crudas
mediante la aplicacin de soluciones de lavado que contienen enterocina AS- 48
solo y en combinacin con otros antimicrobianos
Antonio Cobo Molinos a , Hikmate Abriouel a , Rosario Lucas Lopez a , Nabil Ben Omar a , Eva Valdivia b,c, Antonio Galvez a,
a Area de Microbiologa, Departamento de Ciencias de la Salud, Facultad de Ciencias Experimentales, Universidad de Jaen, 23071 Jaen, Spain b
Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain c Instituto de Biotecnologa, Facultad de Ciencias,
Universidad de Granada, 18071 Granada, Spain
resumen
Enterocina AS-48 es un pptido antimicrobiano de amplio espectro cclico producido por Enterococcus faecalis. En el
presente estudio, la bacteriocina se ensay solo y en combinacin con otros antimicrobianos para la descontaminacin
de Bacillus inoculado en la alfalfa, brotes de soja y esprragos verdes. El lavado con enterocina AS-48 soluciones
reduce el recuento de clulas viables de Bacillus cereus y Bacillus weihenstephanensis por 1.0-1.5 y 1.5-2.38 unidades
de registro de derecho despus de la aplicacin del tratamiento, respectivamente. En ambos casos, el bacteriocina fue
eficaz en la reduccin de la poblacin viable que queda por debajo de niveles de deteccin durante su posterior
almacenamiento de las muestras a los 6 C, pero no pudo evitar que rebrote en las muestras almacenadas a 15 o 22
C.
La aplicacin de tratamientos de lavado que contienen enterocina AS-48 en combinacin con varios otros
antimicrobianos y desinfectantes (cinmico y los cidos, carvacrol, cido polifosfrico hidrocinmico,cido peractico,
cloruro de hexadecilpiridinio y el hipoclorito de sodio) aumentar considerablemente la efectos bactericidas. Las
combinaciones de AS-48 y el hipoclorito de sodio, cido peractico o cloruro de hexadecilpiridinio proporciona los
mejores resultados. Despus de la aplicacin de los tratamientos combinados en los brotes de alfalfa contaminados
con B. cereus o B. weihenstephanensis, bacilos viables no fueron detectado o mantenido en concentraciones muy
bajas en las muestras tratadas durante un periodo de almacenamiento de 1 semana en 15 C. Inhibicin de B. cereus
por in situ bacteriocina producida fue probado por cocultivo con el AS-48 cepa productora E. faecalis A-48-32 inocula
en brotes de soja. Strain A-48-32 fue capaz de crecer y producir bacteriocinas sobre brotes tanto en 15 y 22 C. En 15
C, el crecimiento de B. cereus era completamente inhibido en los cocultivos, mientras que un efecto mucho ms
limitado se observ a 22 C. Los resultados obtenido para tratamientos de lavado son muy alentadores para la
aplicacin de enterocina AS-48 en el descontaminacin de las coles. Aplicacin de tratamientos de lavado que contiene
AS-48 el nico que puede servir para reducir el recuento de clulas viables de bacilos en las muestras almacenadas en
refrigeracin, mientras que la aplicacin de combinar tratamientos deben ser recomendados para evitar la proliferacin
de
los
bacilos
supervivientes
bajo
temperatura
abuse
condiciones.
las frutas y verduras se ha propuesto como un medida de seguridad (Beuchat et al., 2004).Las bacteriocinas de
bacterias de cido lctico (LAB) han sido rara vez utilizado para la descontaminacin de productos frescos (revisado
por Ga'lvez et al., 2008). La nisina y pediocina individualmente o en combinacin con agentes antimicrobianos (lactato
de sodio, sorbato de potasio, cido ftico y cido ctrico) se probaron como sea posible desinfectante tratamientos para
la reduccin de la poblacin de Listeria monocytogenes el repollo, el brcoli y las coles de frijol mungo (Bari et al.,
2005).
Soluciones de lavado que consta de bacteriocinas LAB producen en un extracto de lechuga (nisina Z, coagulina y
nisina: cctel coagulina) reduccin de los recuentos de clulas viables de L. monocytogenes en recin cortada lechuga
iceberg almacena en bolsas de plstico microperforados, pero lo hizo no impide un mayor crecimiento de los
sobrevivientes durante la refrigeracin almacenamiento (Allende et al., 2007). Enterocina AS-48 es un pptido cclico
con un amplio espectro antibacteriano (Ga'lvez et al, 1986., 1989;Maqueda et al., 2004). Esta bacteriocina ha sido
purificado en una escala semi-preparativa (Abriouel et al., 2003), y ahora est siendo probado como conservante
natural
en
diferentes
sistemas
alimentarios
(Mun~oz
et al, 2004., 2007; . Ananou et al, 2005a, b; Grande et al., 2005,2006, 2007a, b; Lucas et al., 2006). Enterocina AS-48
puede ser una bacteriocina interesante para la descontaminacin de verduras crudas. En jugo de lechuga, aadido
enterocina AS-48 provoc una fuerte inhibicin de la Staphylococcus aureus y completamente inactivadas L.
monocytogenes y B. cereus (Grande et al., 2005). Enterocina AS-48 era probado previamente en tratamientos de
lavado para la descontaminacin de semilla brota contra L. monocytogenes (Cobo Molinos et al., 2005).La actividad
antilisterial de AS-48 se mejor en gran medida por varios compuestos antimicrobianos, la reduccin de la poblacin de
viabilidad listeria debajo de los lmites de deteccin de los brotes tratados despus el tratamiento y la prevencin de
rebrote de las listeria durante el almacenamiento de las muestras tratadas (Cobo Molinos et al., 2005).Resultados de
nuestros
estudios
anteriores
indican
que
la
eficacia
de
AS48
tratamientos depende en gran medida de las bacterias diana y la comida sistema. Mientras aadido bacteriocina
completamente inactivados B. cereus en los alimentos a base de arroz ( Grande et al. , 2006 ) , bacteriocina superior
Se requieren concentraciones para controlar poblaciones mixtas de bacilos en pure'es ( Grande et al. , 2007b ) . En los
tratamientos de lavado, la concentracin de bacteriocina en muestras disminuir despus del tratamiento, limitar la
proteccin de las muestras durante el almacenamiento. los objetivo del presente estudio fue determinar la eficacia de
AS- 48 aplicado en tratamientos de lavado contra dos toxicgeno especies del grupo B. cereus solo y en combinacin
con otra antimicrobianos en bsqueda de efectos sinrgicos contra los bacilos .
2. Materiales y mtodos
2.1. Cepas y condiciones de cultivo bacteriano
Enterococcus faecalis A-48-32 (Martnez Bueno et al., 1990) era faecalis usadas para la produccin de enterocina AS48, y E. S-47 de nuestra coleccin se utiliz para la determinacin de la norma actividad bacteriocina. B. cereus LWL1
es un psicotrpico y cepa enterotoxignica (Dufrenne et al., 1995), suministrado amablemente por Dr. F.M. van
Leusden (Laboratorio Microbiolgico para la Salud Proteccin, Natl. Inst. Publ. Salud y Environ., Pases Bajos).B.
CECT weihenstephanensis 5894 se obtuvo del espaol coleccin de cultivos tipo (CECT). Todas las cepas se
cultivaron rutinariamente en infusin de cerebro-corazn (BHI, Scharlab, Barcelona, Espaa) caldo a 37 1C, y se
almacen a 4 1C en tubos inclinados de agar BHI-.
2.2. Preparacin de bacteriocina y qumicas conservantes
Enterocina AS-48 se recuper a partir de caldos de cultivo de la cepa productora E. faecalis A-48-32 en CMG-medio
por cationes cromatografa de intercambio como se describe en otro lugar (Abriouel et al.,2,003). Concentrados de
bacteriocina se filtraron a travs 0,22 mm
filtros de baja unin a protenas de tamao de poro (Millex GV; Millipore Corporation, Belford, MA, EE.UU.) bajo
condiciones estriles y probado para la actividad bacteriocina contra la cepa indicadora E. faecalis S-47por el mtodo
de difusin en agar bien (Abriouel et al., 2003).
Soluciones de inmersin se prepararon por dilucin de bacteriocina concentrados (500 mg / ml) en agua destilada
estril o en acuosa soluciones de los conservantes qumicos a ensayar en el caso de tratamientos combinados.
El cido lctico, lactato sdico, trimetafosfato trisdico,cido polifosfrico, cloruro de hexadecilpiridinio, n-propilo phidroxibenzoato de metilo y p-hydoxybenzoic esther metlico del cido fueron adquiridos de Sigma (Madrid, Espaa). El
cido cinmico, cido hidrocinmico, carvacrol y cido peractico eran de Fluka(Madrid). El hipoclorito de sodio se
concentr un comercial leja (ConejoTM, Henkel Ibe' rica, Barcelona, Espaa). El comercial
soluciones o soluciones madre concentradas preparadas por disolviendo los compuestos slidos en agua destilada
estril o en etanol se diluyeron al menos 20 veces en agua destilada estril en Para preparar las soluciones de
inmersin que se utilizar para la tratamientos de lavado. Todas las soluciones se prepararon fresca antes de su uso.
2.3.
Ensayo
de
enterocina
AS-48
en
los
vegetales
contaminados
artificialmente
con
bacilos
El efecto de la inmersin en soluciones que contienen enterocina AS-48 (25 mg / ml, concentracin final) en la
supervivencia y el crecimiento de B. cereus LWL1 inocul en la alfalfa fresca, brotes de soja y esprragos verdes, as
como B. weihenstephanensis CECT 5894 en brotes de soja se investig a temperaturas de almacenamiento de 6, 15 y
22 1C. Los cultivos de bacilos crecer durante la noche en caldo BHI a 37 1C se diluyeron 1: 100 en solucin salina
estril a una densidad final de clulas de aprox. 5.5 log CFU / ml. Esta suspensin de clulas de Bacillus se utiliz para
contaminan artificialmente las verduras estn probando. Verde fresco esprragos (variedad Mary Washington, 5-10 mm
de dimetro), soja coles (Alleuras Industrias, Madrid) y brotes de alfalfa (Productos Fanya, Madrid) fueron adquiridos de
los supermercados locales. El esprrago se cortaron en piezas de 2 cm antes del tratamiento solicitud. Las muestras
de los vegetales estn probando (2,5 g cada uno) fueron depositados en el interior de tubos de 50 ml de polipropileno
tapados estriles (Sterilin, Piedra, Reino Unido) y se sumergi durante 5 minutos en 5 ml destilada estril de agua
(controles
negativos)
o
en
5
ml
de
suspensin
de
clulas
de
Bacillus
en
6,
15 y 22 1C. A continuacin, se depositan sobre un papel de filtro estril para drenar el exceso de agua. Las muestras
contaminadas artificialmente eran Despus de los tratamientos de inmersin, el exceso de solucin de inmersin era
quitan que el anterior, y las muestras fueron almacenadas en estril coron 50 ml tubos de ensayo de polipropileno
colocados en almacenamiento refrigerado o cmaras de incubacin (Memmert, Schwabach, Alemania) a deseada
temperaturas de incubacin (6, 15, 22 1C) para diferentes perodos de tiempo. En cada paso, las muestras (2,5 g) se
mezclaron
con
5
ml
de
solucin
salina
estril
solucin (0,85% de NaCl) y golpeado durante 3 min en un Stomacher 80 (Biomaster) antes de que se diluyeron en
serie en solucin salina estril solucin y se extendi por triplicado en placas de agar B. cereus (Scharlab, Barcelona)
suplementado con yema de huevo y polimixina B (Panreac, Barcelona). Las placas se incubaron a 37 1C durante 48 h,
y el nmero de colonias que muestra las caractersticas tpicas de B. cereus eran determinado con el fin de calcular el
recuento de clulas viables. Tratamientos combinados de enterocina AS-48 y conservantes qumicos se llevaron a cabo
en
Bacillus
contaminada
artificialmente
muestras de alimentos a temperatura ambiente esencialmente como se describe anteriormente, mediante el uso de
soluciones de inmersin que contienen enterocina AS-48 (25 mg / ml concentracin final) y / o los compuestos
qumicos
correspondientes
(a las concentraciones finales indicadas en el epgrafe anterior). Viable recuentos de clulas de bacilos se determinaron
como se ha descrito anteriormente siguiente tratamiento de inmersin (tiempo cero) y despus de 24 h de incubacin a
22 1C. Confirmacin de B. cereus se realiz mediante amplificacin por PCR de la SSPE gen con cebadores
especficos sspE1-F (50-GAGAAAGATGAGTAAAAAACAACAA-30) Y sspE1-R (50-CATTTGTGCTTTGAATGCTAG)
Como se describepor Kim et al. (2004), seguido por la deteccin de la 71-bp amplicn mediante electroforesis en gel
de agarosa.
2.4.
Experimentos
de
cocultivo
Las clulas de un cultivo de una noche (cultivaron a 37 1C en caldo BHI) de la cepa enterocina AS-48 productor E.
faecalis A-48-32 eran recuperado por centrifugacin (5000 g durante 10 min a temperatura ambiente) y se
resuspendieron en solucin salina estril a la inicial volumen de cultivo. Esta suspensin se aadi a la bacilos
suspensiones de contaminacin para obtener una suspensin de co-cultivo con una proporcin aproximadaenterococos a los bacilos de 100: 1. Vegetal muestras (2,5 g cada una) se sumergieron en el co-cultivo suspensin
durante
5
min
a
temperatura
ambiente
como
anteriormente
y
el
exceso
la
suspensin
se
elimin
como
arriba.
A
intervalos
deseados
de
de incubacin a la temperatura de ensayo (15 o 22 1C), las muestras se chapado para los recuentos de clulas viables
de bacilos y enterococos. porlos bacilos, B. cereus agar fue suplementado con ampicilina (80 mg / ml, concentracin
final) con el fin de inhibir el crecimiento de enterococos. Los bacilos se confirm mediante amplificacin por PCR como
se
descrito arriba. Recuentos de clulas viables de enterococos eran tambin llevado a cabo, mediante la difusin de las
muestras por triplicado en kanamicina esculina azida de agar (KAA, Scharlab), seguido de 48 h de incubacin a 37 1C.
La confirmacin de la AS-48 cepas productoras de placas KAA hecho por colonias de prueba aislados al azar para
bacteriocina
la produccin por el lugar en un mtodo csped con E. faecalis S-47 como la cepa indicador sensible y A-48-32 cepa
como el AS-48- cepa indicadora resistentes. Las colonias que mostraban inhibicin frente cepa S-47, pero no lograron
inhibir
la
cepa
A-48
a
32
se
consideraron
ser
AS-48
productores.
La actividad bacteriocina en las muestras se determin mediante la prueba 100 ml de la suspensin vegetal golpeado
por
el
agar
pocillosmtodo
de
difusin.
2.5.
Anlisis
estadstico
Los datos promedio de las desviaciones trials7standard duplicados se determinaron con el programa Excel (Microsoft
Corp., EE.UU.). En Para determinar la significacin estadstica de los datos, una prueba t se llev a cabo en el intervalo
de
confianza
del
95%
con
Statgraphics
Plus versin 5.1 (Statistical Graphics Corp., EE.UU.). El significado de los tratamientos combinados se determin por
comparacin de los datos desde el mismo tiempo de incubacin.
3. Resultados
3.1. Efecto de los tratamientos de lavado que contengan enterocina AS-48 sola
El efecto de los tratamientos de lavado con soluciones que contengan 25 mg AS-48 se estudi / ml de B. cereus LWL1
en la soja, alfalfa brotes y esprragos verdes (Fig. 1) almacenados a 6, 15 y 22 1C. Mejor Se obtuvieron resultados
para las muestras refrigerados a 6 1C. En todos los casos,estadsticamente significativas (Po0.05) reducciones de los
recuentos de clulas viables de 1,06, 1,3 y 1,59 unidades de registro se obtuvieron despus de lavar los tratamientos, y
la poblacin viable restante se reduce por debajo niveles de deteccin despus de das 1-3 de almacenamiento (Fig.
1A, D y G).Por el contrario, las reducciones de los recuentos de clulas viables obtiene despus de los tratamientos a
los 15 o 22 1C no fueron estadsticamente significativas para los tres tipos de alimentos probados, y las clulas viables
restantes se multiplicaron como los controles no tratados, al menos para el primer da de almacenamiento. Durante
almacenamiento prolongado, los recuentos de clulas viables de las muestras tratadas eran significativamente menor
que los controles no tratados nicamente para la alfalfa coles y esprragos en el da 3 y de brotes de soja despus de
3 dasde almacenamiento.
Lavar los tratamientos con AS-48 (25 mg / ml) tambin se aplica a B. weihenstephanensis CECT 5894 inoculado en
brotes de soja (Figura 2). El tratamiento redujo significativamente bacteriocina de clulas viables poblacin multiplica
durante el almacenamiento a temperaturas ms altas, especialmente en 15 1C y, en menor medida, tambin en 22 1C
(Fig. 2B y C).
3.2. Efecto de los tratamientos de lavado que contengan enterocina AS-48 en combinacin con otros
compuestos antimicrobianos
Enterocina AS-48 (25 mg / ml) fue probado en B. cereus encombinacin con varios otros compuestos antimicrobianos
en brotes de alfalfa almacenados a 15 1C. A esta concentracin, el bacteriocina sola no redujo significativamente el
nmero de viable B. cereus despus del tratamiento o durante las siguientes 24 h de almacenamiento (Fig. 3).
Muchos de los compuestos antimicrobianos probados individualmente reduccin del nmero de clulas viables de
manera significativa (Po0.05) en comparacin con los controles no tratados, ya sea en el tiempo 0 o despus de 24 h
de almacenamiento o ambos (Fig. 3). La comparacin de los recuentos de clulas viables obtenido para cada
conservante qumico y la combinacin conservante bacteriocina-qumico indic que el bactericida efecto de los
tratamientos se mejor significativamente por la adicin de AS-48 (Po0.05) para cinmico y hidrocinmico cidos,
carvacrol, cido polifosfrico (al 0,1% y 0,5%), cido peractico, hexadecilpiridinio cloruro e hipoclorito de sodio, tanto
en 0 y24 h de almacenamiento, y tambin para trimetafosfato trisdico a las 24 h.Curiosamente, algunos de los
tratamientos combinados (con sodio hipoclorito, cido peractico, cido polifosfrico y hidrocinmico cido) redujo los
recuentos de clulas viables de B. cereus a continuacin niveles de deteccin.
3.3. Preservacin de brotes despus del tratamiento
alimentos (revisado por Foulquie' Moreno et al., 2006). Puesto que ahora hay una preocupacin de que los enterococos
pueden estar involucrados en la propagacin de la resistencia a los antibiticos y rasgos de virulencia en los alimentos,
las cepas utilizadas para aplicaciones alimentarias debe ser desprovisto de tales rasgos. A este respecto, los resultados
anteriores han demostrado que los rasgos genticos que codifica para enterocina AS-48 lata ser transferido
artificialmente en cepas adecuadas desprovistos de virulencia rasgos y con el rendimiento tecnolgico adecuado
(Ferna'ndez et. al, 2007). Los resultados obtenidos en el presente estudio frente a B.cereus en los brotes de soja
tambin indican que la AS-48 la produccin cepas podran servir para controlar el crecimiento de B. cereus en virtud
condiciones de temperatura adecuadas que permiten la produccin de suficiente cantidades de bacteriocina sin
favorecer a una excesiva crecimiento de B. cereus. Es de destacar la buena implantacin muestra por la cepa
bacteriocinognica A-48-32 en los brotes de soja,alcanzando densidades celulares elevadas dentro de los tres
primeros das de el almacenamiento de las muestras a 15 y 22 1C. Sin embargo, la aplicacin de esta cepa como una
cultura de proteccin estara limitado por la baja produccin de bacteriocina en condiciones de refrigeracin y la falta de
efectividad muestra en 22 1C. Por lo tanto, adems de ex-situ bacteriocina producida (ya sea solo o en combinacin
con otro antimicrobianos) sigue siendo la mejor opcin para el control de B. cereus y B. weihenstephanensis en brotes.