dos
macromolculas. Tambin pueden hacerse estimaciones razonables de
la concentracin de ADN o protenas aplicando la ley de Beer.
ESPECTROMETRA INFRARROJA
La espectrometra infrarroja ofrece la posibilidad de medir tipos
diferentes de vibraciones en los enlaces atmicos a frecuencias
diferentes. En qumica orgnica, el anlisis de los espectros de
absorcin infrarroja indica qu tipo de enlaces estn presentes en la
muestra.
ESPECTROMETRA RAMAN
La espectrometra Raman usa la dispersin inelstica de la luz para
analizar modos vibracionales y rotatorios de las molculas. Las "huellas
digitales" que resultan son una ayuda para el anlisis.
ESPECTROMETRA DE RESONANCIA MAGNTICA NUCLEAR (RMN)
La espectrometra de resonancia magntica nuclear analiza las
propiedades magnticas de ciertos ncleos atmicos para determinar
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diferentes ambientes locales electrnicos del hidrgeno, carbono, u
otros tomos en un compuesto orgnico u otro compuesto. Se usa para
determinar la estructura del compuesto.
ESPECTROMETRA DE FOTOEMISIN
La fotoemisin puede referirse a:
* Emisin de electrones a partir de la materia despus de la absorcin
de fotones energticos (efecto fotoelctrico).
* Emisin de fotones a partir de los semiconductores y metales cuando
los electrones que fluyen en el material pierden energa mediante
deceleracin o recombinacin.
ESPECTROMETRA MSSBAUER
La espectrometra de transmisin o conversin electrnica (CEMS) de
Mssbauer prueba las propiedades de los ncleos de istopos
especficos en ambientes atmicos diferentes, analizando la absorcin
resonante de rayos gamma de energa caracterstica, lo que se conoce
como efecto de Mssbauer.
COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible

o no visible.
Tipos de lmparas:
Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes
de onda del espectro visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes
de un espectro continuo de energa radiante entre 360-950 nm.
Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor
duracin y emiten energa radiante de mayor intensidad.
Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro
continuo en la regin ultravioleta entre 220-360 nm.
Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo
o espectro de lneas que se utilizan para calibracin de longitudes
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de onda, se emplean
cromatografa HPLC.

solo

para

espectrofotmetros

2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz

difusa y evitar que la luz dispersa entre en el sistema de seleccin de
longitud de onda.
3. Monocromadores. Pueden ser:
Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que
permite el paso de la luz. Ej. De vidrio para trabajar en el espectro
visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.
Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas
situadas a distancias iguales entre s y son hendiduras sobre un
vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se
comporta como un pequeo prisma.
4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa
atraviese la cubeta de la muestra, que provocara desviaciones a la Ley
de Beer.
5. Celdas: es el recipiente donde se coloca la muestra
para la medicin. Pueden ser de distintos tipos y tamaos
(cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen
mejores resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si
se utilizan celdas redondas se deben marcar e introducir
en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en
vidrio o en plstico.

6. Detector. Puede ser de dos tipos:

Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:

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Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de
Selenio o de xido de Cobre. A esto se le conoce como
semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal
transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y
ste desprende electrones, que pasan a la placa de Cobre originando
una diferencia de potencial por existir carga negativa sobre el Cobre
y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro
que seala el paso de corriente.
Caractersticas: son resistentes; econmicas; sensibles desde el
ultravioleta hasta los 1.000nm de longitud de onda; no se requiere
batera externa, ni vaco; la corriente producida es directamente
proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir,
que presentan una subida inicial de corriente, que luego decrece
progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que esperar entre
30-60 segundos entre una lectura y otra.
Fototubos multiplicadores:
Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que
emite electrones de forma proporcional a la Energa que incide sobre
l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la corriente se
multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos
nodos que van teniendo un voltaje superior al precedente. La seal
se amplifica en cientos o miles de veces.
Caractersticas: el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen
efecto fatiga tan altos como la anterior y son muy sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge
el detector y que puede ser lectura directa (se utiliza una clula
fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como en el caso del
fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y
clculos automticos de concentraciones con relacin a las curvas de
calibracin.

MNIMOS CUADRADOS

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Mnimos cuadrados es una tcnica de anlisis numrico encuadrada

dentro de la optimizacin matemtica, en la que, dados un conjunto de
pares, se intenta encontrar la funcin que mejor se aproxime a los datos
(un "mejor ajuste"), de acuerdo con el criterio de mnimo error
cuadrtico.
En su forma ms simple, intenta minimizar la suma de cuadrados de las
diferencias ordenadas (llamadas residuos) entre los puntos generados
por la funcin y los correspondientes en los datos. Especficamente, se
llama mnimos cuadrados promedio (LMS) cuando el nmero de datos
medidos es 1 y se usa el mtodo de descenso por gradiente para
minimizar el residuo cuadrado. Se puede demostrar que LMS minimiza
el residuo cuadrado esperado, con el mnimo de operaciones (por
iteracin), pero requiere un gran nmero de iteraciones para converger.
Desde un punto de vista estadstico, un requisito implcito para que
funcione el mtodo de mnimos cuadrados es que los errores de cada
medida estn distribuidos de forma aleatoria.
La tcnica de mnimos cuadrados se usa comnmente en el ajuste de
curvas. Muchos otros problemas de optimizacin pueden expresarse
tambin en forma de mnimos cuadrados, minimizando la energa o
maximizando la entropa.

EL YODURO DE POTASIO
Esta sal blanca es el compuesto yoduro de ms importancia comercial.
Es menos higroscpico (absorbe el agua con menos facilidad) de yoduro
de sodio, por lo que es ms fcil trabajar con l.

El yoduro de potasio se suministra con fines medicinales en 130 mg

comprimidos para casos de emergencia. El yoduro de potasio tambin
puede ser administrado como una "solucin saturada de yoduro de
potasio" (SSKI), que en la USP formulacin genrica contiene 1000 mg
de KI por ml de solucin.

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TARTRATO DE SODIO Y POTASIO
Su formula qumica es KNaC4H4O6.4H2O. Tiene las siguientes
caractersticas:
Aspecto: Cristales descoloridos, transparentes o polvo blanco.
Olor: Inodoro.
Solubilidad: Soluble en agua.
Densidad: 1.79.
pH: 7-8.
Punto que hierve: 220C (428F) comienza a descomponerse.
Punto de fusin: 70 - 80C (158 - 176F).
Densidad del vapor (Air=1): Ninguna informacin encontr.
Presin del vapor (milmetro hectogramo): Ninguna informacin
encontr.
Tarifa de la evaporacin (BuAc=1): Ninguna informacin encontr.
Estabilidad: Establo bajo condiciones ordinarias del uso y del
almacenaje.
Condiciones a evitar: Calor, llamas, fuentes de ignicin e incompatibles.
IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

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Fiola de 200mL
Fiolas de 50mL
Tubos de ensayo
Balanza analtica
Vasos de presipitados de
100mL
Pipetas de 1mL
Pipetas de 10mL.
Frasco mbar de 250mL
Agua destilada

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Centrifuga
Espectrofotmetro
Cocina elctrica
KI
HgCI2
KOH
I2
Tartrato de sodio
potasio.

V. PROCEDIMIENTO
1. Preparativo del reactivo Nessler
Para preparar el reactivo Nessler se disuelve 10g de KI en 10mL de
agua, aparte se disuelve 5g de HgCI2 en 20mL de agua caliente,
luego ambas soluciones se mezclan. A esto se adiciona la solucin
obtenida al disolver 30g de KOH en 60mL de agua. La mezcla
resultante se afora a 200mL. Finalmente, se separa por
centrifugacin el lquido sobrante y se almacena en un frasco ambar.
La duracin mxima del reactivo de Nessler es de un mes.
2. Preparacin de otras soluciones.
La solucin de yodo 0.01N se prepara disolviendo 40g de KI en poco
agua, se le adiciona 1.27g de yodo y una vez disuelto se afora a 1
litro.
La solucin tartrato de sodio y potasio al 50% (p/v) se prepara
disolviendo 5g de tartrato de sodio y potasio en agua hasta un
volumen de 10mL.
3. Determinacin espectrofotmetro de amonio
Encender el espectrofotmetro media hora antes de empezar la
lectura.
En el espectrofotmetro, seleccionar la longitud de onda de
380nm.
Pipetear 5 mL de la solucin a una fiola de 50mL.
Aadir agua destilada hasta la mitad de la fiola.
Agregar 1mL de solucin de yodo 0.01N.
Agregar dos gotas de solucin de tartrato de potasio al 50%(p/v).
Adicionar dos mililitro del reactivo Nessler y aforar la fiola. Hasta
aqu, la solucin se habr diluido 10 veces.
Preparar un blanco, solo agua destilada con los reactivo
indicados en anteriormente.
Con el blanco, calibrar a cero de absorbancia el
espectrofotmetro a 380nm.
Leer la Absorbancia de la muera a 380nm en el
espectrofotmetro.
Los datos de concentracin de amonio (x) y la lectura de
absorbancia (Y) de cada muestra a 380nm de ajusta a recta con
mtodo de los mnimos cuadrados como se indica en la Tabla 2. Las
ecuaciones correspondientes al mtodo de los mnimos cuadrados
son:

Y n b0 b1 X =0
YX b0 X b1 X 2=0
Y =b 0b 1 X :ecuacin de una recta b 0 :intercepto b 1= pendiente
VI. RESULTADOS
1. Preparacin de 6 soluciones patrn de (NH4)2SO4
Calculo de los miligramos de sulfato de amonio para 1 litro, que
contiene las ppm de amonio indicadas en la Tabala1.
mg ( N H 4 )2 S O4
W mg N H 4 132 g ( N H 4 ) 2 S O4
X
=A.
L solucin
2(18) N H 4
L solucion
132 g ( N H 4 )2 S O4
mg ( N H 4 )2 S O 4
2mg N H 4
X
=7.33
1 L solucin
2( 18) N H 4
L solucion
Para no preparar u litro de solucin, el resultado lo convertimos en
gramos de sulfato de amonio para 50mL de solucin.
A.

mg ( N H 4 )2 S O 4
1g
x 0.05 L solucin x
=Bg ( N H 4 ) 2 S O 4
L solucion
1000 mg

7.33

mg ( N H 4 )2 S O 4
1g
x 0.05 L solucin x
=0.3665 g ( N H 4 )2 S O4
L solucion
1000 mg
Nota: As realizamos el clculo de las 6 muestras.

Como el valor resultante es muy pequeo y no se puede medir

correctamente, se pesara 1000 veces ms, se preparara la solucin y
luego se diluir 1000 veces para tener recin la solucin que se
necesita. Realizamos clculo similar para las otras.
Tabla 1. Soluciones de sulfato de amonio para preparar la curva
patrn con reactivo de Nessler.
Numer
o
muestr
a
1

Ppm
(mg/L)

NH4+ (NH4+)2SO4
(mg/L)

(NH4+)2SO4
(g/50mL)

(NH4+)2SO4
(g/50mL)x1000

7.33

0.0003667

0.3667

2
3
4
5
6

4
5
6
8
10

14.67
18.334
22.000
29.3336
36.667

0.0007334
0.0009167
0.00110
0.001467
0.001833

0.7333
0.9167
1.1000
1.4667
1.8333

Si preparamos la solucin de acuerdo a la ltima columna de la Tabla

1, la debemos diluir 1000 veces para tener la concentracin de
amonio indicado en la segunda columna de la misma tabla. Al
realizar la evaluacin espectrofotomtrica del amonio, la solucin se
diluye 10 veces ms con los reactivos del mtodo de Nessler.
Para diluir una solucin 1000 veces, se debe tener 3 tubos de ensayo
numerados y con 9mL de agua destilada en cada uno.
Pipetear un mL de la solucin (muestras 1) al primer tubo de ensayo,
agitar enrgicamente. Pipetear 1mL del tubo 1 al tubo 2, agitar
enrgicamente.
Pipetear 1mL del tubo 2 al tubo 3, agitar enrgicamente. En el tubo 3
la solucin estar diluida 1000 veces.
Y se procede de la misma forma con las otras muestras obteniendo
un total de 18 tubos.
1mL
1mL

1mL

2. Lectura de la Absorbancia de las soluciones patrn.

Tabla 2. Linealizacin con el mtodo de los mnimos cuadrados para
obtener la ecuacin de ppm en funcin de la Absorbancia a 380nm
con reactivo Nessler.
N
Muestr
Ppm
a NH4+ (X)
1
0,2
2
0,4
3
0,5
4
0,6
5
0,8
6
1,0

X2
Absorbancia
(Y)
0,060
0,095
0,140
0,159
0, 270
0,305

XY
0,01200
0,03800
0,07000
0,09540
0,02160
0,30500

0.04
0.16
0.25
0.36
0.64
1

N=6
( x )=

( Y ) =

3,5

X2

( XY )=

1.029

0,7364

=2.45

3. Graficar la Absorbancia-ppm NH4+ en papel milimetrada.

El eje X va las ppm de amonio y el eje Y la Absorbancia.
0.35
0.3
0.25
0.2
Absorvancia

0.15
0.1
0.05
0
0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.1

ppm NH4+

4. Determinacin de la ecuacin para ppm NH 4+ de amonio en funcin

de la Absorbancia.
Remplazamos los datos de la Tabla 2 en la ecuacin.
Y n b0 b1 X =0 ; n :numero de datos b0 :intercepto b1 =pendiente
1. 0296 b0 b1 3.5=0
Despejamos en funcin de b1:
1.0296 b0
=b1
3.5
Remplazamos b0 por su equivalente en la ecuacin anterior.
0. 7364b0 3.5b 1 2.45=0
Calculamos b0 y b1

0.7364b 0 3.5 1.0296 b0

=
2.45
3.5
2.577412.25 b0=2.520114.7 b0
2.45 b0=0.0573
b0 =0.0234
b1=0.334
Remplazamos b0 y b1 en la ecuacin.
Y =b 0b 1 X :ecuacion de una recta ;
b0 :intercepto ,
b1= pendiente
Y =0.0 234+ 0.334 X

X=

VII.

Y +0.0234
0.334

CONCLUSIONES
En el practico realizado el objetivo era descubrir la concentracin
desconocida de la muestra para lo cual utilizamos el mtodo del
espectrofotmetro. Este es un mtodo muy confiable, siempre y cuando
se tengan las precauciones del caso, como sera la limpieza en el
trabajo, el orden y la precisin.
La prctica realizada nos permiti encontrar las ecuaciones que nos
permitirn encontrar el amonio ppm de una muestra desconocida.
Adems nos permiti darnos cuenta de la precisin y la dedicacin que
se debe tener al realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier
error en el mtodo nos entregara un resultado equivoco, cosa que no es
para nada conveniente al momento de realizar un diagnostico.
Adems para realizar la medicin espectrofotomtrica tuvimos que
calibrar el aparato a 0 absorbancia para lo cual usamos la muestra

blanco, adems de esto, debimos elegir cubetas que estuvieran en buen

estado, es decir, que estuvieran dentro del rango de absorbancia
permitida de 0.015, ya que si hubiramos usado cubetas defectuosas se
alterara la lectura real de nuestra muestra.
VIII. RECOMENDACIONES

Tomar precauciones con las subidas y bajadas bruscas de tensin

producen sufrimiento de la lmpara y cambios en las lecturas de
la Absorbancia.
La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que
funcione bien el aparato.
Otro punto importante fue realizar una homogenizacin correcta
de los tubos, con el fin de evitar errores posteriores y realizar una
lectura uniforme en el espectrofotmetro.
Tener cuidado con las celdas que no estn rayadas, sucias porque
eso alterara el resultado, adems tener en cuenta la posicin de
correcta de la celda.
Tomar precauciones con la manipulacin de tartrato de potasio
puede causar la irritacin a la piel, a los ojos, y a la zona
respiratoria.

IX. BIBLIOGRAFIA
SKOOG, WEST, HOLLER, Qumica analtica, Sptima edicin,
Editorial McGraw-Hill, 2001, Mxico. Pginas 578-581.
ALFONSO CLAVIJO DAZ. Fundamentos de Qumica Analtica.
Universidad Nacional de Colombia, 2002.ISBN: 9587011430.
GARY, CHRISTIAN. Qumica Analtica Primera Edicin, Editorial
Limusa S.A., Mxico 1981.
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/