Directores de Tesis:
Dr. Rodolfo J. Menes
Dra. Claudia Etchebehere
Diciembre 2007
INDICE...................................................................................................................................i
Abreviaturas mas utilizadas................................................................................................vi
Agradecimientos.....................................................................................................................1
Resumen................................................................................................................................. 2
Abstract...................................................................................................................................4
1. Descripcin Y Relevancia De La Temtica........................................................................6
1.1 Marco Legal Y Econmico..............................................................................................6
1.2 Efluentes Industriales......................................................................................................10
1.2.1 Industria Lctea En Uruguay.......................................................................................10
1.2.2 Problema Ambiental.....................................................................................................13
1.2.3 Sistemas De Tratamiento De Efluentes........................................................................17
1.2.3a Sistemas De Tratamiento Terciario Tipo SBR (Sequencing Batch Reactor).............18
1.3 Fisiologa De La Remocin De Nitrgeno......................................................................21
1.3.1 Ciclo Del Nitrgeno.....................................................................................................21
1.3.2 Nitrificacin.................................................................................................................24
1.3.3 Desnitrificacin............................................................................................................28
1.3.4 Vas No Clsicas..........................................................................................................31
1.4 Fundamentos De La Metodologa A Utilizar..................................................................34
1.4.1 FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)....35
1.4.2 Clonado Y Secuenciacin............................................................................................41
1.4.3 T-RFLP (Terminal Restriction Lenght Polymorphism)..43
1.4.4 Tcnicas Dependientes De Cultivo..............................................................................49
1.4.4 A. Nmero Mas Probable De Bacterias Desnitrificantes.............................................49
1.4.4 B. Recuento Y Aislamiento En Placa De Hetertrofos Aerobios Totales...................50
ii
7.Anexos.............................................................................................................................170
ANEXO 1: % Formamida...................................................................................................171
ANEXO 2: Tabla de nmero mas probable........................................................................177
ANEXO 3: Condiciones de amplificacin por PCR...........................................................179
ANEXO 4: Condiciones de restriccin enzimtica.............................................................180
ANEXO 5: Normalizacin de datos del T-RFLP...............................................................183
ANEXO 6 : Efectos de la Aliltiourea (ATU) en la actividad nitrificante..........................184
ANEXO 7: T-RFLP del gen amoA con AluI......................................................................186
ANEXO 8: Medios, reactivos y buffers..............................................................................189
vii
Agradecimientos
A mi madre, mis abuelos, a Eduardo y toda mi familia por confiar en mi y apoyarme desde el principio
en cada paso que doy. Porque de ellos he sacado la fuerza para no rendirme en el camino.
... a mis amigos de la vida que siempre me alientan y me acompaan sin importar cuan lejos est.
... a mis amigos de la barra Ma.c.a de los cuales aprend mucho en esta maestra y por sobre todo por
todos los buenos momentos juntos, en fin por su amistad...
... a Valentina por ayudarme en estos ltimos pasos de la tesis y compartir esas lindas tardes de estudio
estando lejos de casa. A toda la barra nueva por estar ah...
...a todos los micro de qumica porque es una gran familia que me dio lugar y siempre estn y estarn
en mi corazn. De quienes he aprendido mucho, gracias a su paciencia y buena onda . En especial a Lu,
Patty, La morocha (Jimena), ngela, Ana Mara, Silvana T, Ana F., Anala, Meche, Matilde, Mauricia,
Silvana A., Silvana V., Mnica, Guadalupe, Wilson, Gianna, Gabriela L, Gabriela G., Mara Ins, Ins,
Sonia, Sergio, Pa, Anita, Carola, Vanesa, Graciela.
Y muy pero muy especialmente a mis directores de tesis Javier y Claudia, porque siempre me dieron un
lugar y me ensearon con mucha paciencia sus conocimientos. Porque adems de ser excelentes
directores de tesis son excelentes personas de las cuales he aprendido mucho. Por dejarme ser aprendiz
del maestro (!)...
...a Adrin, Soledad, Rafael, y Alejandra de la facultad de Ingeniera por cuidar a Flora y Manolo sin
los cuales esta tesis no hubiese sido imposible
El presente trabajo de investigacin fue financiado en parte por el proyecto EOLI (INCO program of the
European Community (Contract number ICA4-CT-2002-10012) y por el Proyecto CSIC I+D
RESUMEN
El vertido directo de los efluentes industriales hacia cursos de agua puede ocasionar
serios problemas ambientales como la eutrofizacin. Es por ello que se implementan
diversos sistemas para el tratamiento de efluentes antes de ser vertidos. En este caso se
estudiaron dos sistemas de tratamiento biolgico constituidos cada uno por un reactor
SBR (sequencing batch reactor) a escala de laboratorio (Rector F y Reactor M) durante
aproximadamente 650 das. Los mismos fueron diseados para llevar acabo la remocin
de carbono y nitrgeno de efluentes de industria lctea, alternando en el mismo tanque
las etapas aerobia (nitrificacin) y anxica (desnitrificacin).
El anlisis de la comunidad microbiana de estos reactores se abord mediante el uso de
distintas estrategias: tcnicas moleculares (FISH, T-RFLP, clonado y secuenciado de los
genes ARNr 16S amoA y nirS), medidas de actividad respiromtrica (nitrificante y
hetertrofa), de actividad desnitrificante, y tcnicas clsicas de cultivo.
Las medidas de actividad respiromtrica reflejaron los cambios en la eficiencia de
remocin de nutrientes dentro los reactores durante la operacin. Tanto la actividad
nitrificante como la hetertrofa lograron recuperarse luego del agregado de txicos
(Aliltiourea y 4-clorofenol) lo cual resulta interesante para sistemas reales donde pueden
ocurrir descargas de sustancias provenientes del lavado de tanques o derrames. Esta
tcnica sencilla podra utilizarse para el control de sistemas reales donde el monitoreo
permanente es menos habitual y mas costoso.
Las herramientas moleculares utilizadas permitieron identificar las especies nitrificantes
y desnitrificantes mas abundantes presentes y explicar parcialmente los cambios en la
eficiencia de remocin de nutrientes. Entre las bacterias desnitrificantes mas abundantes
clave:
SBR,
efluentes
industriales,
nitrificacin,
desnitrificacin,
ABSTRACT
Industrial wastewater can cause serious problems for aquatic environment such as
eutrophycation. That is the reason why different systems are employed for effluent
treatment before throwing it to water course.
In this work, two biological treatment systems (laboratory scale) were analyzed during
approximately 650 days. Each system is based on a SBR reactor (sequencing batch
reactor). Both reactors (Reactor F and Reactor M) were developed in order to remove
carbon and nitrogen from dairy wastewater, switching from aerobic (nitrification) and
anoxic (denitrification) steps.
Different strategies have been used so as to study the reactors microbiology: molecular
techniques (FISH, T-RFLP, cloning and sequencing of 16S rRNA, amoA and nirS
genes), respirometric measures (nitrification and heterotrophic activity test),
denitrification activity, and culture methods.
Respirometric activity reflected the reactors performance (nutrient removal). Both
heterotrophic and nitrifying activities return to normal situation after toxic substances
additions (Alylthiourea and 4-clorophenol). Real systems can be monitored by
measuring this activity.
Molecular methods allowed the identification of most predominant nitrifying and
denitrifying species. They also explained changes in nutrients removals efficiency.
Denitrifying
community
was
dominated
by
genus
Ochrobactrum,
Thauera,
It was proved that modifications and some disturbances during operation produced
changes in community structure and microbial diversity. Usually, this affects reactors
performance and microbial activity.
Keywords: SBR, industrial wastewater, nitrification, denitrification, respirometric
activity,
FISH,
T-RFLP,
16S
rRNA,
amoA,
nirS,
microbial
diversity.
promueve
acciones
para
evitar
la
dilapidacin,
el
1971 Ley 14.053. Se crea el INPMA (Instituto Nacional de Proteccin del Medio
Ambiente, que funcionaba en el mbito del Ministerio de Educacin y Cultura)
2000 Ley 17.283. Creacin de la LGPA (Ley General de Proteccin del Ambiente).
El objetivo de esta Ley es, en cumplimiento del mandato previsto en el artculo 47
de la Constitucin, establecer previsiones generales bsicas atinentes a la poltica
nacional ambiental y a la gestin ambiental coordinada con los distintos sectores
pblicos y privados.
Los efluentes en si mismos adems tienen que cumplir con el artculo 11 del Decreto
253/79 donde la concentracin de amonaco en el efluente no debe exceder los 5 mgN/L
si es desage directo al curso de agua, siendo ilimitado en caso de ser vertido a colector
o por infiltracin a terreno.
El MVOTMA es quien realiza las intimaciones correspondientes determinando las
condiciones que deben cumplir los efluentes. Adems ejerce el control general de la
aplicacin de estas normas pudiendo requerir de las Intendencias Municipales y de
O.S.E. las acciones necesarias, en funcin de lo dispuesto por la normativa.
En el Artculo 32 del Decreto 253/79 se establece que las infracciones a las normas
establecidas en el mismo sern sancionadas, de conformidad con el artculo 147 del
Decreto - Ley N 14.859 segn distintos criterios especificados.
Por ejemplo establece que en el caso de no respetarse los plazos otorgados para la
construccin de la Planta de Tratamiento se cobraran multas de:
1ra. vez ............................ 100 UR - 1000 UR
2da. vez ............................ 200 UR - 2000 UR
3ra. vez y siguientes ............... 300 UR - 5000 UR
Por ejemplo por realizar vertidos sin tratamiento a un cuerpo receptor teniendo planta
de tratamiento construida y aprobada las multas son:
Sin antecedentes .................... 200 UR - 3000 UR
Con antecedentes ................... 500 UR - 5000 UR
El trmino efluente industrial se utiliza para denominar a todo lquido, slido o gas
proveniente de un proceso industrial. Las industrias han implementado tecnologas para
el tratamiento de efluentes lquidos de manera que los vertidos cumplan las normativas
vigentes, las cuales tienden a ser cada vez mas exigentes. Por ello es necesario
investigar e implementar sistemas de tratamiento de efluentes que sean de bajo costo y
eficientes en la remocin de contaminantes.
No todos los vertimientos representan los mismos riesgos. En este trabajo se centrar la
atencin en la industria lctea, donde se procesan diariamente volmenes muy altos de
leche, y se generan caudales de descarga de fluidos de cientos de litros por da.
1.2.1 Industria lctea en Uruguay
Dentro del ramo lcteo existen varios tipos de industrias, tales como plantas
pasteurizadoras, queseras, etc. los cuales forman una parte importante de la produccin
nacional (Tabla I). Dicho ramo industrial es llevado a cabo en una parte importante del
pas, estando presente en todos los departamentos del territorio excepto en Tacuaremb,
Rocha, Flores y Lavalleja (segn los datos de SADI "solicitud de autorizacin de
desage industrial" de la DINAMA) (Fig. 1).
10
Tabla I: Industrias del ramo lcteo con solicitud de autorizacin de desage industrial (S.A.D.I) en
Uruguay (informacin obtenida de la DINAMA-MVOTMA)
Nombre
Localidad
Cuenca
Vertido
Tipo
Montevideo
Conaprole Usina N2 Montevideo
La Baha
Colector
Leche pasteurizada
Conaprole (C.I.M.)
Arroyo Pantanoso
Colector
Leche pasteurizada
LEONARDO ADRIAN
CRUZ
Montevideo
Falta Curso
Colector
Conaprole Central
Montevideo
La Baha
Colector
Conaprole
Canelones
Canelones
Queso
Conaprole San
Ramn - P9
Montevideo
Canelones
San Ramn
Ro Santa Luca
Curso de agua
Queso
Luis Giovanelli
Palleiro y Jos Nieto
Coviello
San Ramn
Ro Santa Luca
Curso de agua
Dulce de leche
Alcides Fernandez
San Antonio
Ro Santa Luca
Curso de agua
Enfriado de leche
San Carlos
Arroyo Maldonado
Curso de agua
Leche pasteurizada
San Jos
Ro San Jos
Curso de agua
Leche pasteurizada
Arroyo Pavon
Curso de agua
Leche en polvo
Frigorfico Modelo La
Boyada
La Boyada
Ro de la Plata
Curso de agua
Queso
Maldonado
Conaprole
Maldonado
San Jos
La Josefina
Lactosan (Gley)
Curso de agua
Queso
Curso de agua
Queso
Bonprole
Libertad
Conaprole Villa
Rodriguez (N 8)
Villa Rodrguez
Arroyo Cagancha
Tarariras
Arroyo Riachuelo
Curso de agua
Queso
Rosario
Ro Rosario
Curso de agua
Queso
Arroyo Sauce
Seglar S.A.
Tarariras
Curso de agua
Queso
Gualeguay
Tarariras
Curso de agua
Queso
Granja Naturalia
S.R.L.
Picada Benitez
Ro Rosario
Curso de agua
Queso
Jess S. Brasetti
Nueva Helvecia
Curso de agua
Colonia
Ro Rosario
11
Queso fundido
Margaritas
Tarariras
Arroyo Sauce
Tarariras
Arroyo Riachuelo
Curso de agua
La Magnolia LTDA.
Nueva Helvecia
Curso de agua
Ro Rosario
Curso de agua
Granja Pocha
Juan L. Lacaze
Calcar
Carmelo
Curso de agua
Granja Pierolo
LTDA
Colonia
Cosmopolita
Arroyo Cufre
Curso de agua
Ro Negro
Curso de agua
Leche en polvo
Quesera Helvtica
Cardona
Curso de agua
Florida
Trinta y Tres
Ro Olimar Grande
Melo
Arroyo Conventos
Colector
Durazno
Leche pasteurizada
Young
Arroyo Negro
Soriano
Florida
Conaprole Florida
Treinta y Tres
Calitt
Cerro Largo
Coleme
Durazno
Sociedad Fomento
Durazno
Rio Negro
Claldy
Curso de agua
Paysand
Conaprole Paysandu Pueblo Esperanza Ro Uruguay
Coleque
Quebracho
Ro Uruguay
Pili SA II
Pili
Curso de agua
Colector
Rivera
Arroyo Cuapiru
Curso de agua
Leche pasteurizada
Salto
Rivera
Conaprole Rivera
Salto
Inlacsa
12
16
N industrias lcteas
14
12
10
8
6
4
2
Artigas
Rocha
Lavalleja
Flores
Tacuaremb
Salto
Rivera
Paysand
Ro Negro
Durazno
Cerro
Treinta y
Florida
Soriano
Colonia
San Jos
Maldonado
Canelones
Montevideo
Figura 1. Distribucin de las industrias lcteas en los distintos departamentos del territorio
nacional.
En torno a las ciudades ms pobladas se han desarrollado cuencas lecheras locales. Las
ms importantes cuentan con usinas pasteurizadoras. Por ejemplo en el caso de
CONAPROLE se cuenta con sistemas de tratamiento en cada una de sus Plantas
industriales habiendo desarrollado diferentes tecnologas. En Planta Industrial N 14
(ubicada en la Ruta 5 en el Departamento de Rivera) desarroll el primer sistema SBR
(sequencing batch reactor) instalado en el pas, donde una vez tratadas las aguas, se
bombea a un predio agropecuario distante 2 Km, para su aprovechamiento en riego de
forraje. En la mayora de las Plantas ubicadas en zonas rurales se cuenta con
tratamientos basados en sistemas de lagunas anaerbicas y lagunas aireadas con
funcionamiento de IAMC (aireacin intermitente en mezcla completa), complementado
con la instalacin de humedales previos a los vertidos (http://www.conaprole.com.uy).
1.2.2 Problema ambiental
El 71% de la superficie del planeta est cubierta por agua y por lo tanto se considera el
agua como uno de los recursos naturales ms abundantes. Sin embargo, si se observa
ms detenidamente el presupuesto hdrico mundial, slo una pequea fraccin est
13
14
una limitacin. Cuando ocurre este fenmeno comienza el desarrollo de biomasa algal,
luego aumenta el consumo de materia orgnica por organismos hetertrofos los cuales
para ello requieren de oxgeno, aumentando la DBO (demanda bioqumica de oxgeno),
el contenido de dixido de carbono y a su vez la acidez.
Los sntomas y efectos de la eutrofizacin son los siguientes (http://www.fao.org):
- Aumento de la produccin y biomasa de fitoplancton, algas asociadas y macrfitas.
- Modificacin de las caractersticas del hbitat debida a la transformacin del conjunto
de plantas acuticas.
- Produccin de toxinas por determinadas algas.
- Aumento de los gastos de operacin de los sistemas pblicos de abastecimiento de
agua, adems de problemas de gusto y olor, especialmente durante los perodos de
proliferacin de algas.
- Desoxigenacin del agua, especialmente al finalizar las situaciones de proliferacin de
algas, lo que normalmente da lugar a una mortandad de peces.
- Colmatacin y obstruccin de los canales de riego por las malas hierbas acuticas.
- Reduccin de la posibilidad de utilizacin del agua para fines recreativos.
- Prdidas econmicas debidas a la modificacin de las especies cticas, mortandad de
peces, etc.
Adems, en cuanto a la contaminacin nitrogenada se debe tener en cuenta que el nitrito
es altamente nocivo para la salud humana. Desde hace tiempo, se ha puesto de
manifiesto que el principal efecto perjudicial para la salud derivado de la ingestin de
16
17
18
extraccin y fase inactiva (se puede omitir). Esta operacin permite que un reactor
simple acte como una serie de reactores secuenciales y un clarificador. Durante el
periodo de llenado el agua residual que ingresa es agregada a la biomasa del ciclo
anterior que esta en el tanque. La extensin del periodo de llenado depende del volumen
del SBR y la naturaleza del efluente de donde provenga. El llenado es intermitente y el
reactor puede o no ser agitado durante ese periodo. Luego en el periodo de reaccin el
reactor puede o no ser aireado dependiendo del objetivo del mismo (Schmidell et al,
2007).
Este mtodo biolgico es aplicable para la remocin del amonio proveniente de
efluentes y en este caso consiste en una primer etapa aerobia de nitrificacin, seguido
de una etapa anxica de desnitrificacin donde las formas oxidadas de nitrgeno son
reducidas a N2 o N2O por bacterias desnitrificantes en condiciones anxicas. Los
reactores SBR nitrificantes/desnitrificantes estn constituidos por un solo reactor que
agua residual entrante. Esto no ocurre en los sistemas de lodos activados donde un
aumento en el flujo de agua residual entrante implica una disminucin en el tiempo de
residencia de la misma en el tanque de aireacin.
Anxica
Aerbica
Reaccin
Llenado
sedimentacin
Efluente tratado
Lodo excedente
Purgado
Figura 2. Etapas del ciclo de operacin de un reactor SBR nitrificante-desnitrificante
20
descargas
21
amonio y el nitrato son asimilables por ejemplo por las plantas, que a su vez sirven
para la nutricin del hombre y otros animales.
Por otro lado el nitrato se reduce a N2 mediante el proceso de respiracin anxico
llamado desnitrificacin, lo que completa el ciclo del N en la biosfera. En condiciones
anaerbicas adems puede darse la reduccin de nitrato a amonio por procesos
asimilativos o por un proceso desasimilativo (reduccin desasimilativa de nitrato a
amonio, del ingls DNRA). Este ltimo es llevado a cabo en general por bacterias
fermentadoras que compiten por el nitrato con las bacterias desnitrificantes en
condiciones anxicas (Atlas y Bartha, 2002; Schmidell et al., 2007).
Nitrificacin
NO2-
N2
Protenas
n
Asimil aci
NH 2
NO 3-
Am
on
ifi c
ac
i n
n
aci
mil
i
s
A
in
icac
Protenas
NO 2-
As
im
il a
ci
Fijacin de
nitrgeno
n
NH3
nif
Amo
NH 2
xico
Anxico
Fijacin
de N2
NO 2-
DNRA
N2
NO,
N2O
Desnitrificacin
22
Anammox,
Nitrosomonas spp
23
1.3.2 Nitrificacin
24
25
Figura 4. rbol filogentico basado en el gen del ARNr 16S de las principales bacterias nitrificantes (AOB
marcadas en verde, NOB marcadas en rojo) (Tomado de The Prokaryotes)
26
NH4+
NH2OH
NH2OH + H2O
O2 + 4H++ 4e-
2H2O
Amo
AMO
Hao
HAO
NH2OH
NO2-
27
La mayor parte de estas bacterias son quimiolitoauttrofas, utilizan el nitrito como nica
fuente de energa, sin embargo algunas especies pertenecientes al genero Nitrobacter
son capaces de utilizar adems fuentes de energa orgnicas. Al igual que las AOB,
estas bacterias son auttrofas y fijan CO2 como fuente de carbono.
Debido a su metabolismo se encuentran generalmente asociados a las AOB. La enzima
que cataliza el pasaje de nitrito a nitrato es la nitrito oxidorreductasa (NOR).
La estequiometra de la reaccin es la siguiente:
NO2- + H2O
NO3- + 2H+ + e-
2H+ + 2e- + O2
H2O
28
Habitualmente
se
considera
que
los
microorganismos
desnitrificantes
son
29
NO3
Nar
NAR
NO2
Nir
NIR
Nor
NOR
NO
Nos
NOS
N2O
N2
Figura 6. Proceso de desnitrificacin y enzimas involucradas. NAR: nitrato reductasa; NIR: nitrito
reductasa; NOR: xido ntrico reductasa; NOS: xido nitroso reductasa.
30
31
tratamiento de aguas
tratamiento
de
aguas
residuales
instalada
en
Rotterdam,
Netherlands
32
33
Se sabe que menos del 1 % de los microorganismos de una muestra ambiental se pueden
cultivar en el laboratorio, perdiendo la diversidad gentica y bioqumica disponible. La
biologa molecular permite determinar las secuencias parciales de los microorganismos
presentes en un ecosistema sin necesidad de cultivarlos y as se evitan los problemas
asociados al cultivo en laboratorio. El estudio de los genes presentes en las
comunidades microbianas permite caracterizar cuntos organismos participan y de que
manera en una comunidad (Amann et al., 1995).
Este tipo de estudios estn en fase de desarrollo, pero tambin es cierto que han abierto
una puerta a muchos estudios de expresin y fisiologa, que en el futuro podran dar las
claves del funcionamiento de los ciclos biogeoqumicos ms importantes del planeta. La
tendencia actual en ecologa microbiana es la combinacin de las tcnicas tradicionales
de cultivo, y las tcnicas moleculares para abordar el estudio de la diversidad de las
muestras naturales.
En esta tesis se opt por utilizar tcnicas clsicas de cultivo, anlisis de aislamientos de
microorganismos, medidas de actividad nitrificante, y herramientas de biologa
molecular como FISH (Fluorescent in situ hubridization), T-RFLP (Terminal
Restriction Lenght Polymorphism), clonado y secuenciado de genes funcionales y del
gen ARNr 16S.
Este ltimo, con un tamao de 1500 nucletidos, o el ARNr 23S, con aprox. 3000
nucletidos, son muy utilizados en estudio de comunidades bacterianas ya que ambas
molculas contienen la suficiente informacin como para realizar un anlisis
filogentico (Gutell et al., 1994). Existen muy buenas razones para utilizar como sitio
34
blanco de anlisis a las molculas de ARNr 16S de la subunidad pequea del ribosoma
(Amann y Ludwig, 2000):
Una manera muy habitual de visualizar el total de clulas en una muestra dada es el uso
de intercalantes del ADN. Estos reveladores de cido nucleico no discriminan entre
clulas de distintas especies ni discriminan clulas activas de las muertas, pero son de
gran utilidad para obtener un recuento aproximado del nmero total de clulas, y para la
observacin de su morfologa in situ. Dentro de los reveladores de cido nucleico
utilizados con mas frecuencia para observar clulas en microscopio de fluorescencia se
encuentran el DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; con una seal fluorescente azul
cuando est unido al ADN) y el naranja de acridina. En este caso se utiliz el DAPI
como tincin de clulas totales de cada muestra.
35
36
Sonda
5 Secuencia de la sonda 3
Dominio
ARCH915
GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
EUB338
GCTGCCTCCCGTAGGAGT
Sonda
5 Secuencia de la sonda 3
ALF1B
CGTTCG (C/T)TCTGAGCCAG
BET42a *
GCCTTCCCACTTCGTTT
GAM42a *
GCCTTCCCACATCGTTT
Arquea
Bacteria
Dominio Bacteria
alpha Proteobacteria
beta Proteobacteria
gamma Proteobacteria
Nso1225
CGCCATTGTATTACGTGTGA
Nit3*
Nitrobacter spp.
Ntspa662*
genus Nitrospira
Nsv 443
Nitrosospira spp.
Nsm156
NmV
37
Nitrosococcus mobilis
fluoroforo
sonda
Microscopio de
Epifluorescencia
muestra
Fixation
blanco (rRNA)
Deteccion
Fijacion
permeabilizacion
Celulas hibridadas
Lavado
Hibridacin
Ribosomas
Sondas de
oligonucleotido fluorescentes
Para el diseo y seleccin de sondas para FISH se necesita un gran conocimiento acerca
de las relaciones filogenticas entre los microorganismos, ya que las sondas son
diseadas para grupos filogenticos que no necesariamente concuerdan con los grupos
fenotpicos. Es importante destacar que la especificidad de una sonda est basada en el
38
conocimiento actual de las secuencias del ARNr. En el futuro esta especificidad puede
variar por la descripcin de nuevas secuencias de microorganismos que no pertenezcan
al grupo de inters, pero que puedan hibridar con la misma sonda por tener la misma
secuencia blanco. Usualmente se disean oligonucletidos de 18-25 bases aprox.
Existen tres consideraciones importantes a tener en cuenta a la hora de disear una
sonda con respecto a los mismatches (discrepancias con la secuencia complementaria a
la sonda):
*nmero de mismatches en un rango del 5%-30%.
*posicin de los mismatches, tratando que se encuentre por lo menos un mismatch en
posicin central entre la sonda y el cido nucleico no deseado, disminuyendo as la
probabilidad de uniones inespecficas; por el contrario, en el caso de existir un
mismatch entre la sonda y la secuencia blanco deseada, es preferible que se encuentre
en un extremo de la sonda, para que este no interfiera con la hibridacin
*tipo de mismatch: G se aparear con alguna otra base
La Guanina (G) adems de unirse con su nucletido complementario (la Citocina (C)),
puede unirse fuertemente con Timina (T). Esta unin no se considera mismatch ya que
la fuerza de enlace no es considerada como tal. Cada nucletido encuentra otro
nucletido con el cual presenta la mxima fuerza de enlace para ambos, a los cuales se
les llama nucletidos complementarios, por ejemplo Adenina-Timina, o CitocinaGuanina (Tabla III).
Sin embargo una unin es considerada mismatch cuando la fuerza de enlace segn la
tabla III entre los nucleotidos analizados es menor al resultado de la operacin:
39
Fuerza mxima de enlace para ese nucletido menos 0.5, de lo contrario, no es considerado como
mismatch. Tal es el caso de la unin entre T y G, donde la Fmax de T es 1,1 (la cual se
presenta cuando se une a A) y la Fuerza de unin a T-G es 0,9. Por lo tanto, 1,1 0.5
=0.6 < 0.9 es decir, que no se considera como un mismatch a la unin de G con T.
A
C
G
T
A
0
0
0,5
1,1
C
0
0
1,5
0
G
0,5
1,5
0,4
0,9
T
1,1
0
0,9
0
40
41
42
PCR gen
especifica
Seleccion y anlisis de
clones por: RFLP,
secuenciado, etc.
B
DNA ambiental
Figura 8: esquema que muestra el procedimiento de clonado y seleccin de clones para el anlisis.
43
resulta altamente sensible y hbil, siendo mas rpida y precisa que otras tcnicas como
el DGGE (electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante), RFLP y ARDRA
(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis, tambin nombrado como RFLP del
gen ARNr 16S).
Si bien es cierto que el T-RFLP es una tcnica til para obtener el perfil de una
comunidad en estudio, esta no proporciona la identidad de las especies presentes. Por lo
tanto a menudo es necesaria la asignacin de identidad a los T-RFs mediante la
restriccin in slico de secuencias del gen amoA depositadas en el banco de secuencias.
Sin embargo, de esta forma en muchos casos no es posible identificar los taxones a
nivel de especie ya que muchas de ellas comparten el mismo sitio de corte para las
enzimas utilizadas. En este trabajo se combinaron los mtodos de T-RFLP y clonado
para obtenter mayor informacin de las comunidades estudiadas. Para ello se realizo el
clonado del gen en estudio (amoA, nirS, ARNr 16S) y se secuenciaron clones
representativos de cada perfil resultante del RFLP (con enzimas de restriccion). Para
correlacionar las secuencias obtenidas con los datos de T-RFLP, se calcul el tamao
esperado para los T-RFs a partir de las secuencias del gen
clonado (anlisis de
restriccin in silico)
La tcnica de T-RFLP se basa en el anlisis de patrones generados en una serie de pasos
que combinan PCR, digestin con enzimas de restriccin y electroforesis (Kitts, 2001).
El ADN extrado de la muestra ambiental es sometido a PCR utilizando primers
homlogos a regiones conservadas del gen de inters (ARNr 16S, amoA, nirS, etc.).
Uno de los primers se encuentra marcado en el extremo 5 con una molcula de
fluorforo. Luego de amplificar el gen de inters de toda la comunidad mediante PCR
44
se lleva a cabo la restriccin enzimtica. Las mismas digieren los amplicones en sitios
de reconocimiento especficos, habitualmente tetranucletidos.
Los fragmentos de restriccin resultantes son corridos luego en un gel de poliacrilamida
(el caso de este trabajo) o en capilares en un secuenciador de ADN con detector de
fluorescencia. De esta manera solo se visualizan los fragmentos terminales unidos al
fluorforo (Fig. 9).
PCR gen
especifica
con primer
foward
marcado
Restriccin con ER
Gel
Poliacrilamida
Cromatograma
B
DNA
ambiental
Gen amplificado de
los microorganismos
AyB
Figura 99
8:. Esquema que muestra el procedimiento del T-RFLP a partir de una muestra ambiental. Luego
de obtener el cromatograma se prosigue al anlisis de T-RFs, es decir a las posiciones de cada pico y a su
altura. Una cepa = Un T-RF = Un pico
Anlisis de Biodiversidad
45
48
49
El nmero de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que
resulta de esta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo.
La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y
en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se
siembra en cada serie de tubos (http://mail.fq.edu.uy/ microbio/)
Esta tcnica se utiliz para estimar el nmero de bacterias desnitrificantes, sin embargo
el NMP no es la concentracin absoluta de un determinado organismo, sino apenas una
estimacin estadstica de dicha concentracin. Para ello se utiliz un medio selectivo
(medio BCY acetato/nitrato, ANEXO 1) y se consider positivo el tubo con
crecimiento, viraje de color de la resarzurina (de fucsia a incoloro), y ausencia de NO2y NO3- segn el anlisis con el kit de bandas EM Quant (EM Quant Nitrate Test. EM
Science Gibbstown New Jersey 08027 Alemania). Los resultados se expresaron en
NMP de bacterias desnitrificantes/ml de muestra.
1.4.4 b. Recuento y aislamiento en placa de hetertrofos aerobios totales
lquido BCY acetato/nitrato en atmsfera de N2. Luego de su incubacin durante 2472hs se observ si hubo crecimiento (turbidez), si el indicador redox vir (de fuxia a
incoloro) y luego se llev a cabo la medida de consumo de NO2/NO3. Se consideran
positivos para la desnitrificacin los viales que presentan crecimiento, viraje de color de
la resarzurina (de fucsia a incoloro), y ausencia de NO2- y NO3-.
1.4.5 Medida de actividad desnitrificante
Existen algunas tcnicas para medir la actividad desnitrificante, de las cuales la mas
exacta y confiable se basa en la medida de N2O en el tiempo luego de incubar la
muestra en medio BCY acetato/nitrato en atmsfera con N2 y acetileno. Sin embargo,
debido a que no se cuenta con el equipamiento adecuado para ello, fue que se opt por
realizar la medida de actividad desnitrificante basada en la velocidad de desaparicin de
NO3-.
Como se ha explicado anteriormente, la reduccin de nitrato es catalizada por la enzima
nitrato reductasa. Esta enzima tambin se encuentra presente en algunos
microorganismos no desnitrificantes los cuales utilizan nitrato como fuente de N (The
Prokaryotes). Los microorganismos reportados con dicha capacidad, en condiciones
anxicas realizan el proceso de fermentacin. Para evitar que la medida de actividad
resulte enmascarada por esta causa se utiliza en el medio BCYacetato/nitrato una fuente
de carbono ya reportada como poco fermentable (muy oxidada) como lo es el acetato, y
se trabaja en condiciones de anoxia (atmsfera de N2). Es necesario medir la
concentracin de amonio al inicio y al final de la medida de actividad para descartar que
la desaparicin de NO3- sea causada por los microorganismos amonificantes.
51
52
Electrodo de O2
aireador
7.58 mgO2/ml
20C
cronometro
Agitacin
Figura 10
11: esquema del equipo utilizado para la medida de actividad potencial nitrificante y hetertrofa por el
mtodo respiromtrico
53
54
55
2. Objetivos
2.1 Objetivo general:
56
57
4. Materiales Y Mtodos
4.1 Reactores
1
2
58
59
Llenado anxico
anoxia
aireacin
sedimentacin
purga
vaciado
Ciclo I
a)
Ciclo II
00
11
33
76
89
109
11
Hours
10 12
Horas
b)
Ciclo I
0
10
11
12
Ciclo II
Horas
0
10
11
12
Horas
Figura 11. Esquema con las etapas y el tiempo de duracin en los ciclos de operacin del reactor F (a) y del
reactor M (b).
Tabla IV: a)Perturbaciones ocasionadas durante la operacin del lodo F. b) Perturbaciones ocasionadas durante la operacin del
lodo M.
a)
Tipo de perturbacin a)
Operacin normal
Reinoculacin con sedimento de laguna
Agregado de aliltiourea 0.69 uM
Agregado de aliltiourea 1.03 uM
Agregado de 4-Clorofenol 100mg/L
Cambio en la Ley de control
Reinoculacin con sedimento de laguna
b)
Dia de
operacin Etapa Tipo de perturbacin b)
0-71
I
Operacin normal
72-146
II
Agregado de polmero floculante
Aumento de carga orgnica (de 0.8 a 1.6
147-152
III
kgDQO/m3.d)
153-165
III
Reinoculacin con sedimento de laguna
166-190
III
Cambio en la Ley de control
191-494
IV
495--V
Da de
operacin Perodo
0-99
1
100-249
2
250-449
450--450---
Toma de muestras:
El muestreo fue llevado a cabo por purgado de lodo homogeneizado durante agitacin.
Las muestras destinadas a la medida de actividad se tomaron en la fase previa a la
alimentacin (fase final del ciclo) y se mantuvieron aireando durante 15-16hs. Las
muestras destinadas a recuento por FISH, extraccin de ADN, se tomaron en la misma
60
3
4
4
fase pero se mantuvieron a 4C hasta ser llevadas al laboratorio. Las muestras para
extraccin de ADN se mantuvieron congeladas a 20C hasta su procesamiento.
4.2 Medida de actividad potencial nitrificante y hetertrofa
61
I)
62
II)
III)
IV)
V)
VI)
Este valor corresponde a los 10 ml depositados por lo tanto para calcular gSSV/ml se
dividi el valor calculado entre 10. Este valor se utiliz para calcular la actividad del
lodo por gSSV.
Slidos suspendidos por clula
La determinacin de los slidos suspendidos totales (SST) y voltiles (SSV) fue llevada
a cabo con las cepas: Thauera sp. (bastn Gram negativo, cepa aislada en la Ctedra de
Microbiologa, Facultad de Qumica; Etchebehere y Tiedje; 2005), y la cepa F11
(bastn Gram positivo, proveniente del reactor F). Se utilizaron cultivos puros (en el
medio lquido TSB) de ambas cepas y se llev a cabo la medida de slidos suspendidos
totales y voltiles de un volumen conocido de cultivo (30 ml). Luego se realiz el
recuento microscpico luego de una tincin con DAPI de 10 ul de cultivo y se calcul
entonces el peso de SST y SSV por clula.
63
64
65
Se dej llegar a temperatura ambiente el lodo almacenado a 4C. Para extraer el lodo a
analizar se lo agit con agitador magntico bajo corriente de N2.
En el caso de este trabajo se tomaron 10ml de lodo (o el pellet de cultivo de cepas puras
para actividad especfica) y se agreg a un vial de 60 ml limpio y seco gaseado
previamente con N2. Se continu gaseando durante 5-10 min con N2.
Luego se le agreg agua destilada tal que completara un volumen de lquido final de 20
ml. El vial de agit bajo corriente de N2 durante 10 min, se cerr con un tapn de goma
y precinto. A continuacin se le agreg en forma simultnea y con agitacin contnua, 1
ml de KNO3 20 mM y 1ml de acetato de sodio 40 mM. Se tom nota de la hora y se
consider a este punto como tiempo = 0 min. Se tomaron muestras a distintos tiempos
(espaciadas 10-20 min. durante 1:30-2:00 hs de seguimiento). Luego se procedi a
medir nitrato y nitrito de las muestras. Para ello se utiliz un H.P.L.C (Shimadzu) con
columna de intercambio inico (Ic pack anion) y detector UV. Como fase mvil se
utiliz buffer fosfato pH 6.8. Se realiz una curva de calibracin con estndares de NO2y NO3- donde se analiz el cromatograma correlacionando el rea de cada pico con la
concentracin de cada compuesto. Se calcul el N-NO3- consumido por unidad de
tiempo (expresando actividad desnitrificante en ppm N-NO3-/da)
66
4.6 FISH
FIJACIN CON PFA (Gram negativos y algunos Gram positivos)
Reactivos y soluciones:
Buffer PBS 3 x (390 mM NaCl , buffer fosfato 30 mM pH 7.2-7.4)
Se prepar 1000 ml de buffer fosfato de sodio 0.5 M pH 7.2 - 7.4 mezclando 280 ml de
NaH2PO4 0.5 M, y 720 ml de Na2HPO4 0.5 M
Finalmente para 300 ml de PBS 3X se mezclaron 23.4 ml de NaCl 5M, 18.0 ml de
buffer fosfato de sodio 0.5M, y 258.6 ml de H2O
Solucin 4% PFA-PBS (para 100 ml)
1. Se calent en bao de agua 66 ml de agua destilada a 60C
2. Se agregaron 4g de paraformaldehido (con cuidado ya que los vapores son txicos)
y 100 uL de NaOH 10N. Se incub hasta disolver el PFA (no debe tomar mas de 1015 minutos).
3. Se agregaron 34 ml de PBS 3X, se enfri a 20C y se ajust el pH a 7.2 7.4 con
gotas de HCl 10 N.
4. Se almacen a 4C no mas de dos semanas o a -20C durante aprox. tres meses.
Tcnica de fijacin con PFA:
1. Se centrifug 1 volumen de clulas o suspensin de lodo (300 ul) a 7000 rpm
10min; se lav el pellet con 1X PBS y se centrifug nuevamente para luego
descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 X PBS (300 ul)
67
2.
68
Preparacin de DAPI
Se prepar una solucin de DAPI (diamino-fenil-indol) con agua nanopure para hacer
una solucin stock de 250 ug/ml. Se alicuot en eppendorf de 1 ml y almacen en
oscuridad a 20 C .
Para teir: se descongel una alcuota y se agregaron 9ml de agua miliQ para obtener
una solucin 25ug/ml. Se mantuvo fuera de la luz a 4C.
PROCEDIMIENTO DE HIBRIDACIN:
1. Se colocaron 5-10 ul de muestra fijada en cada posicin del porta y se sec al aire.
2. Se deshidrat con series de EtOH. Para ello se agreg 1 ml de EtOH 50 % y dej
reposar 3 minutos para deshidratar. Se repiti el procedimiento con EtOH 80 y
luego con EtOH 96 %. Luego se sec al aire.
3. Se descongel una alcuota de sonda de 50 ng/ul .
4. Se prepararon los tubos falcon de 50 ml para hibridacin con pauelo de papel
adentro como se indica en el siguiente esquema:
Tubo de 50 ml
Porta
Pauelo de papel
5. Se prepararon 2 ml de buffer de hibridacin por porta. Se colocaron 10 ul de buffer
de hibridacin por pozo y 1 ul de sonda (50 ng/ul).
6. Se utiliz el buffer de hibridacin excedente para humedecer el pauelo del tubo de
hibridacin.
69
70
Para llevar a cabo estas medidas se utilizaron las tcnicas de recuento por FISH, NMP,
respirometra, medida de slidos suspendidos voltiles y actividad desnitrificante.
Para ello se prepararon 500 ml de cultivo puro fresco (24hs) de las cepas F23, F25 y
F29. Se centrifug10 minutos a 6000 rpm. El pellet fue resuspendido en 200 ml de
buffer fosfato pH = 7 complementado con sales minerales (segn BCYacetato/nitrato).
El cultivo concentrado se utiliz para determinar la actividad respiromtrica, la
actividad desnitrificante, recuento de clulas activas y totales por FISH, y peso seco.
71
ADN del lodo: Se tom 1ml de cada muestra de lodo almacenada a 20C y se llev a
cabo la extraccin del ADN total de la comunidad bacteriana segn el protocolo de
extraccin del kit UltraClean Soil DNA Isolation (Mo Bio Laboratories, Catalog
#12800-100).
ADN de cepas puras: Se llev a cabo la extraccin de ADN de las cepas puras mediante
la tcnica de lisis alcalina: se agregan 100ul de NaOH 0.05M a 10ul de una suspensin
de clulas (102-107 bacterias); se incuba a 95C 15min; se centrfuga 2min a 12000rpm
y se almacena el sobrenadante (contiene el ADN).
4.12 T-RFLP (terminal restriction fragment lenght polymorphism)
72
73
74
Anlisis de cluster
Los datos obtenidos en el T-RFLP (abundancia relativa y tamao de T-RF) se agruparon
jerrquicamente mediante el anlisis de cluster. Los resultados se presentan en un
dendograma en el cual las muestras que tenan similitud entre s quedaron agrupadas
(formando clusters). Los dendogramas se construyeron a partir de la matriz de distancia
calculada en base a los ndices de similitud de Sorensen-Dice, y de Morisita. El ndice
Sorensen-Dice se seleccion como el ndice de similitud de presencia/ausencia mas
indicado para este tipo de comunidad ya que le da mayor peso a los casos de
coocurrencia que a los mismatches (ocurrencia en A y no en B, siendo A y B muestras
distintas). El ndice Morisita fue seleccionado como ndice de similitud cuantitativo ya
que ha sido el mas recomendado entre los mismos (Norbis, 2005).
Se utiliz el algoritmo (mtodo de agrupamiento) UPGMA que realiza la fusin de
muestras segn la distancia mnima promedio entre muestras y entre grupos, basado en
el promedio aritmtico de las distancias entre todos los miembros. Este es el algoritmo
mas recomendado en la bibliografa para realizar el anlisis de cluster (Kent y Coker,
1997).
Multidimensional Scaling (MDS)
El mtodo MDS ( Anlisis de escalado multidimensional) es un test no paramtrico que
trabaja con rangos (transforma la matriz en rangos) a diferencia del PCA que trabaja con
espacios euclideanos. La tcnica de "multidimensional scaling" est diseada para
construir un mapa a partir de la matriz de distancia entre muestras y presenta las
relaciones entre los objetos dando solo una tabla de distancias entre ellos. El mapa
puede ser en una dimensin (si los objetos se presentan en una lnea), en dos
dimensiones (en un plano), en tres dimensiones (representando los puntos en el
75
Se realiz la amplificacin por PCR del gen a clonar (amoA, ARNr 16S, nirS. ANEXO
4) a partir del ADN total de la muestra de lodo. Luego se llev a cabo el procedimiento
de clonado utilizando el vector de clonado 4-PCR TopoTA (Fig. 12) y cllulas de la
cepa de E. coli Top10 segn el manual del kit de clonado (TOPO TA Cloning Kit for
Sequencing. Invitrogen Catalog n K4580-01).
Luego de la seleccin de clones en placa de LB Ampicilina-Kanamicina realiz la
amplificacin del inserto de ADN utilizando los primers T3 y T7 del kit. Se
seleccionaron los clones con el inserto de tamao esperado. Se llev a cabo el
tratamiento con enzimas de restriccin de los clones (RFLP, Restriction Fragment
Length Polymorphism) con las enzimas HhaI y HaeIII (para clones ARNr 16S y nirS),
enzimas CfoI y TaqI (para clones amoA). Se agruparon los clones con el mismo perfil
de restriccin. Se seleccionaron clones representativos de cada perfil y se secuenciaron
los insertos para su identificacin.
77
78
5. Resultados y Discusin
5.1 CAPITULO 1
Reactor F
79
80
Se observ que la velocidad oxidante de amonio sigue una cintica tipo MichaelisMenten. La concentracin de saturacin determinada fue de aproximadamente 11 ppm
N-NH4+, aunque luego la actividad disminuy y volvi a aumentar con 60 ppm N-NH4+
(Fig. 13). El valor de saturacin para el amonio que se encuentra en la bibliografa es de
15 ppm N-NH4+ (Gorska et al., 1996).
La composicin microbiana de cada lodo influye en este valor, ya que diferentes
especies de AOB tienen distinta afinidad por el amonio. Por lo tanto se debera
determinar la concentracin saturante de amonio para cada lodo. Las concentraciones de
amonio mayores a 200 ppm podran inhibir la flora nitrificante. Debido a las razones
mencionadas anteriormente se estableci 60 ppm N-NH4+como concentracin a utilizar
en los ensayos de actividad potencial ya que se verific que era saturante.
La oxidacin del acetato sigui una cintica del mismo tipo, donde se verific que la
concentracin de DQO agregada (200 ppm DQO-acetato) era saturante para ese lodo.
No se determin la concentracin de saturacin de nitrito. La concentracin utilizada
para el ensayo de actividad oxidante de nitrito fue 10 ppmN-NO2- sugerida por los
mtodos de anlisis del proyecto EOLI y por la bibliografa (Cabezas, 2005).
Acetato
0,060
0,025
0,050
Actividad
(mgO2/ml* h)
Actividad
(mgO2/ml*h)
Amoni o
0,030
0,020
0,015
0,010
0,005
0,000
0
50
100
150
N-NH4 (ppm)
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
0
100
200
300
DQO (ppm)
Figura 13. Curvas de saturacin de amonio y acetato para el lodo F. Para el ensayo de actividad potencial se
utilizaron 60 ppm de N-NH4+ y 200 ppm de DQO-acetato
81
400
durante
la
reinoculacin
ingresaron
microorganismos
activos
83
Etapa II
Tiempo (das)
AOB
643
593
558
530
502
419
Etapa V
314
273
Etapa IV
202
166
146
126
104
97
89
75
64
48
Etapa
III
222
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Actividad (mgO2/gSSV.d)
NOB
Etapa I
2500
Etapa
III
Etapa II
Etapa IV
Etapa V
2000
1500
1000
500
Tiempo (das)
643
593
558
530
502
419
314
273
222
202
166
146
126
104
97
89
75
64
48
Actividad (mgO2/gSSV.d)
COB
Hetertrofa
Figura 14. Actividad potencial vs tiempo de operacin del reactor F. A: actividad nitrificante de AOB y
NOB; B: actividad hetertrofa. Se indican las cinco etapas del periodo de operacin del sistema.
La aplicacin del nuevo ciclo de operacin, con cambios en los tiempos de cada ciclo,
(Etapa IV) favoreci la actividad hetertrofa en cuanto al valor de la media (631
mgO2/gSSV.d, Tabla V) con respecto a la etapa anterior. Sin embargo, dentro de esta
etapa se podran distinguir dos subetapas. La primera (SE1) que corresponde al perodo
entre el da 191 hasta el da 273 y la segunda (SE2) a partir del da 273 hasta el da 335
aproximadamente. En la SE1 se observ una pendiente positiva (pendiente = + 12,675)
lo que indic una fuerte tendencia al aumento de actividad. Debido a que las bacterias
desnitrificantes en general tienen tambin la capacidad de oxidar acetato utilizando
84
oxgeno como aceptor final de electrones, es de esperar que la biomasa hetertrofa este
compuesta por bacterias desnitrificantes y bacterias que oxidan acetato solamente en
condiciones aerobias. Se podra suponer entonces, que en esta subetapa la disminucin
del tiempo de aireacin favoreci la flora desnitrificante hetertrofa. Por lo tanto el
aumento de la actividad hetertrofa de la SE1 podra corresponder a dicho grupo
bacteriano.
Sin embargo en la SE2 se observ una notable disminucin de la actividad,
observndose una pendiente negativa (pendiente = -9,9592) y luego del da 335 las
medidas de actividad resultaron muy variables hasta el final de la etapa. Estas
variaciones podran deberse a factores externos (por ejemplo a fallas del sistema de
control del reactor, entrada de txicos en el influente proveniente de la laguna
anaerobia) o internos (cambios en la estructura de la comunidad por sucesin natural de
especies, etc.) que no pudieron comprobarse pero no se deben descartar.
Por otro lado, se observ una leve disminucin en la pendiente de la actividad oxidante
de nitrito en la etapa IV la que continu disminuyendo durante la etapa V. Sugiriendo
que la disminucin de la duracin de la etapa aerobia pudo afectar negativamente a las
NOB. De todas formas para la eficiencia de remocin de nutrientes esto no sera un
problema, ya que la oxidacin de amonio a nitrito permaneci activa, y la etapa de
desnitrificacin podra darse va nitrito (Mulder y Kempen, 1997; Kempen et al., 2001)
85
Etapa V
18
320
198
0
599
Etapa V
18
38
31
0
117
Etapa V
18
759
362
107
1348
86
Sin embargo, la actividad oxidante de amonio (que present correlacin con la actividad
oxidante de nitrito) no reflej los cambios en la eficiencia de remocin de N-NH4+ y Nt.
Es decir que a pesar de que la actividad potencial vari durante todo el monitoreo, el
porcentaje de eficiencia de remocin de nitrgeno se mantuvo alto y estable. Esto podra
deberse a el hecho de que la actividad medida es potencial, es decir la velocidad
Tabla VI: matriz de correlacin entre la actividad potencial respiromtrica y la eficiencia de
remocin del reactor.
Triangulo superior: probabilidad de que las columnas NO esten
correlacionadas. Triangulo inferior: Valores de correlacion r de Pearson's. Pearsons =1 hay
correlacion. alfa = 0,05. DQO= eficiencia de remocin de DQO; Nt= Eficiencia de remocin de Nt;
N-NH4= eficiencia de remocin de amonio.
mxima que tiene el lodo en condiciones ptimas. Por lo tanto podra ocurrir que an
cuando la actividad potencial es mnima, la misma es suficiente para remover el 100 %
del nitrgeno que ingresa en el influente.
Tabla VI. Matriz de correlacin entre la actividad potencial respiromtrica y la eficiencia de remocin del
reactor. Triangulo superior: probabilidad de que las columnas NO estn correlacionadas. Triangulo inferior:
Valores de correlacin r de Pearson's. Pearsons =1 existe correlacin. alfa = 0,05.
DQO= eficiencia de remocin de DQO (t = total y s = soluble); Nt= Eficiencia de remocin de Nt; N-NH4=
eficiencia de remocin de amonio; AOB: actividad oxidante de amonio, NOB: actividad oxidante de nitrito;
Acetato: actividad hetertrofa.
Para demostrar esta hiptesis se procedi a expresar los datos de actividad nitrificante
en mgN-NH4+/hora y calcular la mnima concentracin de amonio que pudo remover el
reactor F en cada ciclo.
87
88
Se llev a cabo el mismo razonamiento pero para calcular el oxgeno requerido para
oxidar el amonio hasta nitrato, es decir para la nitrificacin completa.
3H2O + NH3 NO3- + 9H+ + 8e2x (4e- + 4H+ + O2 2H2O)
3 H2O + NH3 + 8H+ + 2 O2 NO3- + 9H+ + 4 H2O
Simplificando la ecuacin anterior se llega a la siguiente reaccin:
NH3 + 2 O2 NO3- + H+ + H2O
Por lo tanto en este caso para oxidar un mol de NH3 (14g) se necesitan dos moles de O2
(64g), lo que significa que el factor de conversin de mgO2 a mgN-NH4 consumidos en
la oxidacin del amonio hasta nitrato es: 64gO2/14gN-NH3 = 4,57 gO2/gN-NH3
De la misma forma que se explic anteriormente se encontr en la bibliografa el factor
de conversin 4,25 gO2/gN-NH3 que toma en cuenta el carbono inorgnico utilizado por
las bacterias AOB y NOB auttrofas para su crecimiento (Henze et al., 1997). Estos
factores tambin fueron utilizados para transformar los valores de actividad en mgNNH4 consumidos en el tiempo por unidad de biomasa a modo de comparar resultados.
Se transformaron los valores de la media, los mnimos y los mximos de actividad
oxidante de amonio y de actividad nitrificante (la suma de los valores de actividad
oxidante de amonio y oxidante de nitrito) para cada etapa utilizando los factores
descritos anteriormente (Tabla VII). Se calcul la actividad por hora, para calcular la
capacidad potencial de remocin de N-NH4+ por unidad de volumen de lodo,
considerando el tiempo de aireacin por ciclo ya que la reaccin planteada es aerobia.
89
Tabla VII: datos de actividad potencial oxidante de amonio y nitrificante transformados a desde
mgO2/gSSV.dia a mgNNH4+/L.hora
DATOS TRANSFORMADOS tomando en cuenta Cinorg
Media
Mnimo
Mximo
Etapa I
6840
352
18135
mgN-NH4/L.hora
Actividad oxidante de amonio
Actividad nitrificante (suma AOB y NOB)
Etapa II
Etapa III Etapa IV Etapa V
Etapa I
Etapa II Etapa III Etapa IV Etapa V
7829
4625
3900
6175
6661
8113
5305
4440
5262
4739
3881
0
0
269
4064
4198
0
0
11474
6879
6676
11550
18151
13235
7281
8088
10532
Media
Mnimo
Mximo
Etapa I
6461
333
17130
mgN-NH4/L.hora
Actividad oxidante de amonio
Actividad nitrificante (suma AOB y NOB)
Etapa II
Etapa III Etapa IV Etapa V
Etapa I
Etapa II Etapa III Etapa IV Etapa V
7396
4369
3684
5833
6194
7545
4933
4129
4893
4476
3666
0
0
250
3780
3904
0
0
10839
6498
6306
10910
16880
12308
6772
7522
9794
90
Es decir que con la actividad potencial mnima registrada durante todo el monitoreo, se
necesitaran (332mgN-NH4+/3750mgN-NH4+/h) 0,0885 horas de aireacin por cada
ciclo (aproximadamente 5,3 minutos) para remover el 100% de la carga de amonio.
Probablemente es por ello que las variaciones de actividad potencial nitrificante no se
reflejaron en los valores de eficiencia de remocin de NH4+ y Nt en el reactor, donde a
pesar que la actividad potencial baj en algunos momentos igualmente fue suficiente
para remover la carga de amonio que ingresaba al reactor.
Sin embargo el tiempo de remocin total (5,3 min.) podra no ser exactamente el
calculado, ya que el clculo se basa en medidas que corresponden a la velocidad
mxima (actividad potencial) que supone condiciones ptimas (temperatura, pH,
concentracin de sustratos, etc), que probablemente no fueran las condiciones reales del
reactor. Segn los datos obtenidos por medidas directas en el reactor (suministrados por
Departamento de Ingeniera de Reactores de la Facultad de Ingeniera-UDELAR) la
remocin completa de amonio ocurri habitualmente en las primeras 1 a 1,5 horas
durante el perodo de aireacin de cada ciclo. Este tiempo fue mayor al calculado a
pesar de que la concentracin de amonio en el reactor fue superior a la de saturacin
(aproximadamente 22 ppm N-NH4+ luego de agregar 4L de influente en 15L de
volumen final) y las condiciones de pH y temperatura fueron las ptimas. Pero, a pesar
de que el oxgeno disuelto (OD) se mantuvo en una concentracin mayor a 3mgO2/L
(de acuerdo a las medidas dentro del rector), pudo ocurrir que la transferencia de
oxgeno a toda la biomasa fuera insuficiente. Cuanto mayor es el volumen del reactor,
mas difcil es lograr una aireacin homognea, por lo que el oxgeno pudo no haber
llegado a parte de la biomasa (por ejemplo la que se encuentra en el interior de cmulos
de bacterias). La deficiencia en la transferencia de oxgeno podra disminuir la
velocidad de oxidacin, en este caso de amonio.
91
Con los valores calculados se sigui otra lnea de razonamiento planteando una nueva
pregunta: con la actividad potencial nitrificante mnima registrada, cual sera la
mnima carga de amonio que puede remover el reactor en cada ciclo si las
condiciones del reactor fuesen ptimas?. La pregunta esta enfocada a evaluar la carga
que soportara el reactor en caso de aumentar el amonio en el influente.
Esta pregunta podra responderse con el siguiente clculo:
Si la remocin potencial mnima de amonio fue de 3750 mgN-NH4+/hora en 15 L, en las
3 horas de aireacin por ciclo se podra remover 11250 mgN-NH4+/ciclo. Tericamente,
esta sera la mnima carga de amonio que el reactor podra remover en cada ciclo (ciclo
tipo II). Como se aliment el reactor con 4 L de influente, el mismo podra haber
contenido 2812 mgN-NH4+/L.
Cabe destacar que a pesar de tratarse de clculos realizados en base a resultados
experimentales, por el hecho de tratarse de procesos biolgicos con interacciones que
an se desconocen, los valores de carga calculados deberan confirmarse
experimentalmente en el reactor.
5.1.2. Actividad desnitrificante del reactor F
92
10000
2000
9000
heterotrofa
1600
8000
desnitrificante
1400
7000
1200
6000
1000
5000
800
4000
600
3000
400
2000
200
1000
Actividad desnitrificante:
umoles NO3/gSSV.dia
Actividad heterotrofa:
mgO2/gSSV.dia
1800
427
447
496
502
509 516
530 537
Tiempo (dias de operacin)
543
552
Figura 15. Grfica de actividad desnitrificante (tringulos) y actividad hetertrofa (crculos) vs tiempo.
93
Sin embargo, solo por que exista una buena correlacin no se puede afirmar que la
mayora de la flora hetertrofa este compuesta por bacterias desnitrificantes. Esta
correlacin podra deberse a la presencia de flora hetertrofa no desnitrificante que siga
la misma tendencia que la flora desnitrificante o a que el ensayo de actividad en las
condiciones que se realiza (utilizando acetato como dador de electrones) no detecte
otros microorganismos hetertrofos aerobios presentes en el reactor que no utilicen
acetato
5.1.3. Recuento por FISH
Se seleccionaron siete muestras tomadas en las diferentes etapas del reactor para
monitorear la comunidad microbiana mediante FISH (tomadas en los das 35, 64, 89,
103, 126, 146, y 216).
Los resultados de FISH revelaron un bajo porcentaje (entre 30 a 60 %) de clulas que
hibridaron con la sonda dirigida al dominio Bacteria (Eub338) con respecto al total de
bacterias teidas con DAPI. Indicando que el nmero de bacterias detectadas representa
solo una pequea fraccin de los SSV de la biomasa del lodo (Fig. 16). De todas
formas, cabe destacar que el total de bacterias result tres ordenes de magnitud mayor
que los grupos analizados con sondas especficas.
1,E+10
EUB338
1,E+09
1,E+08
Nso1225
1,E+07
1,E+06
Nit3
1,E+05
1,E+04
1,E+03
Ntspa662
1,E+02
1,E+01
Arch915
1,E+00
35
64
89
103
126
146
216
Figura 16. Grfico que indica el monitoreo por FISH (nmero de clulas por unidad de biomasa) de
los grupos microbianos: Bacteria (sonda EUB338),
oxidantes de amonio (sonda Nso1225),
94
oxidantes de nitrito (sondas Nit3 Nitrobacter spp. y Ntspa662 Nitrospira spp.), Archaea (sonda
Arch915). Para los dias 35 y 216 no se realizaron recuentos con Ntspa662 y Arch915
respectivamente.
Durante todo el monitoreo se detect bacterias que hibridaron con la sonda dirigida a las
bacterias oxidantes de amonio dentro del grupo beta-Proteobacteria (Nso1225) que se
agrupaban formando cmulos (Fig. 16). Estos resultados sugieren que la poblacin de
AOB se mantuvo dentro del reactor durante toda la operacin. Las bacterias que
hibridaron con la sonda dirigida al gnero Nitrobacter (oxidante de nitrito, sonda Nit3)
tambin se mantuvieron en la misma proporcin a lo largo de la operacin, sin embargo
solo fueron detectadas bacterias que hibridaron con la sonda dirigida al gnero
Nitrospira (oxidante de nitrito, sonda Ntspa 662) a partir del da 103. Esto podra
deberse al ingreso de bacterias de este gnero en el lodo de la laguna con que se
reinocul el reactor. Por lo tanto, la actividad oxidante de nitrito de los primeros 100
das de operacin se podra deber exclusivamente a bacterias del gnero Nitrobacter.
Durante todo el monitoreo se detect clulas que hibridaron con la sonda dirigida al
Dominio Archaea (sonda Arch915) (Fig. 16).
Relacin entre la actividad y FISH
Al analizar el nmero de AOB y NOB por FISH y la actividad potencial nitrificante se
observ que los cambios en la actividad no eran reflejados en el conteo por FISH
realizado (Fig. 17). Esto se demostr realizando el anlisis de correlacin, donde la
probabilidad de que ambos resultados no estuvieran correlacionados fue mayor a 0,05
(con alfa = 0,05) (Tabla VIII). Esto podra deberse a dos razones principales. Una de
ellas podra ser la subestimacin de bacterias nitrificantes debido a la dificultad en el
recuento de clulas dentro del flculo nitrificante ya que se trata de una estructura
tridimensional observada superficialmente. Ya ha sido reportado un mecanismo
estimativo para calcular el volumen del flculo y el volumen celular. A partir de ello se
95
podra calcular el nmero de bacterias (Manser et al., 2005). Sin embargo, este
mecanismo no es apropiado para lodos con grnulos densos e irregulares
La falta de correlacin entre los resultados de FISH y la actividad tambin podra
deberse a la presencia de microorganismos activos en el lodo que no son abarcados con
las sondas seleccionadas para el FISH (obteniendo valores menores a los esperados). En
este caso se estaran subestimando los microorganismos activos podran an no estar
descriptos o pertenecer a especies descriptas pero no abarcadas por las sondas
utilizadas. Un ejemplo de ello son las Archaeas recientemente reportadas como
organismos capaces de llevar a cabo la nitrificacin, posiblemente con un rol importante
en ecosistemas terrestres y marinos las cuales no estn abarcadas por la sonda (Park et.
al., 2006; Nicol y Schleper, 2006). Esto podra ser una explicacin del alto numero de
Archaeas detectadas por FISH durante todo el monitoreo (sonda Arch915;Fig. 4)
Por otro lado, la herramienta FISH podra sobreestimar el nmero de clulas activas en
algunos casos. Por ejemplo debido a la presencia de microorganismos no activos que
conservan sus ribosomas y que por lo tanto son detectados por FISH y no por
respirometra. Esto ya ha sido reportado para algunas bacterias oxidantes de amonio
(Schramm et al., 1999).
Tabla VIII. Anlisis de correlacin entre la actividad potencial nitrificante y el
conteo de AOB y NOB por FISH entre los das de operacin 13 y 146 del lodo
F. p(uncorr) = probabilidad de que no exista correlacin con alfa = 0.05
Actividad potencial
Actividad AOB
Actividad NOB
Actividad AOB
Actividad NOB
FISH
Nso1225
Nso1225
Nit3
Nit3
p (uncorr)
0.08
0.35
0.98
0.85
4.E+10
3.E+10
3.E+10
2.E+10
2.E+10
1.E+10
5.E+09
0.E+00
1000
800
96
600
400
200
0
Actividad
potencial
(mgO2/gSSV.da)
nmero de
clulas (n/gSSV)
sin Cinorg
Tiempo
das
mgN-NH4/cel*da mgN-NH4/cel*da
35
64
89
103
126
146
216
Promedio
8.1.E-06
1.7.E-05
4.6.E-05
3.4.E-05
8.0.E-05
3.4.E-05
9.8.E-06
3.3.E-05
7.6.E-06
1.6.E-05
4.4.E-05
3.3.E-05
7.5.E-05
3.2.E-05
9.2.E-06
3.1.E-05
Los resultados de actividad oxidante de amonio calculada por clula en base al conteo
de AOB mediante FISH y la actividad respiromtrica fue notoriamente mayor a los
valores reportados en la bibliografa (3.0 x10-10 a 1.0 x10-8 mgN-NH4/cl*da Feray,
97
98
Tabla X. Cepas hetertrofas aerobias aisladas en medio TSA a partir del lodo F. B= Bastones; ch =
Aislamientos en TSA
chicos; C = cocos; CB = cocobacilos, Cat. = catalasa; Ox. = oxidasa; desn. = desnitrifica segn la
Gram Cat. Ox. Desn.
Dia cepa
medida de consumo de NO3-. Igual color = igual morfologa. Se seala el da de operacin del reactor
F9
correspondiente al aislamiento.
F10
419
427
446
558
574
F11
F12
F13
F14
F15
F16
F17
F18
F19
F20
F21
F22
F23
F24
F25
F26
F27
F28
F29
F30
F32
BB ch +
B+
B ch B+
BB+
CBch BBCB BBBBB+
BBBBBch B-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
- 99
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Si
no
no
Si
no
no
no
no
no
Si
no
no
no
no
Si
Si
Si
Si
Si
no
Si
no
no
100
mendocina
CP000680;
Pseudomonas
fluorescens
CP000094;
y O. trictici
(AY972348).
Se determin tambin la secuencia del gen de nitrito reductasa (nirK) de las cepas F24 y
F26 (Fig. 18), los cuales presentaron 99% de similitud con secuencias depositadas de
101
nirK
102
Mediante el anlisis con la enzima MspI se detectaron 11 T-RFs en total a lo largo del
monitoreo (Fig. 20b) presentando mayor variacin en el tiempo que lo ocurrido en el
anlisis con la enzima HhaI. Sin embargo, en este caso tambin se observ la presencia
grupos dominantes presentes en casi todo el monitoreo como los T-RFs 169, 143, 140 y
101.
La flora desnitrificante se identific mediante el anlisis filogentico de secuencias
obtenidas de una biblioteca de genes nirS (cd1-nitrito reductasa) a partir del ADN de la
muestra del da 103. Se seleccionaron 31 clones para ser secuenciados de los cuales se
obtuvo una buena secuencia (en cuanto a tamao y calidad) de 14 clones. Las
secuencias de nirS obtenidas se relacionaron filogenticamente con secuencias de nirS
de especies de los gneros Thauera, Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Paracoccus,
y Dechloromonas (Fig. 21) .
Se compararon las secuencias de nirS obtenidas a partir de la biblioteca de nirS (clones
de nirS) y las obtenidas utilizando el portal NCBI (con el banco Gen Bank) con los
picos obtenidos en el anlisis de T-RFLP mediante el anlisis in slico de las
secuencias con enzimas restriccin . Se logr asignar identidad a 4 picos del T-RFLPnirS (anlisis con la enzima HhaI) y 5 picos con la enzima MspI (Tabla XI) con una
tolerancia 5 pb (en algunos trabajos previos se haba sugerido un rango de tolerancia de
1,5 a 5,1 pb; Hoshino et al., 2005; Rich et al., 2003). Los resultados indicaron que los
gneros mencionados anteriormente fueron los dominantes y permanecieron en el
reactor durante todo el monitoreo.
103
nirS Hha I
283
274
240
80%
60%
111
40%
109
72
20%
57
40
0%
64
89
103
126
146
nirS Msp I
100%
T-RF (% abundancia
relativa)
T-RF (% abundancia
relativa)
100%
80%
60%
40%
20%
0%
35
216
Tiempo (das)
64
89
103
126
146
166
216
171
169
143
140
136
111
108
103
101
98
72
Tiempo (das)
Figura 20. Anlisis por T-RFLP del gen nirS de las muestras del lodo F durante 216 das de operacin, con la
enzima HhaI (A) y MspI (B). Un color = 1 T-RF
104
A partir de los datos de T-RFLP del gen nirS se analiz el efecto de las perturbaciones
ocasionadas en la diversidad de microorganismos desnitrificantes del reactor. Todas las
muestras presentaron un ndice de diversidad H mayor al 80% de la diversidad mxima
posible (Hmax) de acuerdo al nmero de especies presentes, excepto la muestra del da
126 que present un 70 % de la diversidad mxima posible teniendo en cuenta todo el
monitoreo. Adems, esta muestra present los valores ms bajos de diversidad (de
Simpson y Shannon) teniendo en cuenta los resultados con ambas enzimas HhaI y MspI
(Tabla XII).
Tabla XI. Comparacin entre los T-RFs predominantes en el T-RFLP y los T-RFs
predichos a partir del anlisis in slico de las secuencias de nirS obtenidas a partir
de la biblioteca de nirS del lodo F y de las secuencias depositadas en el banco de
secuencias Gen Bank Los valores estn expresados en pares de bases (pb)
Tamao calculado de T-RF*
45
45
70
70
112
112
112
112
112
112
112
112
112
112
163
304
330
355
441
105
39
39
100
100
174
145
103
100
100
100
100
100
100
146
100
103
103
100
142
T-RF en el T-RFLP
T-RF asignado
HhaI
MspI
40
40
72
72
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
109-111
ninguno
ninguno
ninguno
ninguno
ninguno
ninguno
ninguno
101-103
101-103
171
140-143
103
101-103
101-103
101-103
101-103
101-103
101-103
143
101-103
101-103
101-103
101-103
140-143
TABLA XII. Clculo de los ndices de diversidad de las muestras del lodo F para los das
de operacin 35, 64, 89, 103, 126, 146, 166, y 216 a partir del anlisis del T-RFLP nirS
con HhaI (A), MspI (B) y del anlisis conjunto de ambas enzimas (C). Las muestras
correspondientes a los das 35 y 166 no pudieron analizarse con la enzima HhaI debido a
problemas con la electroforesis del T-RFLP.
Taxa S
Individuals
Dominance D
Shannon H
Simpson 1-D
Evenness e^H/S
B
Taxa_S
Individuals
Dominance_D
Shannon_H
Simpson_1-D
Evenness_e^H/S
C
Taxa_S
Individuals
Dominance_D
Shannon_H
Simpson_1-D
Evenness_e^H/S
Hmax
H/Hmax*100
89
7
1211
0.18
1.81
0.82
0.87
103
8
1268
0.17
1.90
0.83
0.83
126
5
1182
0.40
1.19
0.60
0.66
146
6
1243
0.23
1.58
0.77
0.81
216
5
1269
0.29
1.39
0.71
0.80
64
89
103
126
146
166
216
3
519
0.42
0.96
0.58
0.87
5
635
0.31
1.36
0.69
0.78
4
566
0.32
1.26
0.68
0.88
4
584
0.42
1.10
0.58
0.75
3
616
0.42
0.94
0.58
0.86
3
643
0.36
1.05
0.64
0.96
5
746
0.26
1.45
0.74
0.85
4
750
0.31
1.26
0.69
0.88
146 166
9
1886
0.14
2.04
0.86
0.86
2.48
82
216
9
2019
0.16
2.00
0.84
0.82
2.48
81
64
12
1836
0.13
2.25
0.87
0.79
2.48
91
89
11
1777
0.12
2.26
0.88
0.87
2.48
91
106
103
12
1852
0.12
2.27
0.88
0.81
2.48
91
126
8
1798
0.22
1.75
0.78
0.72
2.48
70
91
54
CAB76777marine pA33
52
63
F62
CAD29811 cyanobacterial bloom BS1279
CAD29818 cyanobacterial bloom BS1295
CAB76791marine pB76
ABA70964 coastal aquifer
CAH18786 marine AC100-13
CAD29352 estuarine sediment
AF197466Pseudomonas fluorescens
99
CAJ76741Pseudomonas aeruginosa
CAH18841 marine IC200-129
ABA70922 coastal aquifer
YP 157499Azoarcus sp. EbN1
99
AAL86937Thauera mechernichensis
CAA12214Roseobacter denitrificans
62
98
97
99
F5-ABB04151
F43
64
CAC03621Paracoccus pantotrophus
CAJ76797Paracoccus denitrificans
99
88
AAA93118Paracoccus denitrificans
CAJ76740Cupriavidus necator
ABA70919 coastal aquifer
BAE45629Hydrogenobacter thermophilus
BAD34484 phosphate wwt clone
72
CAA12215Azospirillum brasilense
F42-ABB04156
65
82
71
99
F87-ABB04162
F88
69
F18-ABB04153
99
97
69
F3-ABB04150
70
F69-ABB04160
F94-ABB04164
97
58
AAL86939Azoarcus toluvorans
AAL86938Azoarcus evansii
60
AAZ43111Pseudomonas stutzeri
88
65 93
54
98
AAZ25602Colwellia psychrerythraea
97
107
0.2
Figura 21. rbol filogentico construido a partir de secuencias parciales de 119 aminocidos del gen nirS
basado en el anlisis neighbor-joining con el modelo matricial de Dayhoff. Barra = diferencia de 20
Por otra parte se realizaron anlisis multivariados a partir de los resultados de ambas
enzimas con el programa PAST (Hammer et al., 2006). El objetivo fue obtener el grado
de similitud entre las muestras y poder explicar las variaciones en la comunidad
microbiana (si las hay) con los cambios ocasionados durante la operacin (variables
externas) o conocer simplemente si se debi a que las muestras poseen autocorrelacin
temporal (es difcil lograr independencia temporal ya que se trata de organismos vivos y
el tiempo podra ser un factor de diferenciacin en la comunidad). Para ello se utilizaron
tres metodologas: el anlisis de cluster, el anlisis de escalado multidimensional
108
0.9
0.9
89
146
126
216
75
60
0.8
52
0.8
29
47
0.7
27
27
0.6
14
100
0.5
0.2
89
35
64
126
216
146
103
166
1
50
0.9
50
89
0.2
35
0.3
216
0.3
103
0.4
64
0.4
146
0.5
126
0.6
100
Similarity
Similarity
0.7
64
103
89
146
126
103
B1
166
64
216
fueron tiles para representar los cambios en la comunidad en el tiempo (Fig. 22).
0.9
10
0.8
0.8
44
0.7
0.7
80
0.6
S imilarity
Similarity
0.6
0.5
0.5
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
97
0.1
0.1
100
1
Figura 22. Anlisis de cluster de las muestras del reactor F utilizando el mtodo de agrupamiento UPGMA
(Paired Group) y los ndices de similitud Morisita (A y C) y Dice-Sorensen (B y D). Se indican los valores
de boostrap para 100 replicados excepto en C por exceso de datos con valor cero. Anlisis conjunto de los
resultados del T-RFLP nirS con ambas enzimas (HhaI y MspI) (A y B); y con la enzima MspI por separado
(C y D)
109
0.4
B
0.3
216
0.3
103
0.2
0.2
89
146
0
103
-0.1
126
89
Coordinate 2
Coordinate 2
0.1
0.1
126
146
0
-0.1
-0.2
216
-0.2
-0.3
64
-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
Coordinate 1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Figura 23. Mapas non metric MDS a partir de la matriz de similitud calculada con los dices de DiceSorensen con in valor de stress de Shepard = 0,184 (A) y Morisita con un valor de stress de Shepard = 0,1796
(B). Resultados del T-RFLP nirS con las enzimas HhaI y MspI.
El mtodo MDS que result con mejor definicin (Valor de Stress 0,14) fue el realizado
en base a la matriz de distancia calculada a partir del ndice de similitud de presencia
ausencia Dice-Srensen.
En base a la matriz calculada para las dos enzimas con el ndice de similitud de
Sorensen-Dice (Tabla XIV), se observ que todas las muestras presentaron mas de un
70% de similitud entre si. La muestra del da 89 fue la que present mayor distancia con
las dems (30% de distancia aproximadamente). Las muestras del da 64 y 103
comparten aproximadamente el 90% de las especies al igual que lo que ocurre entre las
110
111
Etapa I, segn el componente 1). Sin embargo a las muestras 126, 146, 64, 103, y 216 se
dividieron en dos grupos segn el componente 2 el cual explic el 27,4% de la varianza
y segn el componente 3 que explic un 21,2%. Estos componentes difcilmente se
encuentren relacionados con el cambio en la ley de control ya que la muestra 216 (Etapa
IV) no se diferenci notoriamente de las muestras de etapas anteriores (Fig. 24).
Tabla XV. Valores propios de la matriz de correlacin para cada
componente y porcentaje de varianza total explicada por cada uno de
los 15 componentes principales. Resultados del T-RFLP nirS con las
enzimas HhaI y MspI del lodo F. Valor Propio = Eigenvalue
Componente
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Valor Propio
5.18
4.09
3.16
1.37
1.13
5.3E-16
4.6E-16
3.4E-16
1.0E-16
5.6E-17
-3.1E-17
-2.7E-16
-3.3E-16
-4.7E-16
-1.1E-15
Promedio
0.996
% Varianza
34.70
27.41
21.16
9.16
7.56
3.5E-15
3.1E-15
2.3E-15
6.9E-16
3.8E-16
-2.1E-16
-1.8E-15
-2.2E-15
-3.1E-15
-7.3E-15
SUMA
100.00
Figura 24. Grficos que representan las distancias entre muestras segn los componentes 1 y 2
(izquierda), 1 y 3 (derecha) a partir del anlisis por T-RFLP del gen nirS HhaI y MspI basado en la
matriz de correlacin.
113
amoC
amoA
amoB
fluorocromo
491 bp
amoA
48bp
219bp
283bp
Figura 25. A. Fotografa de gel agarosa 0,8%. Amplificacin por PCR del gen amoA de las muestras 35, 64,
89, 103, 126, 146, control negativo y marcador de peso molecular 1Kb leader. B. Esquema del gen amoA de
codificante de la subunidad A de la enzima AMO y ejemplos de los sitios terminales de corte con TaqI para
distintas especies de AOB.
114
Los T-RFs predominantes en el anlisis con la enzima TaqI fueron los correspondientes
a los tamaos 219pb y 283pb (Fig. 26). Estos picos se corresponden con el tamao
esperado a partir anlisis in slico de secuencias de amoA (depositadas en el banco de
portal NCBI) provenientes de organismos del cluster de Nitrosomonas europaea
(219bp) y del cluster Nitrosospira/ Nitrosovibrio (283bp) (Tabla XVI). Sin embargo, a
partir del da 146 el T-RF con TaqI correspondiente a secuencias de amoA posicionadas
en el cluster de Nitrosomonas europaea no fue detectado. Esto podra sugerir que se
habran seleccionado organismos nitrificantes diferentes a pesar de que su nmero no
present variaciones de acuerdo a la cuantificacin por FISH. Adems, las muestras de
los das 166 y 216 presentaron un T-RF de tamao 70pb con la enzima TaqI no
detectado previamente, que no se corresponde con los tamaos de T-RFs (calculados en
el anlisis in silico) de ninguna de las AOB descritas hasta el momento (cuyas
secuencias estn depositadas en el portal NCBI). Esto podra estar relacionado con la
Tabla XVI. Resultados de la restriccin in slico con CfoI, AluI y TaqI de secuencias de clones amoA
(derecha) y de secuencias del banco de datos con el nmero de acceso (izquierda). Los valores estn
expresados en pares de bases (pb) y corresponden al tamao esperado de fragmento terminal (T-RF). no cut
= no presenta sitio de corte; ? = secuencia insuficiente para restriccin in slico.
Secuencia depositada
Nitrosospira sp.
Nitrosospira briensis
Nitrosospira sp.
Nitrosococcus mobilis
Nitrosolobus multiformis
Nitrosovibrio tenius
Nitrosomonas nitrosa
Nitrosomonas nitrosa
Nitrosomonas halophila
Nitrosomonas communis
Nitrosomonas marina
Nitrosomonas cryotolerans
Nitrosomona europaea
Nitrosomonas aestuari
No cut 283
No cut 283
No cut 283
379
219
No cut 283
34
283
No cut
48
No cut
48
No cut 219
184 No cut
208
48
86
No cut
No cut 219
208 No cut
115
Famo1
Famo37
Famo19
Famo33
Famo25
Famo7
Famo26
Famo3
Famo15
Famo14
Famo2
AluI TaqI
68
No cut
68
117
68
117
68
No cut
68
117
No cut No cut
135
No cut
135 223 224
135
No cut
301
No cut
301
?
219
219
219
219
219
219
283
283
283
139
283
491
216
0%
166
146
126
100
89
0%
219
20%
146
71
126
20%
40%
103
40%
283
60%
89
134
491
80%
64
60%
100%
35
301
80%
amoA Taq I
T-RF (% abundancia
relativa)
100%
64
T-RF (% abundancia
relativa)
amoA Cfo I
Tiempo (das)
Tiempo (dias)
Figura 26. Anlisis por T-RFLP del gen amoA de las muestras del lodo F. Resultados de la restriccin
con la enzima CfoI y con la enzima TaqI. Un fragmento = un color.
Por otra parte, segn el perfil de T-RFLP con la enzima CfoI, no sucedieron cambios en
la composicin de taxones del gen amoA (Fig. 26), pero si hubo cambios en cuanto a la
distribucin de los mismos durante la operacin principalmente en la muestra del da
146 la cual se diferenci de las dems con mas de un 20 % de distancia (Tabla XVII).
Tabla XVII. Matriz simtrica basada en el ndice de similitud cuantitativo
Morisita entre muestras de T-RFLP amoA con CfoI.
El anlisis con la enzima AluI mostr que la comunidad mantuvo los mismos taxones
dominantes durante todo el monitoreo. Sin embargo los resultados obtenidos con dicha
enzima no fueron los esperados en cuanto al numero de picos que se observaron en los
cromatogramas, probablemente por digestin incompleta. Debido a ello y a que solo
116
70
pudieron analizarse tres muestras con esta enzima, estos datos no fueron utilizados para
comparar la diversidad y la similitud entre muestras (ANEXO 7).
Se analiz la diversidad de la comunidad AOB durante el monitoreo por T-RFLP del
gen amoA con la enzima CfoI (los resultados obtenidos con la enzima TaqI mostraron la
misma tendencia). Los resultados indicaron que la diversidad de bacterias oxidantes de
amonio en el reactor F fue en aumento a pesar de que se mantuvo el nmero de taxones
presentes (cuatro taxones), ya que aument la equitatividad en cuanto a la distribucin
de los mismos (Tabla XVIII).
Tabla XVIII. ndices de diversidad de AOB calculados a partir del TRFLP del gen amoA con la enzima CfoI.
ndices de diversidad AOB
da 64
da 89
da 103
4
4
4
14872
14845
14813
0.44
0.43
0.39
0.91
0.96
1.07
0.56
0.57
0.61
0.62
0.65
0.73
1.39
1.39
1.39
65.82
69.08
77.33
Taxa_S
Individuals
Dominance_D
Shannon_H
Simpson_1-D
Evenness_e^H/S
Hmax
H/Hmax*100
da 146
4
14910
0.26
1.37
0.74
0.99
1.39
98.97
0.3
64
89
146
103
Componente 2
0.2
0.1
0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
-0.7
da 126
4
14934
0.35
1.14
0.65
0.78
1.39
82.52
anlisis
de
componentes
principales.
Se
126
-1
0
1
2
Componente 1
cambio
no
pudo
explicarse
con
las
117
118
et al., 2000) aunque existen otros criterios que establecen un umbral mayor a un 90 %
(Sakano et al., 2002).
Tabla XIX. Resultados del anlisis de secuencia de clones basado en la matriz de similitud del anlisis
filogentico de aminocidos del gen amoA del lodo F. Homogeneidad se refiere a la similitud de
secuencia entre los clones agrupados dentro del mismo perfil
Perfiles
TaqI/CfoI
Homogeneidad
(%)
Secuencia tipo*
Similitud
(%)
A
B
Abundancia relativa
(%) de 34 clones
82,4
11,8
92.7 - 99.5
96.4 99.0
2,9
-------------
2,9
-------------
Nitrosomonas europaea
Nitrosospira tenuis
Nitrosospira tenuis
Nitrosospira cryotolerans
Nitrosospira tenuis
94.3 - 100
83.5 - 95.4
88.2
88.4
94.2
119
5.1.7. Anlisis de bacterias totales: T-RFLP y clonado del gen ARNr 16S
T-RF
(% abundancia relativa)
100%
80%
76
83
86
92
126
145
60%
158
70
100%
138
154
162
40%
213
245
20%
282
340
0%
35
64
103
126
Tiem po (dias)
146
375
403
438
455
472
490
T-RF
(% abundancia relativa)
64
ARNr 16S M sp I
75%
50%
25%
0%
35
64
89
103
Tiem po (dias)
126
46
64
70
77
91
97
100
134
203
209
212
245
281
301
333
340
344
350
370
374
382
483
511
532
Figura 29. Anlisis por T-RFLP del gen ARNr 16S de las muestras del lodo F. Resultados de la restriccin
con las enzimas MspI y HhaI. Un color = un T-RF
120
Las muestras presentaron altos valores de diversidad, aunque la muestra del da 64 fue
la menos diversa comparada con las dems (Tabla XX). Se analiz la correlacin entre
la diversidad obtenida con ambas enzimas y las actividades oxidantes de amonio, de
nitrito y de acetato. Los resultados indicaron que no hubo correlacin significativa (la
35
64
126
103
146
35
64
126
146
103
0.9
0.9
0.8
0.8
0.7
98
0.7
75
0.6
Similarity
Similarity
0.6
0.5
0.5
0.4
0.4
0.3
0.1
0.1
89
103
64
35
126
103
89
100
4
64
0.2
98
35
0.2
126
0.3
0.9
0.9
79
0.8
0.8
57
0.7
0.7
95
Similarity
Similarity
0.6
0.5
100
0.4
0.6
0.5
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
0.1
1
59
52
71
100
Figura 30. Anlisis de cluster de las muestras a partir del T-RFLP del gen ARNr 16S con las enzimas MspI (A
y B) y HhaI (C y D) utilizando el algoritmo UPGMA (Paired group) y el ndice de similitud cuantitativo
Morisita (B y D) y el ndice de similitud presencia/ausencia Dice-Sorensen (A y C). Se indican los valores de
bootstrap para 100 replicados excepto en A donde ocurri un defecto en el programa PAST por exceso de
datos con valor 0.
121
122
Chlorobium,
Spirochaetales,
Sphingobacteriales,
Chloroflexi,
alfa
Proteobacterias
gamma
Bacteroidetes
beta
Actinomycetales
delta
Chlorobium
Spirochaetales
30%
57%
Sphingobacteriales
Planctomycetes
no cultivados
Figura 31. Frecuencia relativa de clones donde se representan los grupos microbianos presentes en la muestra
del da 103 del lodo F segn el anlisis de secuencias de clones del gen ARNr 16S. Se indica la distribucin de
las clases de alfa, beta, gamma y delta Proteobacterias
123
124
Consideraciones finales y
conclusin general captulo 1
En este captulo se present el anlisis de la comunidad microbiana del reactor F
durante 643 das de operacin, utilizando mtodos de medida directa de actividad por
respirometra, mtodos de biologa molecular (T-RFLP y clonado) y mtodos de
cultivo.
La cada abrupta de las tres actividades potenciales el da 60 coincidi con la entrada
anormal de slidos totales y voltiles provenientes de la laguna anaerobia, lo cual
debera prevenirse ya que podran ingresar txicos que afectan a todos los
microorganismos de forma irreversible. A partir del da 35 se detectaron organismos del
dominio Archaea, coincidiendo con un aumento de slidos en el influente.
Probablemente se trate de microorganismos metanognicos presentes en la laguna
anaerobia, o podra tratarse de AOB del dominio Archaea las cuales podran tener un rol
importante en el ciclo del nitrgeno tal como se ha reportado recientemente (Park et. al.,
2006; Nicol y Schleper, 2006).
En cuanto a la evaluacin de las medidas tomadas en la operacin del reactor se lleg a
la conclusin que la reinoculacin fue til para lograr recuperar la actividad del reactor.
Si bien a escala real es una medida muy costosa, esta sera la medida ms rpida en caso
que el reactor perdiera la capacidad de remocin de nutrientes. La comunidad
microbiana presente tard cierto tiempo en estabilizarse (estabilizarse funcionalmente,
ya que la estructura no se estabiliz en ningn momento segn el anlisis por T-RFLP)
luego de la reinoculacin pero la eficiencia de remocin de nutrientes se recuper
rpidamente una vez reinoculado el reactor.
125
126
mayor que el calculado (Seccin 5.1.1). En caso de demostrarse que el factor limitante
en la velocidad de oxidacin de amonio fuese el oxgeno, y se necesitase remover el
amonio con mayor velocidad debera optimizarse la transferencia de O2 en el reactor por
ejemplo aplicando mayor agitacin durante la aireacin.
Por otro lado, el hecho de que la remocin de amonio en el reactor se haya efectuado
con un 100% de eficiencia no significa que la disminucin del tiempo de aireacin no
haya afectado el crecimiento de las AOB y NOB; de hecho la actividad potencial de las
NOB tuvo una disminucin importante luego del cambio de ley de control al disminuir
el tiempo de aireacin por ciclo.
En cuanto a la comunidad oxidante de amonio, segn los resultados del T-RFLP amoA
se observ una flora oxidante de amonio relativamente estable en el tiempo en cuanto a
la composicin microbiana y con poca riqueza de especies (segn el anlisis con TaqI y
CfoI) pero con ndices de diversidad que fueron aumentando en el tiempo. Los cambios
en la abundancia relativa diferenciaron a la muestra del da 146 de las dems, y luego en
la muestra del da 166 apareci un nuevo taxn (detectado en el anlisis con la enzima
TaqI). Este cambio en la estructura coincidi con el cambio observado en la comunidad
de organismos del dominio Bacteria detectados con el T-RFLP del gen ARNr 16S. Esto
podra indicar que la presencia de algunas especies de bacterias favoreci la instalacin
de otras especies de AOB o viceversa, tal vez por razones de mutualismo, competencia,
etc.
En el anlisis de T-RFLP del gen amoA los picos obtenidos con las enzimas CfoI y TaqI
pudieron ser asignados en su totalidad excepto para el T-RF con TaqI con un tamao de
70 pb. Este T-RF podra corresponder a un gen amoA de una bacteria an no descrita.
127
128
129
% n clulas
EUB338/Dapi
100
80
60
40
20
0
35
64
89
Tiempo (das)
130
131
132
Nitrospira
Lodo BRC1
Firmicutes
Lodo F
Chloroflexi
Planctomycetes
Sphingobacteriales
Spirochaetales
Chlorobium
Actinomycetales
Bacteroidetes
Proteobacterias
0
10
20
30
40
50
60
70
80
epsilon
BRC1
Clase
delta
Lodo F
beta
gamma
alfa
0
10
20
30
40
50
60
Abundancia relativa
en el total de Proteobacterias (% de clones)
133
Resultados y Discusin
5.2 CAPITULO 2
Reactor M
134
En este caso, al igual que para el reactor F, se verific que la concentracin de uso de
los sustratos amonio y acetato fuesen saturantes para el lodo M de manera de asegurar
que las medidas correspondan realmente de actividad potencial ya que se midi en
condiciones ptimas de temperatura, pH, aireacin y de concentraciones de sustrato.
Para ello se construyeron curvas de saturacin con concentraciones crecientes de
sustrato y se midi la actividad respiromtrica en cada caso. Se observ que tanto la
velocidad oxidante de amonio como la oxidante de acetato siguen una cintica tipo
Michaelis-Menten. En este caso la concentracin de saturacin para el amonio fue de
aproximadamente 2 ppm N-NH4+ lo cual difiere de lo encontrado en bibliografa donde
se plantea un valor de saturacin de 15ppm para el amonio (Gorska et al., 1996). La
cintica de oxidacin del acetato sigui una cintica del mismo tipo, donde se verific
que la concentracin de DQO agregada (200ppm DQO-acetato) era saturante (Fig. 35).
Acetato
Actividad (mgO2/ml*h)
Actividad (mgO2/ml*h)
Amonio
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
0
10
12
N-NH4+ (ppm)
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0
50
100
150
200
DQO (ppm)
Figura 35. Curvas de saturacin de amonio y acetato para el lodo M. Para el ensayo de actividad potencial se
utilizaron 60 ppm de N-NH4+ y 200 ppm de DQO-acetato
En este caso tampoco se realizaron curvas de saturacin de nitrito por lo que se utiliz la
concentracin (10 ppmN-NO2- ) sugerida por los mtodos de anlisis del proyecto EOLI
y por la bibliografa (Cabezas, 2005).
135
250
136
actividad hetertrofa aument durante este perodo (Tabla XXI). Podra suponerse que
la comunidad establecida tiene microorganismos con mayores tasas de degradacin.
Actividad (mgO2/gSSV.d)
Periodo11
Perodo
Periodo2 2
Perodo
Periodo3
Perodo 3
Periodo 44
Perodo
1200
1000
800
600
400
200
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
Tiempo (dias)
hetertrofa
COB
Figura 36: Actividad potencial hetertrofa vs. tiempo de operacin del reactor M.
Tabla XXI. Valores descriptivos de los estadsticos bsicos de la actividad potencial hetertrofa del
lodo M. Los valores de media, mnimo, mximo y desviacin estndar se expresan en
mgO2/gSSV.da
Actividad hetertrofa
Periodo 1
Peridodo 2 Periodo 3
N
22
25
14
Media
541
237
274
Desviacion estndar 346
135
62
Minimo
13
77
196
Maximo
1080
581
387
Periodo 4
21
567
295
0
1185
Debido al bajo contenido de amonio del influente, el reactor M present baja actividad
nitrificante o por debajo del lmite de deteccin (no se presentan los datos) al igual que
el nmero de bacterias nitrificantes analizadas mediante FISH durante todo el monitoreo
(Tabla XXII).
137
DAPI
EUB
NSO
Nit
Ntspa
Arch
64
2,9E+09
1,8E+09
<lim
<lim
<lim
6,4E+06
252
7,8E+08
2,5E+08
<lim
<lim
<lim
<lim
M1
M2
M3
M4
M5
M6
Aislamientos en TSA
Gram Cat. Ox. Desnitrif.
B+
+
Si
B+
Si
BSi
B+
+
Si
Bno
B+
Si
acuerdo
XXIII).
Estos resultados demuestran que las condiciones
de operacin permitieron que se estableciera una
138
139
haber sido la causa por la que el perodo 2 present una actividad hetertrofa menor y
mas estable.
En el siguiente perodo el aumento de carga caus un cambio notorio en la estructura de
la comunidad ya que se seleccionaron poblaciones bacterianas diferentes a las presentes
en los perodos 1 y 2 (Fig. 38).
TABLA XXIV. Clculo de los ndices de diversidad de las distintas muestras a partir del anlisis de los resultados
del T-RFLP ARNr 16S con HhaI (A), MspI (B). *Las muestras correspondientes a los das 64 y 783 no pudieron
analizarse con la enzima HhaI debido a problemas con la electroforesis del T-RFLP.
A
Taxa_S
Individuals
Dominance_D
Shannon_H
Simpson_1-D
Evenness_e^H/S
Hmax
H/Hmax*100
B
Taxa S
Individuals
Dominance D
Shannon H
Simpson 1-D
Evenness e^H/S
Hmax
H/Hmax*100
64
10
3014
0.1
2.2
0.9
0.9
2.6
85.0
132
6
11958
0.3
1.5
0.7
0.7
3.2
47.0
153
10
17056
0.2
2.0
0.8
0.8
3.2
63.0
216
12
18273
0.2
2.1
0.8
0.7
3.2
64.4
252
6
16416
0.3
1.4
0.7
0.7
3.2
45.1
132
10
3402
0.2
2.0
0.8
0.8
2.6
77.5
153
6
3835
0.2
1.6
0.8
0.9
2.6
63.4
216
7
3661
0.2
1.7
0.8
0.8
2.6
64.9
252
5
2948
0.4
1.2
0.6
0.7
2.6
46.9
dia de operacin
335
495
509
18
24
14
18390 19696 19985
0.1
0.1
0.2
2.4
2.7
1.9
0.9
0.9
0.8
0.6
0.6
0.5
3.2
3.2
3.2
74.6
85.8
59.7
dia de operacin
335
495
509
9
8
8
3940 3168 3318
0.3
0.2
0.2
1.7
1.9
1.7
0.7
0.8
0.8
0.6
0.8
0.7
2.6
2.6
2.6
64.3
71.4
65.0
586
12
17910
0.2
2.0
0.8
0.6
3.2
61.2
599
14
12846
0.2
2.0
0.8
0.5
3.2
61.7
637
8
17984
0.2
1.7
0.8
0.7
3.2
53.2
586
13
4246
0.1
2.4
0.9
0.9
2.6
93.4
599
12
4127
0.1
2.2
0.9
0.7
2.6
83.7
637
14
3550
0.1
2.4
0.9
0.8
2.6
90.9
789
12
21462
0.2
2.0
0.8
0.6
3.2
61.3
783
12
3696
0.1
2.4
0.9
0.9
2.6
91.0
789
13
3631
0.1
2.4
0.9
0.8
2.6
91.0
140
80%
60%
40%
20%
789
637
599
586
509
495
335
252
216
153
132
0%
59
65
71
79
87
94
101
111
122
129
143
169
198
205
215
226
234
246
255
263
320
341
362
370
388
497
533
63
68
73
83
90
98
105
117
124
133
150
176
201
209
220
228
240
252
258
274
324
355
366
376
392
515
Tiempo (das)
100%
80%
60%
40%
20%
789
783
637
599
586
509
495
335
252
216
153
132
64
0%
70
82
91
112
129
150
164
178
194
200
208
220
239
251
283
333
440
473
487
495
508
521
76
87
95
121
141
157
170
187
197
204
212
231
243
255
300
368
460
480
490
502
514
529
Tiempo (das)
Figura 37. Anlisis por T-RFLP del gen ARNr 16S de las muestras del lodo M.
Resultados de la restriccin con las enzimas MspI y HhaI. Un color = un T-RF
Por otra parte se demostr que los perodos con mayor actividad hetertrofa
coincidieron con los periodos donde la comunidad bacteriana present ndices de
diversidad mayores. Esto pudo observarse ya que existi correlacin positiva
(correlacin r de Pearsons > 0.8) entre los ndices de diversidad utilizados y la
actividad hetertrofa promedio para cada periodo (Tabla XXV).
141
P4
132d
789d
637d
P2
599d
509d
586d
495d
335d
P3
252d
153d
132d
64d
153d
789d
783d
637d
599d
586d
509d
495d
335d
252d
P2
216d
P1 y P2
P4
216d
P3
1
0,9
0,9
89
0,8
0,8
98
0,7
44
0,7
41
73
0,6
65
Sim ilarity
Similarity
63
0,6
0,5
77
12
7
0,5
17
0,4
54
22
15
56
0,4
48
0,3
0,3
32
0,2
71
22
0,2
63
0,1
100
0,1
100
10
11
12
13
14
Figura 38. Dendograma del anlisis de cluster basado en el T-RFLP del ARNr 16S con la enzima MspI (A) y HhaI (B). Se
construy en base al ndice de similitud presencia/ausencia Dice-Sorensen y el algoritmo UPGMA. En los nodos se
observan los valores de bootstrap para 100 replicas.
142
5.2.3 Anlisis de bacterias oxidantes de amonio (AOB): T-RFLP del gen amoA
amoA Taq I
100%
0.9
491
80%
283
0.8
64
252
216
93
65
73
0.7
273
60%
268
40%
262
20%
132
153
216
Tiempo (das)
252
0.5
219
0.4
208
0.3
67
0.2
0%
64
0.6
Similarity
T-RF
(% Abundancia Relativa)
153
de especies an no descriptas.
132
con secuencias de amoA conocidas. Estos resultados sugieren que se trate genes amoA
100
0.1
Figura 39. Anlisis por T-RFLP del gen amoA con la enzima TaqI de las muestras del lodo M. Resultados de la
restriccin con la enzima TaqI (A) y dendograma del anlisis de cluster construido en base al ndice de similitud
cuantitativo Morisita y el algoritmo UPGMA. En los nodos se observan los valores de bootstrap para 100 replicas.
143
Consideraciones finales y
conclusin general captulo 2
El reactor M fue destinado principalmente a la remocin de materia orgnica de
efluentes de industria lctea, mas que nada como una alternativa de tratamiento de tipo
secundario. Se demostr que dicho reactor fue capaz de mantener una alta tasa de
degradacin de materia orgnica y de remover los compuestos nitrogenados que
ingresaban en el influente a pesar de no detectarse actividad nitrificante por
respirometra. Esto podra deberse a la utilizacin del nitrgeno para el metabolismo
asimilativo de bacterias hetertrofas presentes y de esta forma podra darse la remocin
de nitrgeno del efluente. Otra causa posible podra ser que exista una mnima tasa de
nitrificacin en el reactor (no detectable por respirometra) y que la misma sea
suficiente para remover el poco amonio que ingresa con el influente. La desnitrificacin
ocurri sin problemas en el reactor ya que se removi el nitrato del efluente,
probablemente debido a que las condiciones de alimentacin y de anoxia fueron
adecuadas para dicho proceso.
El agregado de polmero floculante result una medida acertada para resolver el
problema de sedimentacin del lodo y para mejorar la estabilidad de la actividad ya que
facilit la prediccin del comportamiento del reactor. Por otro lado es una medida viable
(aunque costosa) para realizar a escala real cuando ello sea necesario. De todas formas
deberan realizarse ensayos (respiromtricos) en batch previos para cada reactor real
para verificar que la actividad no sea inhibida. Por otra parte, en este perodo ocurri un
cambio en la diversidad de la comunidad de bacterias acompaado de un cambio en la
actividad hetertrofa.
144
145
146
Resultados y Discusin
5.3 CAPITULO 3
Aplicaciones en el Modelado de Reactores SBR
147
148
Tiempo
(Da de operacin)
35
64
89
103
126
146
Segn estos clculos un porcentaje muy bajo (entre un 0.03 y un 5,8 %) de los
slidos suspendidos voltiles corresponde a la biomasa activa del lodo F (Tabla
XXVI) donde el mayor porcentaje corresponde a slidos inertes.
5.3.2 Determinacin de la actividad especfica y por clula
149
Tabla XXVII. Clculo de actividad terica desnitrificante y hetertrofa por clula segn los valores de
actividad desnitrificante y del recuento por NMP. BD = Bacterias desnitrificantes.
427
997
dia
mgSSV/L
1180
8826
mgO2/gSSV.da
umoles NO3/gSSV
Actividad del Lodo F
2.1E+09
NMP/gSSV
BD
4.2E-06
5.6E-07
umolesNO3/clula.da mgO2/clula.da
Actividad/clula
anoxia previamente; Tabla XXVIII). Esto tal vez podra deberse a la subestimacin del
nmero de clulas desnitrificantes cuantificadas mediante la tcnica de NMP utilizada
para el clculo terico. En este caso la actividad terica podra resultar hasta un orden
de magnitud menor y de ese modo ser consistente con algunos de los resultados
empricos (Tabla XXVIII).
Tabla XXVIII. Valores de actividad desnitrificante de las cepas F29, F15 y F23. anox = condiciones de cultivo
anxico. aerob.=condiciones de cultivo aerobias. La actividad emprica por clula se estim utilizando los valores de
actividad especfica y los valores de SSV por clula de la tabla XXVI. La actividad terica corresponde a los valores
calculados a partir del NMP de bacterias desnitrificantes y actividad desnitrificante del reactor F.
Cepa
Slidos
ACTIVIDAD DESNITRIFICANTE
SSV/clula (rango)
Actividad emprica
(cultivo
puro)
gSSV/ml
gSSV/cl
gSSV/cl
F29 anox
F25 anox
F25 aerob
F23 aerob
4.4E-04
8.9E-05
7.8E-04
8.2E-05
3.0E-12
3.0E-12
3.0E-12
3.0E-12
1.4E-11
1.4E-11
1.4E-11
1.4E-11
umoles
umoles
NO3/ml.da NO3/gSSV.da
2.5
7.1
4.5
3.6
152
5642
79596
5793
43849
Actividad terica
7.9E-08
1.1E-06
8.1E-08
6.1E-07
umoles NO3/cel.da
4.0E-06
Consideraciones finales y
conclusin general captulo 3
Segn los resultados obtenidos el lodo F present una pequea fraccin de biomasa
activa comparado con el total de slidos suspendidos voltiles. La fraccin mayoritaria
podra tratarse de materia orgnica de difcil degradacin capaz de permanecer en el
reactor ya sea porque es material sedimentable o material capaz de adsorberse a
superficies e incluso a los flculos de bacterias. Otra explicacin podra ser que el alto
tiempo de residencia celular del reactor (1 semana aprox.) produjo la retencin de
clulas favoreciendo la acumulacin de biomasa muerta y aumentando la edad del lodo.
Por otro lado no debera descartarse que la tcnica de FISH podra haber subestimado el
nmero de clulas activas en el reactor y por lo tanto generar resultados errneos en
cuanto a la proporcin de biomasa activa. Esto podra ocurrir ya que el recuento por
FISH se dificulta en los casos donde las clulas forman flculos, por lo tanto slo se
observan las clulas que se encuentran en la capa superior del mismo.
Se observ que la actividad desnitrificante especfica de las cepas F25 y F29 fue
consistente con la actividad del reactor. Por otro lado, se demostr que las condiciones
previas de cultivo en anoxia favorecieron la actividad desnitrificante en la cepa F25.
Esto podra deberse a que la duracin del perodo aerobio afecta la permanencia en fase
lag del crecimiento diuxico (para oxgeno y nitrato como aceptores de electrones). Es
decir, cuanto mayor tiempo se expongan las bacterias desnitrificantes a condiciones de
aireacin, mayor tiempo permanecern en fase lag antes de comenzar a utilizar nitrato
para su respiracin. Actualmente existen investigaciones que indican la posible
existencia de un opern para la respiracin de nitrato que podra estar regulado de
alguna forma por la presencia de oxgeno entre otros (Hamilton et al., 2005; Liu et al.,
153
1998). Este aspecto es muy interesante ya que los sistemas SBR a menudo poseen una
fase aerobia extensa, la cual debe ser evaluada para lograr minimizar la fase lag de la
desnitrificacin.
154
CONCLUSIN GENERAL
Se acept la hiptesis parcialmente ya que slo algunos cambios en la operacin del
reactor generaron cambios en la composicin de la comunidad microbiana
(reinoculacin, agregado de floculante, aumento de carga). Por otro lado, el hecho que a
su vez los cambios en la composicin de la comunidad microbiana generaran cambios
en la performance del reactor, no se cumpli en los casos de redundancia funcional,
donde ocurre un cambio estructura pero se mantiene la eficiencia y la funcin.
En el comienzo de este trabajo se plantearon una serie de interrogantes (P). A
continuacin se resumen las respuestas (R) a las mismas.
P. Los cambios en la estructura de la comunidad de bacterias se correlacionan
con las variables de operacin del sistema?
R. Si, existe correlacin . Se demostr que los cambios en la operacin del reactor
generan cambios en el desempeo del reactor y en ciertos casos se encuentra
relacionado con cambios en la composicin de la comunidad microbiana. La estructura
de la comunidad microbiana fue afectada en distinto grado segn el tipo de perturbacin
o cambio de operacin que fue efectuado. En ambos reactores la reinoculacin parece
haber sido la perturbacin que caus mayores cambios en la comunidad y en la
performance del reactor.
P. Existe correlacin entre la actividad potencial y la performance del reactor?
R. Si, en algunos casos (entre remocin de DQOs y Actividad hetertrofa, y entre
remocin de Nt, de NH4+ y actividad de NOB). La medida de actividad respiromtrica
155
reflej los cambios en la performance de los reactores resultando en una tcnica rpida y
sencilla para monitorear sistemas de tratamiento reales. Por otro lado, las herramientas
moleculares utilizadas permitieron identificar las especies nitrificantes y desnitrificantes
mas abundantes presentes y explicar parcialmente los cambios en la eficiencia de
remocin de nutrientes. El estudio del gen nirS solo abarca el anlisis de una fraccin
de la comunidad desnitrificante. Sera interesante analizar adems el gen nirK en este
tipo de comunidades.
P. La flora presente en el reactor se recupera frente al agregado de txicos?
R. Si. Para implementar el uso de sistemas biolgicos es importante conocer el
comportamiento de la flora tanto en condiciones estables como en condiciones
desfavorables,
estudiando
su
capacidad
de
recuperacin
frente
distintas
perturbaciones. Los resultados de esta tesis lograron demostrar que la flora relevante en
el proceso de nitrificacin y desnitrificacin es capaz de recuperarse frente a
perturbaciones en su ecosistema. Esto es muy importante en los reactores a gran escala
ya que muchas veces en el efluente industrial llegan sustancias toxicas, inhibitorias para
los microorganismos.
P. Los perodos de mayor actividad nitrificante del reactor se corresponden con la
seleccin de especies con mayor actividad especfica; o se corresponden con un
aumento en el nmero de la bacterias nitrificantes presentes?
R. No se demostr la seleccin de especies con mayor actividad especfica pero se
observ que cuando hubo un cambio en la estructura de la comunidad AOB (en el lodo
F) ocurri la cada de actividad oxidante de amonio. Por otro lado se demostr los
perodos en que el reactor F present mayor actividad nitrificante no se relacionaron con
los perodos de mayor nmero de AOB y NOB segn el anlisis por FISH (ver seccin
156
Globalmente los resultados fueron tiles para predecir y/o analizar el comportamiento
biolgico de las plantas de tratamiento de efluentes instruyndonos acerca del
funcionamiento interno del reactor. Por ejemplo, se observ que la disminucin de la
etapa aerobia baja los costos de operacin y no afecta negativamente la actividad AOB
y hetertrofa. Adems, la reinoculacin result til para recuperar la actividad de ambos
reactores. Estos conocimientos vinculados con el sistema SBR podrn ser extrapolados
a los sistemas de tratamiento a gran escala. A su vez estos conocimientos podrn ser
utilizados como insumos para adaptar sistemas de tratamiento existentes a sistemas tipo
SBR de manera de mejorar la eficiencia de remocin de nutrientes.
158
PERSPECTIVAS
159
6. Referencias Bibliogrficas
Amann R. I., Binder B. J., Olson R. J., Chisholm S. W., Devereux R. and Stahl
D. A. (1990). Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with
flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl. Environ.
Microbiol. 56: 1919-1925.
Amann R., Ludwig W., Schleifer K-H. (1995). Phylogenetic identification and
in situ detection of individual Microbial Cells Without Cultivation. Microbiol.
Rev. 59(1): 143-169
Bernet N., Delegens N., Delegens J-P., Molletta R. (2001). SBR as a relevant
technology to combine anaerobic digestion
Bock E., Schmidt I., Stueven R., Zart D. (1995). Nitrogen loss caused by
denitrifying Nitrosomonas cells using ammonium or hydrogen as electron
donors and nitrite as electron aceptor. Arch. Microbiol. 163:16-20
Borzacconi, L. Ottonello, G., Castell, E., Pelaez, H., Gazzola, A. And Vias,
M. (1999) Denitrification in carbon and removal system for leachate treatment:
performance of an upflow sludge blanket (USB) reactor. Wat. Sci. Technol.
40(8): 145-151.
Brady, N. C. (1984). The Nature and Properties of Soils. Macmillan New York,
NY, pp. 283302
160
Cabezas A. (2005). Microbiologa de los procesos biolgicos de nitrificacindesnitrificacin en la descontaminacin de deshechos. Tesis de Maestra en
Qumica, PEDECIBA-Facultad de Qumica-UDELAR
Calli B., Tas N., Mertoglu B., Iane B., Ozturk I. (2003) Molecular analysis of
microbial communities in nitrification and denitrification reactors treating high
ammonia leachate. Journal of Environmental Science and Health. 38(10): 19972007
Dabert P., Sialve B., Delgenes J., Moletta R.,Godon J. (2001). Characterisation
of the microbial 16S rDNA diversity of an aerobic phosphorus-removal
ecosystem and monitoring of its transition to nitrate respiration. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 55 (4): 500-509
Daims H., Purkhold U., Bjerum L., Arrnold E., Wilderer P., Wagner M. (2001).
Nitrification in sequencing biofilm batch reactors: lessons from molecular
approaches. Wat. Sci. Technol. 43(3):5273-5284
Daum M., Zimmer W., Papen H., Kloos K., Nawarath K., Bothe H. (1998).
Physiological and molecular biological characterization of ammonia oxidation
of the heterotrophic nitrifier Pseudomonas putida. Current Microbiol. 37:281288
Egli K., Fanger U., Alvarez P., Siegrist H., ven der Meer J., Zehnder A. (2001)
Enrichment and characterization of an anammox bacterium from a rotating
biological contactor treating ammonium-rich leachate. Ach. Microbiol. 175:198207
Etchebehere C., Errazquin I., Barrandeguy E., Dabert P., Moletta R., Mux L.
(2001). Evaluation of the denitrifying microobiota of anoxic reactors. FEMS
Microbiol. Ecol. 35:259-265
Etchebehere C., Tiedje J. (2005) Presence of two different active nirS nitrite
reductasa genes in a denitrifying Thauera sp. From a High-Nitrate-Removal rate
reactor. Appl. Environ. Microbiol. 71(9): 5642-5645
Etchebehere, C., Errazquin M. I., Cabezas A., Pianzzola M.J., Mallo M.,
Ottonello G., Borzacconi L. and Mux L. (2002a). Sludge bed development in
denitrifying reactors using different inocula-performance and microbiological
aspects. Wat. Sci. Technol. 45(10): 365-370.
Etchebehere, C., Errazquin, M. I., Dabert, P., and Mux L. (2002b) Community
analysis of a denitrifying reactor treating landfill leachate. FEMS Microbiol.
Ecol. 40: 97-106.
162
Gorska S.J., Garnaey K., Demuynck C., Vanrolleghem P., Verstraete W. (1996)
Nitrification monitoring in activated sludge by oxygen uptake rate (OUR)
measurements. Water Res., 30 (5), 1228-1236.
Gutell R.R., Larsen N., and Woese C.R. (1994) Lessons from an Evolving
Ribosomal RNA: 16S and 23S rRNA Structure from a Comparative Perspective.
Microbiol. Rev. 58:10-26
Hamilton R., Casasus A., Rasche M., Narang A., Svoronos S.A., Koopman B.
(2005) Structured model for denitrifier diauxic growth. Biotechnology and
bioengineering 90(4): 501-508
Henze M., Harremoes P., Jansen J., Arvin E. (1997). Wastewater treatmentBiological and chemical process. Springer Verlag, 2 edicin. Alemania.
Horz H.P, Rotthauwe J.H, Thomas Lukow T., Liesack W. (2000). Identification
of major subgroups of ammonia-oxidizing bacteria in environmental samples by
T-RFLP analysis of amoA PCR products. J. Microbiol. Meth.39(3):197-204
Hoshino T., Terahara T., Tsuneda S., Hirata A., Inamori Y. (2005). Molecular
analysis of microbial population transition associated with the start of
denitrification in a wastewater treatment process. J. Appl. Microbiol.99: 11651175
Hoshino T., Terahara T., Yamada K., Okuda H., Suzuki I., Tsuneda S., Hirata
A., Inamori Y. (2006). Long term monitoring of the succession of a microbial
community in activated sludge from a circulation flush toilet as closed system.
FEMS Microbiol. Ecol. 55: 459-470
Juretschko S., Loy A., Lehner A., Wagner M. (2002) The Microbial Community
Composition of a Nitrifying-Denitrifying Activated Sludge from an Industrial
Sewage Treatment Plant Analyzed by the Full-Cycle rRNA Approach. System.
Appl. Microbiol. 25: 8499
163
Juretschko S., Timmermann G., Schmid M., Schleifer K-H., PommereningRser A., Koops H-P., Wagner, M. (1998) Combined molecular and
conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge:
Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populations.
Appl Environ Microbiol 64: 30423051
Kempen R., Mulder J.W., Uijterlinde C., Loosdrecht M.C. (2001). Overview: ful
scale experience of the SHARON process for treatment of rejection water of
digested sludge dewatering. Wat. Sci. Technol. 44(1): 145-152
Liu P., Svoronos S., Koopman B. (1998). Experimental and modeling study of
diauxic lag of Pseudomonas denitrificans switching from oxic to anoxic
conditions. Biotechnology and Bioengineering 60 (6): 649-655
164
Muller RH., Jorks S., Kleinsteuber S., Babel W. (1998). Degradation of varius
chlorophenols under alkaline conditions by gram-negative bacteria closely
related to Ochrobactrum anthropi. J. Basic. Microbiol. 38(4):269-281.
Okabe S., Satoh H., Watanabe Y. (1999) In Situ Analysis of Nitrifying Biofilms
as Determined by In Situ Hybridization and the Use of Microelectrodes. Appl.
Environ. Microbiol. 65 (7): 3182-3191
Olsen, G.J., Lane, D.L., Giovannoni, S.J. y Pace, N.R. (1986). Microbial
ecology and evolution: a ribosomal RNA approach. Annu. Rev. Microbiol. 40:
337-365.
Osborne C., Rees G., Bernstein Y., Janssen P. (2006) New threshold confidence
estimates for Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism analysis of
complex bacterial communities Appl. Environ. Microbiol. 72 (2): 1270-1278
Ozdemir G., Ozturk T., Ceyhan N., Isler R., Cosar T. (2003). Heavy metals
biosorption by biomass of Ochrobactrum anthropi produzing exopolysaccaride
in activated sludge. Bioresource Technology. 90:71-74
Park H-D, Wells G., Bae H., Criddle C., Francis C. (2006). Ocurrence of
ammonia-oxidizing Archaea in wastewater treatment plant bioreactors. Appl.
Env. Ecol. 72 (8): 5643-5647
165
Purkhold, U., Pommerening-Rser A., Juretschko S., Schmid M., Koops H-P,
Wagner M. (2000) Phylogeny of all recognized species of ammonia oxidizers
based on comparative 16S rRNA and amoA sequence analysis: Implications for
molecular diversity surveys. Appl. Env. Ecol., 66:53685382
Rich J., Heichen R., Bottomley P., Cromack K., Mylord D. (2003) Community
composition and functioning of denitrifying bacteria from adjacent meadow and
forest soil. Appl. Env. Microbiol. 69: 5974-5982
Rondon, M.R., August, P.R., Bettermann, A.D., Brady, S.F., Grossman, T.H.,
Liles, M.R. et al. (2000). Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing
the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Appl Env
Microbiol 66: 2541-2547
Sakano Y., Pickering K., Strom., Kerkhof L. (2002) Spatial distribution of total,
ammonia oxidizing, and denitrifying bacteria in biological wastewater treatment
reactors for bioregenerative life support. Appl Environ. Microbiol. 68(5): 22852293
Schramm A., Beer D., van den Heuvel J., Ottengraf S., Amann R. (1999).
Microscale distribution populations and activities of Nitrospira and Nitrospira
spp. along a macroscale gradient in a nitrifying bioreactor: quantification by in
situ hybridization and the use of microsensors. Appl. Environ. Microbiol. 65(8):
3690-3696
Shrestha N., Hadano S., Kamachi T., Okura I. (2001). Conversin of ammonia
to dinitrogen in wastewater by Nitrosomonas europaea. Appl. Biochem. and
Biotechnol 90(3):221-232
166
Stein, L. Y., Arp, D. J., (1998) Ammonium limitation results in the loss of
ammonia-oxidizing activity in Nitrosomonas europaea. Appl Env Microbiol. 64
(4), 1514-1521
Strous M, Van Gerven E, Kuenen JG& Jetten M (1997) Effects of aerobic and
microaerobic conditions on anaerobic ammonium-oxidizing (Anammox) sludge.
Appl. Environ.Microbiol. 63: 2446-2448.
Schmidell W., Soares H., Etchebehere C., Menes R.J., Bertola N., Contreras E.
(2007) Tratamento biolgico de guas residurias. Editora Tribo da Ilha.
Florianpolis-SC. Brasil
Vitousek P., Aber J., Howarth R., Likens G., Matson P., Schindler D.,
Schlesinger W., Tilman G. (1997) Human alteration of the global nitrogen cicle:
sources and consequences. Ecological Applications 7(3): 737-750
studies
with
Pseudomonas
167
denitrificans.
Biotechnology
and
Benitez A., Ferrari A., Gutierrez S, Canetti R., Cabezas A., Travers D., Menes
J., Etchebehere C. (2005). Sequencing batch reactor as post-treatment of
anaerobically treated dairy effluent. Water science and technology 54 (2): 199206
168
http://www.minag.gob.pe/rrnn/rrnn_agua.shtml
http://www.conaprole.com.uy
http://www.fao.org/docrep
NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
http://www.gencat.net/salut/depsan/units/sanitat/html/es/dir90/nitratos.htm
http://www.tierramerica.net/2002/0324/noticias4.shtml
http://www.anammox.com
BLAST, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
http://Lynxified.Pages.de/pub/ARB/
169
7.ANEXOS
170
171
Buffer fosfato
Composicin en 1000ml:
K2HPO4.......................................5,3 g
KH2PO4......................................2,66 g
NaCl............................................5,8 g
Agua destilada..........................1000ml
Se ajust a pH = 8 para realizar la resuspensin de los lodos luego del lavado.
172
173
K2HPO4.............. 2.65g
KH2PO4.............. 1.33g
NH4Cl................. 0.50g
KNO3.................. 0.36g
KAc..................... 0.92g
H2O..................... 500ml
NaCl...................... 2.9g
174
el caso de recuento por NMP) y se sembr el volumen indicado (500-1000 ul) en el vial
con una jeringa estril en condiciones aspticas. Luego se incub a 37C 24-72hs
Solucin de vitaminas para BCY
Biotina (Vit K)................. 2.0 mg/L
Ac. Flico.........................2.0 mg/L
Piridoxina. HCl (B6)........10.0 mg/L
Tiamina HCl (B1)..............5.0 mg/L
Riboflavina (B2) ...............5.0 mg/L
Ac. Nicotnico...................5.0 mg/L
DL-Pantoneato de Ca......5.0 mg/L
175
176
ANEXO 2: % Formamida
Buffer de Hibridacin
Para 2 ml de buffer de hibridacin se mezclaron: 40 ul Tris-HCl 1 M pH 8, 360 ul de
NaCl 5M, 2 ul de SDS. Adems se agreg agua y formamida segn el porcentaje de
formamida necesario para cada sonda tal como se detalla a continuacin (Tabla A).
Buffer de lavado
Para 50 ml se mezclaron: 1 ml de Tris-HCl 1M pH 8, 500 ul de EDTA 0.5M (solo si
formamida en buffer de hibridacin era mayor a 20%), NaCl segn se detalla a
continuacin (Tabla B) segn el porcentaje de formamida utilizado, y se complet con
Agua mQ hasta 50 ml. Al final de la preparacin se adicionaron 50ul de SDS.
177
% Formamida (v/v)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Volumen agregado
de NaCl 5M (ul)
9000
6300
4500
3180
2150
1490
1020
700
460
300
Volumen agregado de
EDTA 0.5M pH 8.0 (ul)
0
0
0
0
500
500
500
500
500
500
178
Tabla del Nmero Ms Probable (NMP) por ml de muestra, utilizando series de tres tubos
inoculados con 10, 1.0, 0.1 ml respectivamente.
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0.1
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
NMP/ml
0
3
6
9
3
6.1
3.2
12
6.2
9.3
12
16
9.4
13
16
19
10
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0.1
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
NMP/ml
9
14
20
26
15
20
27
34
21
28
35
42
29
36
44
53
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
3.6
7.2
11
15
7.3
11
15
19
11
15
20
24
16
20
24
29
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
23
39
64
95
43
75
120
160
93
150
210
290
240
460
1100
>1100
179
32 ul
Buffer 10x
MgCl2 (25mM)
BSA
dNTPs (2.5mM)
primer 27F* (10uM)
primer 1492 R (10uM)
Taq Invitrogen (5U/ul)
5 ul
3 ul
0.5 ul
4 ul
2 ul
2 ul
0.5 ul
Se agreg 1ul de ADN para cada reaccin (aumentando o disminuyendo esta cantidad
cuando fue necesario)
La reaccin de PCR 16S se realiz utilizando los siguientes ciclos de tiempo y
temperatura:
5 94C + 30 ciclos (1 94C + 1 55C + 3 72C) + 7 72C
*Para la reaccin por PCR previa al T-RFLP se sustituy el primer 27F por el primer de
la misma secuencia pero marcado con fluorforo FAM (fluorforo 6-FAM (5-[6]carboxy-fluorescein, derivado de la fluorescena), 27F-6-FAM.
PCR amoA
Para una reaccin de 50ul se mezclaron:
H2O
Buffer 10x
MgCl2 (25mM)
BSA
dNTPs (2,5 mM)
AmoA R (10uM)
AmoA* F (10uM)
Taq Invitrogen (5U/ul)
34.75 ul
5 ul
1.5 ul
0.25 ul
4 ul
1.5 ul
1.5 ul
0.5 ul
180
Se agreg 1ul de ADN para cada reaccin (aumentando o disminuyendo esta cantidad
cuando fue necesario)
La reaccin de PCR amoA se realiz utilizando los siguientes ciclos de tiempo y
temperatura:
5 94C+ 35 ciclos (90 60C+ 90 72C+ 60 94C)+ 60 94C + 90 60C+ 10
72C
*Para la reaccin por PCR previa al T-RFLP se sustituy el primer amoA F por el
primer de la misma secuencia pero marcado con fluorforo FAM (fluorforo 6-FAM
(5-[6]-carboxy-fluorescein, derivado de la fluorescena), amoAF-6-FAM.
PCR del gen nirS
Para una reaccin de 50ul se mezcl:
H2O
Buffer 10x
MgCl2 (25mM)
BSA
dNTPs (2.5mM)
primer nir F* (10uM)
primer nir R (10uM)
Taq Invitrogen (5U/ul)
34.5
5
2.5
0.5
4
1
1
0.5
Se agreg 1ul de ADN para cada reaccin (aumentando o disminuyendo esta cantidad
cuando fue necesario). Los primers nir fueron nirS-1F y nirS-6R para el gen nirS, y
nirK-F y nirK-R para el gen nirK utilizando las mismas condiciones de reaccin para
ambos genes.
La reaccin de PCR del gen nir se realiz utilizando los siguientes ciclos de tiempo y
temperatura:
181
25 ciclos
72C 7+ 4C
*Para la reaccin por PCR previa al T-RFLP se sustituy el primer nirS-F por el primer
de la misma secuencia pero marcado con fluorforo FAM (fluorforo 6-FAM (5-[6]carboxy-fluorescein, derivado de la fluorescena), nirS-1F-6FAM.
PCR del inserto en los clones con primers del vector: T3/T7
Para una reaccin de 50ul se mezclaron:
H2O
Buffer 10x
MgCl2 (25mM)
BSA
dNTPs (2,5 mM)
T3 (50uM)
T7 (50uM)
Taq Fermentas (5U/ul)
37,75 ul
5 ul
3 ul
0,5 ul
2,5 ul
0,5 ul
0,5 ul
0,25ul
182
184
dems (diferencias de uno o mas ordenes de magnitud) fueron eliminadas del anlisis
(Fig. A).
Figura A: resultados del T-RFLP amoA con la enzima CfoI del reactor F. En amarillo se remarc la
muestra que no fue tenida en cuenta para el clculo ya que la intensidad de fluorescencia total (suma de
alturas de pico) fue dos rdenes menor que las dems muestras. Debajo se presentan los resultados de los
clculos realizados para la normalizacin.
Muestra
64
89
103
126
146
185
71
6972
7023
7189
6820
4631
0
134
7019
7112
7040
7070
7119
172
T-RF (pb)
301
494
627
254
747
409
1178
888
744
2391
7227
6222
0
0
Muestra
64
89
103
126
146
71
6972
6818
6535
5982
2740
134
7019
6905
6400
6202
4212
185
Suma total
14872
15291
16295
17025
25199
Suma total
14872
14846
14814
14934
14911
factor
1
1.03
1.10
1.14
1.69
186
Concentracin Actividad
ATU
ox. Amonio
(uM)
mgO2/ml*h
0
0,0298
0,171
0,0344
0,171
0,0375
0,343
0,0397
0,514
0,0399
0,686
0,0365
0,857
0,0328
1,028
0,0249
1,200
0,0180
Inhibicion
(%)
0
0
0
0
0
8,5
17,7
37,5
54,9
Concentracin
ATU
(uM)
0.686
1.028
Inhibicion
(%)
24,7
45,5
187
actividad nitrificante era capaz de recuperarse del inhibidor. Los resultados obtenidos
demostraron que luego de 24 hs la actividad oxidante de amonio se recuper en un
100% (Fig. a).
60
% inhibicin
50
40
24 hs
30
20
10
0
0
0.5
ATU (uM)
188
1.5
100%
90%
80%
70%
60%
58
67
73
79
85
94
104
107
50%
40%
113
117
30%
20%
132
256
10%
0%
375
407
475
496
103
146
Tiem po (das)
F64
Figura A: Anlisis por T-RFLP del gen amoA de tres muestras del
lodo F. Resultados de la restriccin con la enzima AluI. Se indica el
tamao de los T-RF en pb.
Tabla A: Matriz de similitud entre muestras del lodo F partir del ndice de
similitud cuantitativo Morisita y los resultados del T-RFLP amoA con
AluI. Las muestras resultaron tener > 93 % similitud entre s.
189
Por otro lado se utiliz la enzima RsaI ya que se buscaba identificar de forma mas
precisa las especies de AOB presentes en el reactor. Sin embargo los resultados
obtenidos con RsaI no fueron confiables ya que los controles (T-RFLP de clones del
gen amoA) no resultaron como se esperaba (los cromatogramas de los clones
presentaron >10 T-RFs). Por lo tanto, no se analiz el resultado obtenido con dicha
enzima.
190
91
CAB76777marine pA33
54
52
119aa
consenso
hoja legal (oficio)
F30-ABB04155
AAL86941Azoarcus tolulyticus
F16-ABB04152
63
F62
CAD29811 cyanobacterial bloom BS1279
CAD29818 cyanobacterial bloom BS1295
CAB76791marine pB76
ABA70964 coastal aquifer
CAH18786 marine AC100-13
CAD29352 estuarine sediment
AF197466Pseudomonas fluorescens
99
CAJ76741Pseudomonas aeruginosa
CAH18841 marine IC200-129
ABA70922 coastal aquifer
YP 157499Azoarcus sp. EbN1
99
AAL86937Thauera mechernichensis
CAA12214Roseobacter denitrificans
62
98
97
F5-ABB04151
99
F43
64
CAC03621Paracoccus pantotrophus
CAJ76797Paracoccus denitrificans
99
88
AAA93118Paracoccus denitrificans
CAJ76740Cupriavidus necator
ABA70919 coastal aquifer
BAE45629Hydrogenobacter thermophilus
BAD34484 phosphate wwt clone
72
CAA12215Azospirillum brasilense
F42-ABB04156
65
82
F87-ABB04162
F88
F18-ABB04153
99
97
69
F3-ABB04150
70
F69-ABB04160
F94-ABB04164
97
58
AAL86939Azoarcus toluvorans
AAL86938Azoarcus evansii
60
AAZ43111Pseudomonas stutzeri
88
65 93
54
98
AAZ25602Colwellia psychrerythraea
97
0.2
Figura 21: rbol filogentico construido a partir de secuencias parciales de 119 aminocidos del gen nirS basado en el anlisis
neighbor-joining con el modelo matricial de Dayhoff. Barra = diferencia de 20 aminocidos en 100. Se presentan valores de
bootstrap mayores a 50 en 100 rplicas.
Famo3
TaqI 283
Famo26
Perfil B CfoI 68
Famo15
TaqI 139/202
Famo14
Perfil C-D CfoI 301
Famo2
CAD62111 uncultured soil bacterium
Nitrosospira cluster 3
82
CAC82264 Nitrosospira tenuis
(Purkhold et al, 2000)
AAO60372 Nitrosospira multiformis
62
CAB10759 Nitrosospira briensis
CAD62157 uncultured soil bacterium
ABF20624 uncultured soil bacterium
CAB96449 Nitrosomonas ureae
AAG37814 Nitrosomonas oligotropha
70
6a and 6b clusters
AF272400 Nitrosomonas aestuarii
62
(Purkhold et al, 2000)
77 CAB96447 Nitrosomonas marina
AF272402 Nitrosomonas cryotolerans
AAG37812 Nitrosomonas nitrosa
AAG37807 Nitrosomonas communis
AAK08981 Nitrosomonas halophila
AAO60371 Nitrosomonas eutropha
87
Famo25
Famo9
N. europaea/Nc. mobilis
53 AAC38653 Nitrosomonas europaea
cluster 7 (Purkhold et al 2000)
CAD62100 uncultured soil bacterium
51
Famo1
Perfil A
TaqI 219
Famo33
CfoI 68
AAG39741 unidentified bacterium SBBR1-8
58
F19
Famo37
AAG39356 Nitrosococcus halophilus
56
93
54
10%
Figura 28: rbol filogentico construido a partir de secuencias parciales de 97 aminocidos del gen amoA basado en el anlisis neighbor-joining con el modelo matricial de Dayhoff. Los
nmeros en negrita indican el tamao de OTUs (operational taxonomic units= lengths of terminal restriction fragments) para el grupo sealado con las enzimas TaqI y CfoI segn el
anlisis in slico de T-RFLP. Barra = diferencia de 10 aminocidos en 100. Se presentan valores de bootstrap mayores a 50 en 100 rplicas.