Anda di halaman 1dari 18

STKM 2022 - ANALISIS MAKANAN

LANJUTAN
TEKNIK SPEKTROFOTOMETRI

SPEKTROSKOPI

Spektroskopi melibatkan penghasilan, pengukuran dan penterjemahan spectra yang


terbentuk daripada interaksi radiasi electromagnet dengan jirim (matter). Jenis
kaedah spektroskopi berbeza mengikut:
Sepsis yang hendak dianalisis (spektroskopi molekul, atom)
Jenis interaksi radiasi-jirim yang hendak dimantau (penyerapan, pancaran
atau penyerakan)
Kawasan spektrum elektromagnet yang digunakan dalam analisis (UV=200 –
350 nm, Vis=350 – 900 nm, IR dan NMR)

Berdasarkan perkara diatas, maka sekarang terdapat beberapa kaedah


spektrofotometri seperti:
AAS/AES = penyerapan/pancaran atom
UV-Vis = penyerapan molekul
Fluoromentri = pancaran molekul
Spektrometri Jisim (MS) = pemecahan molekul disebabkan oleh elektron
bertenaga tinggi → pecahan molekul bercas
NMR (nuclear magnetic resonance) = sensitiviti magnet nukleus atom (spin
nucleus) terhadap persekitaran molekul atau ion nya
ESR (electron spin resonance) = sama seperti NMR tetapi melibatkan elekron
tunggal (spin elektron) dan ion logam dalam paramagnet
IR (infra red) = mengukur penyerapan radiasi pada frekuensi berbeza.
Radiasi IR = 0.8 – 100 µ m. IR dekat = 0.8 – 2.5 µ m, IR pertengahan = 2.5 – 15
µ m, IR jauh = 15 – 100 µ m.
PENYERAPAN CAHAYA TAMPAK DAN ULTRA-
LEMBAYUNG

Pendahuluan

Spektrum elektromagnetik seperti ditunjukkan didalam Rajah 1 , adalah


terdiri dari urutan (continuum) gelombang dengan sifat-sifat yang berbeza-beza.
Kawasan gelombang yang penting didalam biokimia ialah untra-lembayung (UV, 180 -
350 nm) dan tampak (VIS, 350 - 800 nm). Cahaya didalam kawasan ini mempunyai
tenaga yang cukup untuk menguja (excite) elektron valensi didalam molekul
tersebut.

}
1,000,000
Gelombang Mikro

}
100,000

Cahaya bertindak Ingra-Merah Tenaga Meningkat


seolah-olah ianya terdiri 10,000

dari zarah-zarah tenaga.


1,000
Banyaknya tenaga, E yang
dipunyai oleh zarah ini (atau Panjang Gelombang (nm)
} Tampak (800 - 320 nm)

foton) diberikan oleh } Untra-Lembayung

}
100
persamaan berikut:-
10 Ultra-Lembayung Vakum
E = hv

}
.....................................................
1
......... (Persamaan 1.0) Sinar-X dan lain-lain Sinaran Nuklear
dimana h ialah konstan 0
Planck (h = 6.62 x 10-34 Js)
dan v ialah frekuensi..
Rajah 1. Spektrum Elektromagnetik
Sinaran mempunyai komponen elektrik dan magnet → sinaran electromagnet.
Sinaran elektromagnet boleh bertindak dengan jirim (matter) dalam berbagai cara.
Sekiranya interaksi itu mengakibatkan pemindahan tenaga dari satu alur tenaga
sinaran kepada jirim, ia dinamakan penyerapan (absorption). Proses sebaliknya
dimana sebahagian dari tenaga didalam jirim itu ditukarkan kepada tenaga sinaran,
maka ia dinamakan pemancaran (emission). Sebahagian dari sinaran yang melalui
jirim, selain dari diserapi, boleh juga diserakkan atau dibalikkan, atau dipancarkan
semula pada λ yang sama atau yang berbeza apabila keluar dari sampel.

Penyerakan (scattering) cahaya adalah merupakan asas fizikal beberapa


kaedah percubaan yang digunakan bagi mengkaji ciri-ciri makromolekul. Sebelum
teknik elektroforesis berkembang, teknik penyerakan cahaya ini digunakan bagi
mengukur berat molekul makromolekul. Teknik-teknik seperti defraksi sinar-X
(kristal dan larutan), mikroskopi elektron, penyerakan cahaya laser dan penyerakan
neutron yang bagitu luas digunakan pada masa ini, semuanya berlandaskan proses
penyerakan cahaya ini.

Seperti yang telah dinyatakan diatas, pemindahan tenaga dari satu alur
tenaga atau foton kepada satu jirim atau molekul dinamakan penyerapan. Bagi
membolehkan sesuatu foton itu diserap, tenaganya mestilah serupa dengan
perbezaan tenaga diantara dua aras tenaga molekul tersebut.

Molekul mempunyai satu set aras tenaga yang dikuantumkan (quantized


energy level) seperti tang ditunjukkan didalam Rajah 2.
Keadaan Teruja, S 1

Keadaan Asas, G

Tenaga

Jarak Diantara Atom Didalam Molekul

Rajah 2. Gambarajah aras tenaga menunjukkan keadaan asas, G, dan keadaan teruja pertama, S1.

Rajah kecil menunjukkan aras tenaga elektron.

Walaupun beberapa keadaan mungkin berlaku, cuma dua keadaan elektron sahaja
ditunjukkan, iaitu keadaan asas, G, dan keadaan teruja pertama, S1. Kedua-dua
keadaan ini berbeza dari segi taburan elektron valensinya. Apabila satu elektron
diuja dari satu orbit keadaan asas di G ke orbit yang lebih tinggi tenaganya di S1,
maka dikatakan satu transisi elektron berlaku. Transisi yang memerlukan tenaga
paling tinggi adalah pengujaan elektron * seperti pada etana λ mak =135 nm (Rajah
3). Misalnya pada CH4 dimana pengujaan terjadi pada = 125nm (sinar untra-
lembayung vakum). Transisi n(atau p) * juga memerlukan tenaga yang tinggi (seperti
pada H2O, λ mak = 167 nm), * (misalnya 1,3 butadion, λ mak 217 nm) agak rendah
(sinar ultra-lembayung) dan yang paling rendah adalah transisi n * (kumpulan
karbonil, 275 – 295 nm dan akrolein, 315 nm). Tenaga yang ada bersama-sama
cahaya ultra-lembayung dan tampak adalah mencukupi bagi menguja molekul-molekul
tersebut dari satu keadaan elektron ke keadaan yang lain, yakni untuk
menggerakkan elektron dari satu orbit ke orbit yang lain.
Dalam keadaan yang lebih kompleks, analit yang hendak dianalisis tidak menyerap
radiasi dan perlu diubahsuai secara kimia sebelum pengukuran daya serapan
dilakukan.

σ* Anti-ikatan

π * Anti-ikatan

Tenaga
n Bukan-
ikatan

π Ikatan

σ Ikatan

Rajah 3. Aras tenaga molekul elektronik

Satu spektrum UV-VIS didapatkan dengan mengukur cahaya yang diserapkan


oleh satu sampel sebagai fungsi jarak gelombang. Oleh kerana cuma
bungkusan/paket diskret tenaga (jarak gelombang tertentu) yang diserap oleh
molekul didalam sampel itu, secara teorinya spektrum yang dihasilkan hendaklah
mengandungi garis diskret yang tajam. Walau bagaimanapun, oleh kerana banyaknya
aras getaran bagi setiap aras tenaga elektron, ini menambahkan kemungkinan
bilangan transisi. Sebagai hasilnya ialah beberapa garis spektra, yang secara
bersama membentuk spektum puncak yang lebar. Spektrum penyerapan boleh
digunakan untuk mengenalpasti sesuatu molekul kerana λ penyerapan bergantung
kepada kehadiran kumpulan berfungsi atau sususan atom didalam sampel itu.
Sebagai contohnya penyerapan oksihemoglobin seperti yang ditunjukkan didalam
Rajah 4 yang disebabkan oleh kehadiran moieti porfirin. Perhatikan bahawa
spektum tersebut mempunyai beberapa puncak di beberapa jarak gelombang,
dimana penyerapan mencapai satu maksimum (415, 542, dan 577 nm).

Penyerapan

400 500 600

Panjang Gelombang (nm)

Rajah 4. Spektrum penyerapan tampak hemoglobin.

Ikatan-ikatan atau kumpulan kovalen tak tepu dalam molekul yang


menyebabkan molekul itu bewarnaatau berlakunya penyerapan elektronik dinamakan
kumpulan kromofor, misalnya C=C, C=O, -NO2, -CHO, -COOH, -N=O dan
sebagainya. Ada kumpulan lain molekul yang tidak menyebabkan timbulnya warna,
tetapi apabila terikat pada kromofor dapat mengubah kedua-dua panjang gelombang
dan keamatan penyerapan maksimum kumpulan kromofor tadi. Kumpulan-kumpulan
ini dinamakan kumpulan auksokrom (auxochrome) , iaitu yang mengandungi elektron
n yang dapat diuja menjadi σ * dan menyerap pada λ dibawah 220 nm. Sebagai
contohnya yang mengandungi OH, NH2 dan Cl. Jika suatu auksokrom dan suatu
kromofor berada pada satu molekul, penyerapan sinar oleh kromofor akan berpindah
ke λ yang lebih panjang dan keamatannya menaik. Misalnya benzena mempunyai λ
mak 255 nm, sedangkan anilin (aminobenzena) 280 nm dengan E mak .masing-masing
230 dan 1430 kal mol –1. Perpindahan penyerapan ke arah λ yang lebih panjang
yang disebabkan oleh kesan gantian (substitution) atau pelarut dinamakan
perpindahan batokromik (bathochromic shift) atau perpindahan merah, dan jika
sebaliknya dinamakan hipsokromik (hypsochromic) atau perpindahan biru. Manakala
peningkatan keamatan penyerapan dinamakan kesan hiperkromik (hyperchromic
effect), manakala sebaliknya dinamakan kesan hipokromik (hypochromic effect).
Misalnya perubahan yang berlaku apabila larutan antosianin ditambahkan beberapa
titik larutan beralkohol AlCl3. Kesemuanya ini dirumuskan didalam Rajah 5.

hiperkromik

Serapan asal

hipsokromik batokromik

hipokromik
λ

Rajah 5. Berbagai corak perubahan serapan maksimum dan λ maksimum


disebabkan perubahan bentuk molekul dalam larutan.

Transmitans (Tramsmittance)

Rajah 6 menggambarkan satu alur (beam) pancaran selari sebelum dan


selepas ia melalui satu lapisan larutan yang mempunyai ketebalan b cm dan spesis
menyerap yang mempunyai kepekatan c. Sebagai hasil dari interaksi diantara foton
dengan zarah penyerap, maka kuasa alur cahaya itu susut dari Po ke P. Maka
transmitans T larutan itu kemudiannya menjadi pecahan dari pancaran yang
ditramsmisikan oleh larutan tersebut.

P
T = ...........................................(Persamaan ii)
Po

Transmitans selalunya dinyatan sebagai peratusan atau:-

P
%T = X 100 ..................................(Persamaan
iii)
Po

Walau bagaimanapun, T dan T% tidak linear terhadap kepekatan. Oleh itu A (daya
serap) digunakan.
Rajah 6. Penyusutan alur sinaran oleh satu larutan menyerap

Pertalian diatas dikenalijuga dengan Hukum Lambert-Beer. Penyerapan cahaya


lebih mengikuti hukum eksponen dari linear.

Walau bagaimanapun, dalam kerja-kerja harian terdapat kelencongan (deviation)


daripada Hukum Lambert-Beer akibat daripada:
Kepekatan analit yang tinggi (> 10 mM) memberi kesan dari segi kimianya
Asosiasi-disosiasi berbalik molekul analit atau pengionan asid lemah dalam
larutan tanpa penimbal
Penghadan (limitation) peralatan – radiasi polikromatik berbanding
monokromatik.

Daya Serap (Absorbance)

Po
A = - log10 T = log ....................................(Persamaan iv)
P
Dalam makmal, daya serap sebenar yang diukur adalah:

A = log Ppelarut/Plarutan analit ≈ log Po/P

Dimana P = kuasa radiasi (radiation power).

Kedayaserapan dan Kedayaserapan Molar (Absorptivity and Molar Absorptivity)

Seperti yang ditunjukkan, daya serap adalah berkadar terus dengan panjang
lintasan b melalui larutan, dan kepekatan spesis menyerap c. Hubungan ini
diberikan oleh :-

A = abc ..................................................(Persamaan v)

dimana a ialah konstan kekadaran (proportionality constant) yang dipanggil


kedayaserapan. Besarnya a adalah jelas bergantung kepada unit yang digunakan
untuk b dan c. Selalunya b diberi dalam centimeter dan c dalam gram per liter.
Maka daya serap menjadi L g-1 cm-1.

Apabila kepekatan didalam Persamaan v dinyatakan dalam mol per liter dan
panjang sel/kuvet dalam centimeter, maka kedayaserapan itu dipanggil
kedayaserapan molar dan diberikan dengan simbol . Jadi, apabila b dalam
centimeter dan c dalam mol per liter, maka:-

A = bc .........................................................(Persamaan vi)

dimana mempunyai unit L mol-1 cm-1.

Istilah biasa yang digunakan spektroskopi penyerapan dirumuskan didalam


Jadual 1.
Contoh 1.

Daya serap (abrorbance) A, larutan 5 X 10-4 M asid amino tirosin pada jarak
gelombang 280 nm, ialah 0.75. Panjang lintasan kuvet ialah 1 cm. Berapakah
kedayaserapan molar asid amino itu.

A = bc
b = 1 cm
c = 5 x 10-4 M
0.75
ε =
(1 cm) (5 x 10-4 mole/liter)

liter
= 1500 = 1500 M-1 cm-1
mole x cm

Jadual 1. Istilah dan simbol penting yang digunakan didalam pengukuran


penyerapan.

Istilah dan Simbol Definasi Nama dan Simbol


Alternatif
Tenaga sinaran, P , Po Tenaga yang disinarkan Keamatan sinaran, I ,
(dalam Joule) yang Io
memberi kesan keatas
kawasan 1 m2 alat
pengesan setiap saat.

Po
Daya serap log
P
(Absorbance), A Optical density, D;
P Extention, E
Po
Transmitans, T
Transmisi , T
-
Panjang lintasan (path)
sinaran dalam cm, b A l, d
bc
Kedayaserapan
(Absorptivity), a Extinction coefficient,
A
(dimana c = mol k
bc
per
Kedayaserapan molar
liter)
(Molar absorptivity)
Molar extinction
coefficient

Contoh 2.

Potasium kromat (K2CrO4) didalam larutan bes menunjukkan penyerapan maksimum


-5
pada 372 nm. Satu larutan bes yang mengandungi 3.0 x 10 M K2CrO4 memancarkan
71..6% sinaran tuju pada 372 nm apabila diletakkan didalam satu sel 1.0 cm.

a) Berapakah daya serap (A) larutan itu?


b) Berapakah kedayaserapan molar () larutan potasium kromat pada 372
nm?
c) Berapakah peratus transmitans sekiranya ketebalan sel ialah 3.0 cm?

Jawapan:

a) Sekiranya % T = 71.6; maka T = 0.716


1
Dari Hukum Lambert-Beer, log =A
T
1
Oleh itu, A = log = log 1.396 = 0.145
0.716

-5
b) A = bc atau 0.145 = (1.0 cm)(3.0 x 10 mole/liter)
3
maka, = 4.83 x 10 liter/mol-cm

1
c) log = bc
T
1 3 -5
log = (4.83 x 10 liter/mol-cm)(3.0 cm)(3.0 x 10 mol/liter)
T

1
log = 0.435
T
-0.435 0.565 -1
oleh itu, T = 10 = 10 x 10 = 0.367
dan % T = 36.7%

PENENTUAN PROTEIN

Kebanyakan protein mempunyai penyerapan maksimum yang jelas pada 280


nm, yang disebabkan terutamanya oleh kehadiran asid amino tirosin, triptofan dan
fenilalanin. Daya serap pada 280 nm boleh digunakan bagi mengukur aras protein
0.1 - 0.5 mg/ml tanpa kehadiran bahan-bahan gangguan. Walau bagaimanapun
persediaan yang cuma tulin sebahagian mungking mengandungi asid nukleik yang
mempunyai penyerapan maksimum pada 260 nm. Persamaan bagi mengukur
kepekatan protein dengan kehadiran asid nukleik diberikan seperti berikut:-

1cm 1cm
[protein] mg/ml = 1.55 A - 0.76 A ......................... (Persamaan vii)
280 260

Persamaan diatas didapatkan dari enzim enolase (A280/A260 = 1.75) dengan


kehadiran asid nukleik dari yis (A280/A260 = 0.49), jadi oleh yang demikian tidaklah
berapa tepat untuk lain-lain protein dan asid nukleik.

Contoh 3.

Daya serap larutan 1% (berat/isipadu) enzim tirosinase, didalam kuvet 1 cm


pada 280nm ialah 24.9. Berapakah kepekatan larutan tirosinase yang mempunyai
A280 sebanyak 0.25?
Oleh kerana kedayaserapan, a % didalam kedua-dua larutan adalah sama,
maka kepekatan boleh dikira menggunakan nisbah terus:-

A A
std = x
C C
std x

dimana:-
Astd = Daya serap larutan piawai 1% = 24.9

Cstd = Kepekatan larutan piawai = 1% (1g/L)

Ax = daya serap larutan tak diketahui

Cx = kepekatan larutan tak diketahui

24.9 0.25
=
1% C
x
Cx = 0.01% = 0.01g/L = 0.1 mg/mL

INSTRUMENTASI
Alat yang digunakan bagi mengukur daya serapan dinamakan
spektrofotometer. Alat ini mengeluarkan cahaya pada jarak gelombang yang dipilih
terlebih dahulu, lalu dipancarkan melalui sampel (selalunya dilarutkan didalan satu
pelarut dan diletakkan didalam kuvet), dan keamatan cahaya yang
ditransmisikan/diserap sampel tersebut diukur.

Terdapat dua jenis spektrofotometer didalam pasaran, iaitu


spektrofotometer beralur tunggal (single beam) dan spektrofotometer beralur
dua (double beam). Rajah 7 adalah contoh spektrofotometer berjalur dua. Secara
umumnya, sesebuah spektrofotometer terdiri dari komponen utama iaitu sumber
cahaya, monokromator (termasuklah beberapa penapis, celah (slits) dan cermin),
kebuk sampel, alat pengesan, dan sebuah meter atau perakam (Rajah 8).

Meter atau 0.70

Monokromato perakam
r

Sistem Kebuk
Sumber cahaya
Celah optik sampel
Rajah 8. Gambarajah menunjukkan komponen biasa
Tiub
didalam
foto
spektrofotometer alur-tunggal (single
beam)
Sumber Cahaya

Bergantung kepada punca cahaya, maka sesebuah spektrofotometer itu boleh


mengukur daya serap pada kawasan ultra-lembayung, di mana lampu hidrogen atau
deutrium tekanan tinggi digunakan; atau dikawasan tampak yang menggunakan lampu
tungsten-halogen. Yang pertama itu mengeluarkan sinaran pada julat 200 - 340 nm,
manakala yang kedua itu pada julat 340 - 800 nm. Alat yang mempunyai kedua-dua
jenis lampu mempunyai kelenturan yang lebih baik dan boleh digunakan untuk kajian
kebanyakan molekul yang mempunyai kepentingan biologi.

Monokromator

Kedua-dua lampu diatas mengeluarkan sinaran pada kesemua panjang gelombang


didalam julatnya secara selanjar. Justeru itu, sesebuah spektrofotometer perlulah
mempunyai sebuah sistem optik yang dapat memilih cahaya monokromatik (cahaya
yang mempunyai panjang gelombang tertentu). Alat modern menggunakan prisma,
atau selalunya menggunakan parutan belauan (diffraction grating) untuk
menghasilkan cahaya pada panjang gelombang tertentu. Perlu juga diingatkan disini
bahawa cahaya yang keluar dari monokromator tidaklah terdiri dari hanya satu
panjang gelombang, tetapi sebaliknya diperkaya dengan panjang gelombang
tersebut. Ini bermakna, kebanyakan cahaya adalah dari panjang gelombang yang
tunggal, tetapi yang pada panjang gelombang lebih pendek atau lebih panjang dari
itu juga ada.

Sebelum cahaya monokromatik itu sampai kepada sampel, ia akan melalui satu
siri celah (slits), kanta, penapis dan cermin. Sistem optik ini memekatkan cahaya,
meningkatkan ketulinan spektra dan menumpukan ia kearah sampel. Cahaya yang
melintasi dari monokromator ke sampel akan menemui satu pintu atau celah.
Lebarnya celah ini menentukan kedua-dua keamatan cahaya yang mengenai sampel
dan ketulinan spektra cahaya tersebut. Dengan menyempitkan celah, ketulinan
spektra akan meningkat, tetapi banyaknya cahaya yang mengenai sampel akan
berkurangan. Dalam hal ini kecekapan atau kepekaan alat pengesan akan menjadi
faktor penghad. Justeru itu lebarnya celah perlu ditentukan bagi mendapatkan
kesaimbangan diantara ketulinan spektra dengan kepekaan pengesan.
Kebuk Sampel

Cahaya monokromatik yang telah diproses itu kemudiannya dihalakan kepada


kebuk sampel yang boleh menempatkan beberapa jenis pemegang sel. Sampel
selalunya adalah dalam bentuk larutan. Sampel diisikan kedalam tiub atau kuvet
yang diperbuat dari kaca, kuarza, atau lain-lain bahan lutsinar. Kuvet kaca agak
murah, tetapi disebabkan ia menyerap cahaya UV, ia hanya boleh digunakan untuk
panjang gelombang melebihi 340 nm. Kuvet kuarza atau silika terlakur boleh
digunakan disepanjang kawasan cahaya UV dan tampak (~200 - 800 nm). Kuvet
pakai buang sekarang ini banyak terdapat dipasaran diperbuat dari polimetakrilat
(280 - 800nm) dan polistiren (350 - 800nm).

Spektrofotometer yang kurang mahal terdiri dari alat beralur-tunggal


(single-beam) yang membolehkan satu kuvet dimasukkan kedalam pemegang sel pada
satu masa. Alat yang lebih canggih adalah beralur-dua (double-beam) yang boleh
memuatkan dua kuvet, yang satu mengandungi sampek terlarut didalam suatu
pelarut (kedudukan sampel) dan yang satu lagi mengandungi pelarut tulin (kedududan
rujukan).

Pengesan

Keamatan cahaya yang melintasi sampel kajian adalah bergantung kepada


banyaknya cahaya yang diserap oleh sampel tersebut. Keamatan diukur oleh
pengesan peka-cahaya, selalunya merupakan sebuah tiub fotogandaan
(photomultiplier tube, PMT). PMT mengesan jumlah tenaga cahaya yang kecil,
menguatkannya melalui lata elektron (cascade of electrons) yang dipercepat oleh
dinod (dynode), dan menukarkannya menjadi isyarat elektrik yang boleh dimasukkan
kedalam sebuah meter atau perakam.

Ditahun kebelakangan ini satu teknologi baharu telah diperkenalkan bagi


mempercepatkan pengukuran spektrofotometer. Pengesan baharu itu dinamakan
fotodiod arai (photodiode arrays). Fotodiod terdiri dari hablur silikon yang peka
kepada cahaya dalam julat panjang gelombang 170 - 1100 nm. Apabila diod
menyerap foton, arus dihasilkan didalan fotodiod itu yang berkadaran dengan
bilangan foton. Dengan menggunakan teknologi pengesan ini, pengibasan penuh
spektra dari 190 ke 820 nm boleh dilakukan dalam masa 1/10 saat.

Meter dan Perakam

Alat yang kurang mahal boleh memberikan bacaan daya serapan dan /atau
transmitans secara terus dalam bentuk analog atau digital. Alat ini sesuai untuk
pengukuran pada panjang gelombang tunggal. Sekiranga pengimbasan (scanning)
daya serapan lwn. panjang gelombang (A lwn. λ ) diperlukan, maka sebuah perakam
(recorder) perlulah dipasang.

Pada masa ini kebanyakan spektrofotometer telah dilengkapi dengan


komputer berserta perisian yang canggih bagi memudahkan pengaturcaraan
parameter pengukuran, terutama untuk tujuan kajian kinetik.

Rujukan

Boyer R. F. (1993). Modern Experimental Biochemistry. 2nd. Ed. The Benjamin


Cummings Publishing Co. Inc., California.