BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifatsifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan
kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara
untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit,
sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel
bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut juga
berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel
bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri
ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian
mikrobiologi (Lestari, 2013).
Salah satu tahapan untuk mengidentifikasi mikroba adalah Sifat Kimiawi , yaitu
dengan Pengecatan Gram. Pengecatan Gram adalah suatu cara untuk "mengecat"
atau "mewarnai" sel agar terlihat di bawah mikroskop (adelia, dkk., 2010).
Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi untuk mengidentifikasi
morfologi suatu bakteri.
1.2 Tujuan Percobaan
1. Mengidentifikasi morfologi dan fisiologi mikroba hasil dari fermentasi
santan.
2. Menerangkan mekanisme pewarnaan mikroba dari hasil fermentasi santan
dan memahami pewarnaan gram dan dapat menerangkan perbedaan reaksi
yang terjadi.
1.3 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara mengidentifikasi morfologi suatu mikroorganisme dengan
cara pewarnaan Gram?
2. Bagaimana proses pewarnaan Gram pada suatu mikroorganisme?
3. Bagaimana reaksi mikroorganisme terhadap pewarnaan?
1.4 Manfaat Percobaan
1. Mengetahui morfologi dan fisiologi mikroba hasil dari fermentasi santan

2. Mengetahui mekanisme pewarnaan mikroba dari hasil fermentasi santan dan

memahami pewarnaan Gram dan dapat menerangkan perbedaan reaksi yang
terjadi
1.5 Ruang Lingkup
Praktikum Mikrobiologi Teknik modul Identifikasi Mikroba ini dilaksanakan di
Laboratorium Mikrobiologi Teknik, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik,
Universitas Sumatera Utara dengan kondisi ruangan:
Tekanan

: 760 mmHg

Suhu

: 30 oC

Adapun bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah fermentasi santan,
kristal violet, larutan iodin, aseton-alkohol, safranin, aquadest (H2O) dan ragi tapai.
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah kawat inokulasi, beaker glass,
gelas ukur, kaca objek, penjepit tabung, lilin dan mikroskop.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1

Bakteri
Mikroorganisme atau mikroba adalah organisme yang berukuran sangat kecil

(biasanya kurang dari 1 mm) sehingga untuk mengamatinya diperlukan alat bantuan.
Mikroorganisme seringkali bersel tunggal (uniselular) meskipun beberapa protista
bersel tunggal masih terlihat oleh mata telanjang dan ada beberapa spesies multisel
tidak terlihat mata telanjang. Mikroorganisme biasanya mencakup semua prokariota,
protista

dan

alga renik. Fungi, terutama yang berukuran kecil dan tidak

membentuk hifa, dapat pula dianggap sebagai bagiannya meskipun banyak yang
tidak menyepakatinya. Kebanyakan orang beranggapan bahwa yang dapat dianggap
mikroorganisme adalah semua organisme sangat kecil yang dapat dibiakkan dalam
cawan petri atau inkubator di dalam laboratorium dan mampu memperbanyak diri
secara mitosis (Adelia, dkk., 2010).
Mikroba yang ada di alam ini mempunyai morfologi, yang khas. Namun
demikian, penggunaan alat bantu tersebut hanya untuk mengamati morfologisnya.
Masih diperlukan metode lain untuk mampu mengidentifikasinya (Kusmayani, dkk.,
2010).

1.2 Bentuk-bentuk bakteri

1) Bentuk batang (Basil)
Bakteri bentuk batang dikenal sebagai basil (berasal dari kata bacillus yang
berarti batang). Bentuk ini dapat dibedakan:
a) Basil tunggal, bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal. Contoh:
Salmonella typhosa penyebab penyakit tipus, Escherichiacoli bakteri yang
terdapat pada usus dan Lactobacillus.
b) Diplobasil yaitu bakteri berbentuk basil yang bergandengan dua-dua

c) Streptobasil yaitu bakteri berbentuk basil yang bergandengan memanjang

berbetuk rantai, misal Bacillus anthracis penyebab penyakit antraks,
Streptpbacillus moniliformis, Azotobacter, bakteri pengikat nitrogen.

2) Bentuk Bulat (Kokus)

Bakteri berbentuk bulat (bola) atau kokus dapat dibedakan:
a) Monokokus yaitu bakteri berbentuk bola tunggal, misal Monococcus
gonorhoe penyebab penyakit kencing nanah.
b) Diplokokus yaitu bakteri berbentuk bola bergandengan dua-dua, misal
Diplococcus pneumoniae penyebab penyakit pneumonia (radang, paruparu).
c) Sarcina yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat-empat
membentuk kubus, misal Sarcina luten.
d) Streptokokus yaitu bakteri berbentuk bola yang berkelompok memanjang
berbentuk rantai, misal Streptococcus lactis, Streptococcus pyogenes
penyebab sakit tenggorokan dan Streptococcus thermophilis untuk
pembuatan yoghurt (susu asam).
e) Stafilokokus yaitu bakteri berbentuk bola yang berkoloni seperti buah
anggur, misal Stafilokokus aureus, penyebab penyakit radang paru-paru.
3) Bentuk Spiral
Ada tiga macam bakteri bantuk spiral yaitu:
a) Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral, misalnya
Spirillum.
b) Vibrio atau bentuk koma yang dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna
misal Vibrio cholerae penyebab penyakit kolera.
c) Spiroseta yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang dapat bergerak
misal: Spirochaeta palida, penyebab penyakit sifilis.
(pustakabiolog, 2010).

2.3

Pewarnaan Gram

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni Gram positif dan
Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Bakteri Gram
negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode
pewarnaan Gram. Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu
gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri Gram negatif tidak. Pada uji
pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil
ungu, yang membuat semua bakteri Gram negatif menjadi berwarna merah atau
merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini
berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Kusmayani, dkk., 2010).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian
warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam).
Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ionion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat
warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa.
Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut
pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat
warna tersebut disebut pewarna asam/negatif (Pramuditya, dkk., 2011).
Dalam pewarnaan Gram diperlukan empat reagen yaitu :
a. Zat warna utama (violet kristal)
b. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
c. Pencuci/peluntur zat warna (alkohol/aseton) yaitu solven organik yang digunakan
uantuk melunturkan zat warna utama.
d. Zat warna kedua/cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali selsel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.
(Lestari, 2013).
Pada dasarnya dinding sel bakteri golongan Gram negatif umumnya lebih
tipis dari dinding sel bakteri golongan Gram positif. Bakteri Gram negatif
mengandung presentasi lipid (lemak) yang lebih banyak daripada yang dimiliki
dinding sel bakteri golongan Gram positif. Selama perlakuan dengan alkohol ternyata
lemak

ini

tertarik

ke

luar

sehingga

memperbanyak

porositas/menaikkan

permeabilitas dinding sel, akibatnya kristal violet, iodin keluar dan bakteri tidak
berwarna. Pada bakteri golongan Gram positif yang dinding selnya sedikit
mengandung lemak akan mengalami dehidrasi karena perlakuan dengan alkohol
sehingga ukuran pori-pori dan permeabilitas dinding sel berkurang. Beberapa marga
bakteri melepaskan zat pewarna dengan mudah apabila dicuci, pada bakteri lain, zat
pewarna tetap bertahan walau dicuci dengan alkohol 95%. Organisme yang tidak
dapat menahan zat pewarna setelah dicuci dengan alkohol 95% disebut organisme
Gram negatif, sedangkan yang dapat menahan zat pewarna disebut Gram positif
(Rezqi, dkk., 2010).
2.4

Aplikasi Identifikasi Mikroba

Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan Rumen Sapi
Bali sebagai Kandidat Biopreservatif
Preservasi merupakan cara untuk mengawetkan produk pangan seperti daging

dan produknya sehingga terhindar dari pembusukan akibat cemaran oleh mikroba.
Metode preservasi yang banyak dipergunakan untuk memperpanjang masa simpan
(helf life) daging/produknya adalah pendinginan pada suhu -2 C sampai 5 C. Selain
itu, pertumbuhan mikroba perusak dapat dicegah dengan pemberian bahan preservasi
kimiawi seperti nitrit, boraks, rhadomin ataupun formalin.
Nisin sebagai bakteriosin merupakan senyawa biopreservatif pertama yang
diisolasi dari bakteri asam laktat Lactococcus lacis spp. Senyawa ini sekarang telah
digunakan di 57 negara sebagai bahan pengawet makanan yang aman dan dapat
mencegah pertumbuhan bakteri perusak atau bahkan bakteri patogen.
Penggunaan bakteriosin sebagai biopreservaif memiliki beberapa keuntungan,
yaitu (1) tidak toksik dan mudah mengalami biodegradasi karena merupakan
senyawa protein, (2) tidak membahayakan mikroflora usus karena mudah dicerna
oleh enzim-enzim dalam saluran pencernaan, (3) aman bagi lingkungan dan dapat
mengurangi penggunaan bahan kimia sebagai bahan pengawet, dan (4) dapat
digunakan dalam kultur bakteri unggul yang mampu menghasilkan senyawa
antimikroba terhadap bakteri patogen atau dapat digunakan dalam bentuk senyawa
antimikrobial yang telah dimurnikan (Suardana, dkk., 2007).

2.4.1 Flowchart Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan
Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif
Mulai

100 gram sampel cairan rumen diencerkan dengan 100 ml larutan NaCl

Bakteri ditumbuhkan dalam media MRS agar

(deMann, Rogosa, Sharpe)

Setelah padat, media MRS agar diinkubasi dalam

keadaan anaerob
Koloni yang tumbuh diisolasi dan diseleksi

Diseleksi bakteri asam laktat penghasil substansi

antimikroba
Bakteri asam laktat selanjutnya diisolasi dan
diidentifikasi berdasarkan sifat koloni
Dilakukan uji fisiologis dan biokimia

Isolat dikelompokkan berdasarkan genusnya

Selesai
Gambar 2.1 Flowchart Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan
Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif
(Suardana, dkk., 2007)

BAB III
METODOLOGI PERCOBAAN
3.1 Bahan dan Fungsi
1. Kristal violet
Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan Gram pada bakteri.
2. Larutan iodin
Fungsi: sebagi bahan untuk pewarnaan Gram pada bakteri.
3. Aseton alkohol
Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan Gram pada bakteri.
4. Safranin
Fungsi: sebagai bahan untuk pewarnaan Gram pada bakteri.
5. Fermentasi santan Pajak Sore
Fungsi: sebagai mikroba yang akan diamati dan diberi pewarnaan.
6. Fermentasi santan Pajak Setia Budi
Fungsi: sebagai mikroba yang akan diamati dan diberi pewarnaan.
7. Ragi Tapai
Fungsi: sebagai bahan untuk memfermentasikan santan kelapa.
3.2

Peralatan dan fungsi

1. Kawat inokulasi
Fungsi: sebagai alat untuk mengambil sampel dan penggerus pada kaca
objek.
2. Pipet tetes
Fungsi: untuk mengambil larutan pewarna.

3. Kaca objek
Fungsi: sebagai tempat untuk meletakkan objek yang akan diamati.
4. Mikroskop
Fungsi: sebagai alat untuk mengamati bentuk mikroba.
5. Lilin
Fungsi: sebagai sumber api untuk mensterilkan kawat inokulasi dan
fiksasi sampel.
6. Penjepit tabung
Fungsi: sebagai alat untuk menjepit kaca objek saat fiksasi.
7. Beaker glass
Fungsi: sebagai tempat membuat larutan.
8. Gelas ukur
Fungsi: sebagai tempat mengukur larutan.
3.3

Prosedur Pewarnaan Gram

1. Fermentasi santan Pajak Sore diambil dengan menggunakan kawat
inokulasi yang telah disterilkan terlebih dahulu dengan lilin.
2. Bakteri diambil sebanyak 4 atau 5 loop lalu digoreskan ke atas kaca objek
lalu dibiarkan kering di udara terbuka kemudian difiksasi di atas api lilin.
3. Diamati di bawah mikroskop.
4. Digambar hasil yang didapat.
5. Kaca objek dibasahi dengan kristal violet lalu dimiringkan untuk
membuang cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan
air.
6. Kemudian kaca objek dibasahi iodin lalu dimiringkan untuk membuang
cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan air.
7. Kemudian kaca objek dibasahi alkohol aseton lalu dimiringkan untuk
membuang cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan
air.
8. Kemudian kaca objek dicuci dengan safranin lalu dimiringkan untuk
membuang cairan yang berlebih. Biarkan 30-60 detik lalu dibilas dengan
air.

9. Kaca objek dikeringkan dengan tisu lalu diamati dengan mikroskop dan
hasilnya digambarkan.
10. Percobaan diulangi untuk sampel hasil fermentasi santan pajak Setia Budi.

3.4

Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

Mulai

Diambil preparat dengan kawat inokulasi steril

Diambil bakteri 4 atau 5 loop dan digoreskan ke atas kaca

objek lalu dibiarkan kering kemudian difiksasi di atas api
lilin

Diamati preparat dibawah mikroskop

Digambar hasil yang didapat

Kaca objek dibasahi dengan kristal ungu

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Kaca objek dibasahi dengan larutan iodin

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Kaca objek dibasahi dengan larutan aseton-alkohol

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Kaca objek dibasahi dengan safranin

Dibiarkan 30-60 detik dan dibilas dengan air

Diamati sampel di bawah mikroskop

Apakah mikroba berwarna ungu?

Tidak

Ya
Gram Positif

Gram Negatif

Digambar hasil yang didapat

Selesai
Gambar 3.1 Flowchart Percobaan Pewarnaan Gram

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
IV.1 Hasil
Tabel 4.1 Hasil Pewarnaan Gram
Gambar Bakteri
Sampel

Sebelum

Setelah

Pewarnaan

Pewarnaan

Morfologi

Keterangan

Bakteri

Fermentasi
Santan Pajak

Spiral

Gram Negatif

Spiral

Gram Negatif

Sore

Fermentasi
Santan Pajak
Setia Budi

4.2

Pembahasan
Dari hasil pengamatan terhadap hasil percobaan proses pewarnaan Gram,

terlihat koloni mikroba berbentuk Spirillia dengan warna merah. Dari sampel
fermentasi santan Pajak sore dan fermentasi santan Pajak setia budi
bakteri Spirillia. Bentuk-bentuk bakteri Spiral, yaitu:
1. Spiral, yaitu golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral, misalnya

diperoleh

Spirillum.
2. Vibrio atau bentuk koma yang dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna
missal Vibrio cholerae penyebab penyakit kolera.
3. Spiroseta yaitu golongan bakteri berbentuk spiral yang dapat bergerak misal:
Spirochaeta palida, penyebab penyakit sifilis.
Ciri-cirinya yaitu sel-sel berbentuk langsing, lentur, panjang 6-500 ,
berbentuk spiral sekurang-kurangnya memiliki satu putaran yang lengkap. Ordo ini
terdiri atas 2 famili dengan 6 genus yang mencakup 49 spesies. Ada beberapa spesies
yang patogen pada hewan dan manusia. Bakteri dari ordo ini berupa batang yang
melingkar-lingkar seperti spiral. Semula orang menyangka spiral ini tidak
mempunyai

falgel,

akan

tetapi

penyelidikan

dengan

mikroskop

electron

menunjukkan adanya flagel yang amfitrik (pustakabiolog, 2010).

Berdasarkan teori bahwasanya bakteri Spirillia merupakan bakteri Gram negatif.
Ini sesuai dengan hasil percobaan yang kami peroleh yaitu bakteri Spirillia pada
sampel fermentasi santan Pajak Sore dan Pajak Setia Budi merupakan bakteri Gram
negatif. Hal ini disebabkan karena bakteri tersebut tidak mempertahankan zat warna
ungu kristal pada metode pewarnaan Gram.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Adapun kesimpulan yang diperoleh adalah:
1. Mikroba yang terdapat pada fermentasi santan pajak sore adalah bakteri
dengan morfologi Spiral.
2. Mikroba yang terdapat pada fermentasi santan pajak setia budi adalah
bakteri dengan morfologi Spiral.
3. Bakteri Spiral yang terdapat pada fermentasi santan Pajak Sore merupakan
bakteri Gram negatif.
4. Bateri Spiral yang terdapat pada fermentasi santan Pajak Setia Budi
merupakan bakteri Gram negatif.
5.2 Saran
Adapun saran yang dapat diberikan adalah:
1. Sebaiknya percobaan dilakukan dengan beberapa variasi sampel, misalnya
air rendaman sayur-sayuran.
2. Disarankan untuk mengunakan pewarna lain seperti eritrosin sebagai
pembanding dengan pewarna safranin.
3. Percobaan sebaiknya dilakukan dua kali untuk memperoleh pengamatan
bakteri secara akurat.
4. Disarankan untuk memvariasikan perbandingan antara sampel dengan ragi,
sehingga pengetahuan praktikan bertambah.
5. Disarankan untuk membersihkan alat-alat yang akan digunakan agar steril.

DAFTAR PUSTAKA

Adelia., Dadan Khusnudzan., Novita Silvi A., dan Dimas Rendra G. 2010. Makalah
Identifikasi Mikroba Berdasarkan Sifat Kimiawi. Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan. Bandung : Universitas Padjadjaran.
Kusmayani, Indriati Sari., Wida Hanayasashi S., dan MA. Faisal Datu Sefa. 2010.
Identifikasi Mikroba Berdasarkan Sifat Kimiawi. Program Studi Ilmu Kelautan.
Fakultas Perikanan dan Imu Kelautan. Bandung : Universitas Padjadjaran.
Lestari, Rina. 2013. Pewarnaan Sederhana, Negatif, Kapsul, dan Gram. Program
Studi D3 Kebidanan. Yogyakarta: Sekolah Tinggi Ilmu Kesehatan Yogyakarta.
Pramuditya, Alfian., Daris., dan Diah Oktiva Furi. 2011. Pewarnaan Gram dan
Pengamatan Morfologi Bakteri. Program Studi Gizi S1. Fakultas Ilmu
Kesehatan. Surakarta : Universitas Muhammadiyah Surakarta.
Pustaka Biolog, pdf. 2010. Ordo-spirochaetales. Diakses pada 18 September 2015
Rezqi P, Erfitra., Evi Ayu Chandra, Jihan Mawaddah., dan Rina Dwi A. 2010.
Pewarnaan Gram. Jurusan Biologi. Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam. Malang : Universitas Negeri Malang.
Suardana, Wayan I

, I Nyoman Suarsana., I Nengah Sujaya, dan Komang Gede

Wiryawan. 2007. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Cairan
Rumen Sapi Bali sebagai Kandidat Biopreservatif. Jurnal Veteriner. Denpasar :
Universitas Udayana.

LAMPIRAN A
FOTO PEMBELIAN SAMPEL
LA.1 Foto Pembelian Sampel Fermentasi Santan di Pajak Sore

Gambar A.1 Foto Pembelian Sampel Kelapa Pajak Sore