26-10-2012

ENZIMOLOGA CLNICA
BIOQ 142 2012
T.M. Mg. Cs (c) Carlos Oyarzn
Instituto de Bioqumica y Microbiologa
Universidad Austral de Chile

Introduccin

Casi todas las funciones biolgicas se realizan gracias a

reacciones qumicas catalizadas por las enzimas.
Prcticamente todas las enzimas son protenas.

Las molculas de RNA desempean en ocasiones papeles catalticos)

Ej: La conversin de sacarosa en CO2 y H2O en

presencia de oxgeno es un proceso altamente
exergnico, sin la catlisis, reacciones como la de la
oxidacin de la sacarosa no podran darse en una escala
de tiempo conveniente.

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Las enzimas alteran la energa de

activacin pero no el equilibrio

Las enzimas aceleran las reacciones qumicas, pero no

alteran el equilibrio de una reaccin, sino que tan solo
son capaces de disminuir la energa de activacin y
acelerar as su velocidad.

Descripcin de una reaccin enzimtica:

E + S ES EP E + P
E = enzima
S= sustrato
P=producto

Las enzimas disminuyen la energa de

activacin

Cuando ocurre una reaccin qumica,

el sustrato debe adquirir una energa
de activacin hasta un punto
denominado estado de transicin
de la reaccin, que posee un nivel
de energa mximo.

Dado que el estado de transicin de

la reaccin catalizada por la enzima
tiene una energa menor que en la
reaccin no catalizada, aquella puede
ocurrir ms rpidamente.

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La formacin de un complejo enzima

sustrato

En una reaccin catalizada por enzimas, stas se unen al

sustrato para formar un complejo.

La formacin del complejo da pie a la formacin de

la especie de estado de transicin, que a su vez forma
el producto.

La formacin de un complejo enzima

sustrato

Modelo de ajuste inducido

D-glucosa -> Glucosa 6-fosfato

Hexoquinasa

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Ejemplo: estado de transicin

Factores que afectan a las reacciones

enzimticas

Concentracin de sustrato.

Efecto de la temperatura.

Efecto del pH y composicin del tampn.

Cofactores.

Concentracin de inhibidores y activadores.

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Concentracin de sustrato

Uno de los factores clave que afecta a la velocidad de una

reaccin catalizada por una enzima es la concentracin de
sustrato presente.

S > E actividad hasta obtener Vmax

Los mtodos se realizan en exceso de

sustrato, de esta forma existe una proporcionalidad directa entre los resultados
obtenidos y la concentracin de la
enzima a determinar.

Efecto de la temperatura

Alrededor de lo 65 C se inactivan la mayora de las

enzimas.
La congelacin habitualmente no destruye las enzimas
Por cada elevacin de 10 C en la T algunas enzimas
duplican su actividad.
Un aumento de un C produce un aumento aprox. 10%
en la actividad.

Pero a medida que la T aumenta, la degradacin de la

enzima.

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Efecto de la temperatura

En la determinacin de enzimas en diagnstico clnico, la

T de reaccin ms utilizada es de 37C a pesar que a 2530C las reacciones son ms estables.

Entonces por qu se utiliza habitualmente 37C?

Efecto del pH y composicin del tampn

Las enzima tiene un pH optimo o un intervalo de pH en

el que su actividad es mxima

1,6

La pepsina hidroliza ciertos enlaces

peptdicos de protenas durante la
digestin en el estmago, tiene un pH
ptimo alrededor de 1,6. El pH del jugo
gstrico se encuentra entre 1 y 2.

7,8

La glucosa 6-fosfatasa de los hepatocitos,

con un pH ptimo alrededor de 7,8, es
responsable de la liberacin de glucosa a la
sangre. El pH normal del citosol de los
hepatocitos es alrededor de 7,2.

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Efecto del pH y composicin del tampn

A valores superiores o inferiores del pH ptimo

(o rango de pH) la actividad enzimtica disminuye Por
qu?

Algunas cadenas laterales de lo aminocidos pueden actuar como cidos o

bases dbiles que desarrollan funciones crticas en el sitio activo de la enzima
que dependen del mantenimiento de un cierto grado de ionizacin.

cambios en la estructura de la enzima:

- Sitio activo
- Conformacin tridimensional

cambios en la carga:

- de la enzima
- del sustrato
- ambos

Efecto del pH y composicin del tampn

Los tampones elegidos deben tener un pKa de 1

unidad de pH respecto del pH ptimo de la enzima.

Muchas veces los productos de una reaccin enzimtica

son cidos o bsicos y al acumularse alteran el pH
ptimo de la enzima.

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Efecto del pH y composicin del tampn

Como en el caso de la fosfatasa alcalina, algunos

tampones no solo sirven para regular el pH sino que
tambin participan en la reaccin
..EP E + P

La etapa limitante de la reaccin es la velocidad de

hidrlisis de la unin enzima-PO-2 para generar
nuevamente la enzima libre

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Efecto del pH y composicin del tampn

Fosfatasa alcalina

Tampn Glicina
Tampn Dietanolamina

pH 10,2
pH 10,2

actividad
actividad

Cul es la diferencia?

La dietanolamina regula el pH de la reaccin y acta

como aceptor del fosfato liberado por la fosfatasa
(transfosforilacin), lo que produce una actividad
de la enzima.

Cofactores

Algunas enzimas requieren para su mxima actividad de

uno o varios componentes qumicos, estos son iones
inorgnicos tales como el Fe2+, Mg2+, Mn2+ o Zn2+

Iones inorgnicos molculas orgnicas ms complejas.

Amilasa requiere ClFosfatasa alcalina requiere Mg2+

Piruvato quinasa requiere K+ adems de Mg2+

En cada caso se debe determinar la concentracin ptima

del cofactor.

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Cofactores
Diferentes enzimas requieren diferentes cofactores
Por ejemplo:

Deshidrogenasas requieren NAD+ o NADP+

Transaminasas requieren piridoxal-5-fosfato
En general el cofactor se adiciona a una concentracin
10 veces el Km

Cofactores
Espectro de absorcin de cofactores NAD+ y NADH

Det. Lctico deshidrogenasa (LDH)

Piruvato + NADH +H+
L-lactato + NAD +
LDH

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Determinacin de Aspartato Amino Transferasa (AST/GOT)

Que compuesto se lee y a que longitud de onda????

Factores que afectan a las reacciones

enzimticas

Concentracin de sustrato.

Efecto de la temperatura.

Efecto del pH y composicin del tampn.

Cofactores.

Concentracin de inhibidores.

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Enzimas, su valor dignstico

Clasificacin general de enzimas plasmticas

Las enzimas en el plasma pueden clasificarse como:

Funcionales:

Se encuentran en circulacin, cumpliendo una

funcin especfica .
Generalmente sintetizadas en el hgado y liberadas al torrente
sanguneo.

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Clasificacin general de enzimas plasmticas

No

funcionales: NO se encuentran plasma, o sus niveles son

muy inferiores a los que existen en los tejidos.
Su aumento en circulacin generalmente se asocia a dao tisular.
Pueden dar especificidad tisular para aquellos tejidos ms ricos en
ellas.
secreciones exocrinas (Amilasa, lipasa)
constituyentes intracelulares (CK, LDH)

En condiciones fisiolgicas

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Alteracin de la Concentracin Enzimtica en

Circulacin Sangunea

Aumentos de la actividad enzimtica

1.
2.
3.
4.

Incremento patolgico de la permeabilidad de

membrana.
Muerte y destruccin celular.
Induccin de la expresin.
Proliferacin celular.

Alteracin de la Concentracin Enzimtica en

Circulacin Sangunea

1.
2.
3.

Disminuciones de la actividad enzimtica.

Intoxicaciones (apoptosis, necrosis, disfuncin celular*)
Enfermedades crnicas (idem anterior)
Alteraciones del estado nutritivo (principalmente
disfuncin celular*)

* En algunos casos tambin se observan aumentos de actividad enzimtica.

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El Valor Diagnstico de las Enzimas

El Valor Diagnstico de las Enzimas

Depende de:

Localizacin: a nivel de tejidos e intracelular (citoslica u

organelo)

Vida media en sangre

desestabilizadores)

Factores de circulatorios (vascularizacin del rea,

presencia o ausencia de barrera inflamatoria, velocidad
de circulacin del lquido extracelular)

(tamao,

inhibidores

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Caractersticas de las enzimas utilizadas como

marcadores:

Intracelulares de concentracin muy baja en plasma.

Su relacin concentracin plasma/tejidos es < 1:1000.

La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha

habido lesin (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulacin de
enzimas normalmente confinados en el interior de las clulas.

La cantidad de actividad enzimtica medible depende de su liberacin al

medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminacin.

Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en

un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular especfico.

Laboratorio

Determinaciones con el uso de enzimas

Determinaciones:
Actividad enzimtica
Cuantificacin de enzimas

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Tipos de Ensayo enzimticos

Punto final / tiempo fijo:

Cintico / dos puntos:

Punto final / cintico

ACOPLADO:

Laboratorio

Determinaciones con el uso de enzimas

Determinaciones:
Actividad enzimtica
Cuantificacin de enzimas

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Glucosa GOD/PAP
Glucosa oxidasa

Glucosa + O2 + H2O

cido glucnico + H2O2

Peroxidasa

2H2O2 + 4-aminofenazona + 4-hidroxibenzoato

quinonimina roja
FACTORES QUE AFECTAN A LAS REACCIONES .
Concentracin de sustrato:
pH y composicin del tampn: PREPARACIN REACTIVOS/KITS
Cofactores:

Efecto T:

Programacin / control de equipos

Concentracin de inhibidores:

Tipos de muestras, plasma, suero, orina, LCR

Laboratorio

Determinaciones con el uso de enzimas

Determinaciones:
Actividad enzimtica
Cuantificacin de enzimas

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Unidad de Actividad Enzimtica (UI)

Definicin:
Una unidad Internacional de actividad enzimtica (UI) es la
cantidad de enzima necesaria para transformar un micromol
(mol) de sustrato en un minuto bajo condiciones ptimas de
temperatura y pH

En las determinaciones clnicas, la concentracin de enzimas de

una muestra generalmente se expresa en U/L (Actividad
enzimtica)

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA

Actividad enzimtica (U/L)

- Generalmente cinticas/2 Puntos

- generacin de un producto
- disminucin de sustrato
- determinacin de Abs min
- coeficiente de Molar

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