ORGNICA III
Los cursos de Qumica Orgnica incluyen ejercicios
de laboratorio, con el propsito de reforzar el
contenido de las lecciones tericas y de desarrollar
habilidades manuales ticas para el trabajo
profesional subsecuente de los estudiantes de la
carrera de Ingeniera Bioqumica.
En la Materia de Qumica Orgnica III, se
proporciona a los alumnos la oportunidad de
practicar el mtodo cientfico, lo cual es
indispensable en el ejercicio de cualquier profesin
relacionada con las ciencias biolgicas. Este Manual
de prcticas de Laboratorio, pretende ser el
complemento que permita afianzar los conocimientos
tericos impartidos en el aula.
PRACTICA No.1
CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS
INTRODUCCIN
Uno de los primeros recursos durante el desarrollo de las Tcnicas
cromatografas fue el uso de una hija de papel filtr (celulosa) como base
estacioaria inerte para sostener un liquido; por esto la tcnica se denomina
cromatografa en papel. El papel se humedece por absorcin de vapor de agua;
as, la fase estacionaria es un lquido polar sostenido en papel. Luego se
permite que otro disolvente (rico en otra sustancia mas polar, por ejemplo nbutanol/11,0; 8/I en volumen) migre hacia arriba o hacia abajo en el papel por
accin capilar Cuando este disolvente de revelado llega al punto del papel
(origen) en el cual se puso una porcin de la muestra, cada sustancia de sta
se disuelve en distinta medida entre la fase apolar migratoria (sobre todo en el
n-butanol) y la [use polar estacionaria (por Io general agua). Este
fraccionamiento basado en la solubilidad prosigue mientras el disolvente siga
movindose a lo largo del papel. Las sustancias ms solubles en agua se
mueven con mayor lentitud que las ms solubles en la fase orgnica mvil. El
grado de migracin de una sustancia se expresa como el valor Rf el cual se
define como sigue:
Rf=
MATERIAL
REACTIVOS
Tijeras
Soln. De ninhidrina
Plstico autoadherente
Regla
Soln. problema
Lpiz
n-butanol/ac. actico/H20
Guantes desechables
Cordel
(5:1:2 v/v)
5 Pipetas Pasteur
Recipiente rectangular
Estufa
Soluciones de aminocidos
METODOLOGIA
1. Colocar en un vaso de precipitados de 400 ml, 20 ml de un mezcla de nbutanol/ac. Actico/Agua (5:1:2 v/v).
2. Cubrir el vaso con envoltura plstica autoadherente. Esto permitir que la
atmosfera de la "cmara cromatografa" se sature con los solventes (un tiempo
adecuado es de 20 a 30 minutos).
3. Recortar un rectngulo de papel Whatman No. 1 de 10 x 15 cm. Para tocar el
papel utilizar guantes desechables.
4. Con un lpiz, hacer una linea que una los lados de 10 cm. del rectangulo,
dicha lnea debe estar a una distancia de 2 cm. de uno de los lados de 15 cm.
(esta linea se denomina origen 0 punto de aplicacin).
5. Colocar una gota de las soluciones de cada uno de los aminocidos
disponibles y una gola de la solucin de la muestra desconocida, sobre la linea
de aplicacin (las aplicaciones deben sur los mas espaciadas posible, para
evitar traslapes durante el corrimiento). Utilizar diferentes pripetas Pasteur pan
aplicar y seguir usando los guantes.
6. Utilizar un orden de aplicacin que permita: saber la posicin de la muestra
desconocida y de los aminocidos que se estn empleando como estndar.
7. Con mucho cuidado engrapar los extremos del rectngulo, pan formar un
cilindro que tenga una altura de 15 cm.
8. Colocar el cilindro dentro de la "cmara cromatografca" apoyndolo sobre la
base cercana a la linea de aplicacin (el nivel de la mezcla de solventes debe
estar por debajo de la lnea de aplicacin). Tapar nuevamente la camara con el
plstico autodherente.
9. Cuando el solvente revelador alcance una altura aproximada de 14 cm.
sobre el papel ( 45 a 60 minutos), retirar el papel de la cmara.
10. Colgar el papel en un cordel utilizando unas pinzas para ropa y esperar a
que se seque.
PRACTICA No.2
ELECTROFORESIS EN GEL
INTRODUCCIN
La electroforesis en gel es una tcnica en la cual los componentes de una
mezcla se separan en base a sus diferencias de carga y a su distinta atraccion
por el gel. La electroforesis se utiliza tradicionalmente para separar molculas
que son muy grandes para ser separadas por tecnicas rapidas, tales como la
cromatografia de liquidos o de gases. El metodo de electroforesis se utiliza
para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA y RNA. La anemia
celular falciforme se diagnostica haciendo una electroforesis de la
hemoglobina. Al pH utilizado, la hemoglobina normal y la hemoglobina de la
anemia celular falciforme son atraidas por diferentes electrodos. Por medio de
la electroforesis es posible diferenciar proteinas de origen animal distinto (res,
caballc, perro, etc), ya que presentan patrones electroforticos distitos.
Durante la electroforesis, iones con la misma carga pueden ser separados
debido a que interantuan de manera diferente con el gel. Estas interacciones
pueden ser de tipo ion-ion, puente de hidrgeno o dispersiones de London. Las
soluciones amortiguadoras se seleccionan para optimizar las separaciones, ya
que pueden cambiar la carga de las especies en solucin.
OBJETIVO
Separar una mezcla de colorantes utilizados en la industria alimenticia, por
medio de la tcnica de electroforesis en gel.
MATERIAL
MATERIAL
REACTIVOS
5 Pilas de 9 V
Agitador
Vinagre blanco
2 m de cable
Tijeras
Cinta de aislar
Soporte universal
Hielo
Caja Petri
METODOLOGIA
1 FUENTE DE PODER
1.1 Conectar las cinco pilas de 9 V en serie para generar 45 V. Soldar o
conectar por medio de cable, el polo color negro (-) de una pila con el polo color
rojo (+) de Ia pila adyacente. Continuar de esta manera hasta que las cinco
pilas queden conectadas en serie, es decir con un cable no conectado que
salga del polo negro (-) y otro no conectado que salga del polo rojo (+).
1.2 Aislar todos los cables expuestos para evitar un corto circuito.
1.3 No conectar el ultimo cable del polo negro con el primero de polo rojo.
1.4 Unir las cinco pilas utilizando ciunta masking tape, para mantenerlas juntas.
2 SOLUCION AMORTIGUADORA
2.1 Mezclar en un vaso de precipitado de 400 ml, 1ml de vinagre con 2 ml de
amoniaco diluido.
2.2 Diluir esta mezcla con 300 ml de agua de la llave.
3 PREPARACION DEL GEL
3.1 Adicionar una cucharadita de gelatina a un vaso de precipitado de 150 ml
que contenga 50 ml de la solucin amortiguadora.
3.2 Dejar en reposo la mezcla por 5 minulos, para permitir que la gelatina se
hinche.
3.3 Calentar la mezcla casi a ebullicion (precaucion! la mezcla puede salir del
recipiente).
3.4 Retirar el vaso y agitar la mezcla ocasionalmente hasta que toda la gelatina
se disuelva. Enfriar por 5 minutos.
3.5 Cortar la parte superior de una pipeta de transferencia de plastico de talle
largo y recto.
3.6 Adicionar la gelatina dentro del bulbo hasta Ia mitad del mismo.
3.7 Mover la pipeta para permitir que la gelatina fluya hacia el talle.
3.8 Permitir que la gelatina siga fluyendo hasta que todas las burbujas de aire
sean desplazadas del talle.
6.4 lnsertar el electrodo positivo (cable del polo rojo) dentro de la solucion
amortiguadora del bulbo de la pipeta.
6.5 lnsertar el electrodo negativo (cable del polo negro) dentro de la solucion
amortiguadora de la caja Petri.
6.6 Sujetar los electrodos con masking tape, para mantenerlos en su lugar.
7. ELECTROFORESIS
7.1 Bajar la pipeta con mucho cuidado y sumergirla en la solucin
amortiguadora de la caja Petri, de tal manera que la punta quede cubierta.
7.2 Evita: mover la punta de la pipeta.
7.3 No agitar la solucin amortiguadora del bulbo o de la caja Petri.
7.4 Observar la pipeta a intervalos de 40 rninutos y hacer anotacioncs.
7.5 Desconectar la fuente de poder para terminar.
7.6 Reconectar la fuente de poder, si es neoesario continuar el corrimiento mas
tarde.
OBSERVA CIONES
*Si este experimento se realiza en forma demostrativa, se pueden utilizar varias
pipetas y realizar Ia electroforesis a diferentes intervalos de tiempo.
** Almacenar las pipetas en un refrigerador para minimizar la difusion de los
colorantes al terninar la electroforesis. Despus de 2 dias en refrigeracion ya se
aprecia difusion de los colores.
*** Remojar las pipetas en agua caliente, sumergirlas varias veces, enjuagarlas
y reusarlas.
****Las soluciones pueden desecharse en el vertedero.
CUESTIONARIO
1. Escribir el diagrama de la conexion de las pilas en serie.
2. Hacer un esquema del aparato en sta , utilizado en esta practica.
3. Elaborar una tabla de resultados en donde incluya el colorante, el corrimiento
en mm y el tiempo de electroforesis, considerando los datos de todas las
pipetas utilizadas.
4. Hacer una grafica de tiempo (min). Vs distancia (mm), co los datos de la
tabla anterior.
PRACTICA No. 3
TITULACION DE UN AMINOACIDO CON UNA BASE
INTRODUCCION
Las propiedades de carga de los aminocidos son muy importantes para
determinar la reactividad de ciertas cadenas laterales de los aminoacidos y de
las propiedades que confieren a las proteinas. Las propiedades de carga del
aminoacidos en solucion acuosa son mejor interpretadas bajo el tratamiento
general de la teoria de ionizacion acido-base.
Seguin el pH y conforme a los principios de la teoria de ionizacin acido-base,
los grupos funcionales -carboxil y -amino de un aminoacido existen como
una de las siguientes combinaciones interconvertibles:
-COOH/-NH3+
COO-/-NH3+
-COO-/-NH2
REACTIVOS
1 Pipeta de 10 ml
1 Pipeta de 1 ml
Potencimctro
NaOH 1.0 M
METODOLOGIA
1. Poner 20 ml de la solucin de glicina en un vaso de precipitado de 100
ml. Hacer lo mismo para los otros aminoicldos.
2. Antes de proceder a las titulaciones de la solucin, es necesario calibrar
la escala de pH del potencimetro sumergiendo los electrodos en
cuando menos una solucin regulada, cuyo pH se conozca con
exactitud.
3. Proceder a la medicin del pH de cada uno de los aminocidos.
4. Aadir 0.1 ml de NaOH 1.0 M y volver a medir el Ph anotando los
resultados.
5. Repetir los pasos 3 y 4 hasta llegar a un pH de 13.0 aproximadamente.
CUESTIONARIO
1. Hacer una grafica de pH vs ml de NaOH gastados, tomando en cuenta
que cada ml de NaOH diluido en 20 ml, aumenta la concentracion de OH
en 10 mmolas.
2. Localizar en la grafica los diferentes pK de los aminocidos.
3. Identificar a que pH tienen poder amortiguador los aminocidos.
4. Qu es una solucin amortiguadora?
5. Determinar el pI de cada uno de los aminocidos.
6. Escribir las diferentes estructuras de la glicina, la lisina y el ac. Aspartico,
de acuerdo a sus propiedades acido-base. Incluir los pKas y el Pi.
PRACTICA No. 4
PRUEBAS CON PROTEINAS Y AMINOCIDOS
INTRODUCCIN
Debido a su importancia como nutrimentos, las protenas se ahn convertido
actualmente en el principal foco de atencio de la mayora de los tecnlogos de
alimentos de todo el mundo. La palabra protena deriva del griego y significa
ser primero, lo cual indica la gran importancia de estos compuestos para la
vida. Para la sntesis de sus propias protenas, de acidos nucleicos y de otras
sustancias nitrogenadas de gran inters biolgico, el hombre solo puede utilizar
el nitrgeno organico proveniente de las protenas animales y vegetales. Las
protenas desempean un papel muy importante en las funciones biolgicas del
organismo humano, entre las cuales se cuentan principalmente la regeneracin
y formacin de tejidos, la sntesis de las enzimas, anticuerpos y hormonas, y
como constituyentes de la sangre.
Los aminocidos son los monmeros y los principales constituyentes de las
protenas, por lo que su distribucio y concentracin determinan
fundamentalmente las propiedades de cada protena. En la naturales se
encuentran mas de 120 aminoacidos; sin embargo, la mayora de las protenas
estn estructuradas solamente por 20 0 21 de ellos. El numero posible de
polmeros que se pueden formar con 20 amonoacidods llega a ser muy grande
ya que, por ejemplo, una protena que contenga 100 aminoacidos alcanza
hasta 20100 secuencias diferentes de amonoacidos y, por tanto, de protenas.
Generalmente no hay tantas combinaciones, sino que cada protena tiene
secuencia de amonoacidos muy establecida y bien definida, lo que repercute
en sus propiedades y funciones biolgicas.
OBJETIVO
Realizar pruebas que permitan conocer algunas propiedades de los
aminocidos y protenas.
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
Albumina
Urea
Agua destilada
Agitador
NaOH al 10%
CuSO 4 al 2%
Embudo de plstico
HCI conc.
Glicina
Solucion de albumina
Gelatina
con tapon
HCl al 19%
NaNO 2 al 5%
Papel filtro
HgCl, nl 5%
HCI al 10%
HNO, conc.
Histidinina
Tirosina al 1%
Pb(CH 3COO)2, al 5% `
METODOLOGIA
1
PROPIEDADES ANFOTERAS
Los aminocidos pueden actuar como acidos y como bases, formando
soles como las bases fuertes y con los acidos fuertes, respectivamente. A
los compuestos que muestran este comportamiento se les llama anfteros.
PRUEBA XANTOPROTEICA
PRUEBA DE AZUFRE
Las protenas que contienen aminoaciods con azufre, tales como la cistena
(enlace disulfuro), se hidrolizan en, en medio bsico dando un sulfuro
inorgnico, que en presencia de acetato de plomo da lugar a un precipitado
negro de sulfuro de plomo.
5.1 Agregar a un matraz erlenmeyer de 125 ml; 2 ml de solucin de albumina, 5
Ml de NaOH al 10% y 2 gotas de una solucionde acetato de plomo al 5%.
5.2 Hervir la mezcla cuidadosamente, agitar durante cinco minutos y observar
El resultado.
6 PRUEBA DEL BIURET
Cuando se calienta la urea por encima de su punto de fusin, se convierte
en biuret, perdiendo amoniaco:
2 NH2 CO NH2
NH2 CO NH NH2 + NH3
Urea
Biuret
Con los ions cupricos, el biuret forma en medio basico un complejo de color
rosa o violeta. Todos los compuestos que contienen 2 o mas enlaces
peptidicos dan con los iones Cu ++ una coloracin anloga a la que da el
biuret. Los aminoaciods (excepto la serina y la treonina) no toman color
violeta en esas condiciones por lo que se dice que dan prueba negativa (los
aminocidos dan color azul en presencia de iones Cu ++.
6.1 Poner 1 gr de urea en un tubo de ensaye seco. Calentar ligeramente el
tubo
Hasta que se funda la urea. Reparar en el olor del gas que se desprende y
acercar un trozo de papel tornasol rojo, humedecido con agua destilado, a
la boca del tubo de ensaye.
6.2 Continuar calentando ligeramente hasta que el producto solidifique. disolver
El residuo blanco en 4 ml de agua caliente y filtrar la mezcla.
6.3 Aadir 4 ml de NaOH al 10% al filtrado. Agregar luego 10 gotas de una
Solucin de CuSO4 al 2%. Agitar la mezcla y observar el color.
6.4 En otro tubo de ensaye colocar 2 ml de solucin de albumina y aadir 2 ml
De 2 ml de NaOH al 10%, 5 gotas de solucin de CuSO 4 al 2%, mezclar
bien y observar.
6.5 poner 0.1 gr de glicina en un tubo de ensaye y agregar 3 ml de NaOH al
PRACTICA No. 5
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
NaF 0.1 M
Tirosina al 0.1%
Cuchillo
Pirogalol al 0.1%
Agua destilada
Colador
Fenol al 0.1%
NaCN al 0.1%
10 Tubos de ensaye
Catecol nl 0.1%
Gelatina
Gotero
Hidroquinona al 0.1%
Hg(NO3), al 2.0%
Bao maria
Resorcinol al 0.1%
Hielo
Termometro
DL-DOPA al 0.1%
4 vasos de precipitado
De 100 ml
a Ph 7.2
pia y papaya
METODOLOGIA
1 POLIFENOLOXIDASA (TIROSINASA)
Durante el proceso de formacin de la melanina, la tirosinasa
reacciona con la tirosina y con la L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), ya
que estas dos sustancias se ensamblan bien al arreglo tridimensional
de la enzima. En esta experiencia se probaran varias sustancia para
observar si se ensamblan bien a la tirosinasa.
1.1 Cortar un trozo de papa cruda en pequeos pedazos (aprox. Un
volumen total de 10 ml) y triturarlos en un mortero.
1.2 Adicionar 10 ml de una solucin 0.1 M de NaF (o 10 ml de una
solucin amortiguadora de fosfato de sodio 0.1 M de pH 7.2), para
extraer la enzima. Mezclar perfectamente.
1.3 Filtrar la mezcla a travs de un colador. Sta solucin es el extracto
enzimtico (tirosinasa).
1.4 Preparar las siguientes mezclas, utilizando tubos de ensaye y
goteros limpios.
a) 15 gotas de agua destilada y 15 gotas de extracto enzimtico.
b) 15 gotas de pirogalol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimtico.
c) 15 gotas de fenol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimtico.
d) 15 gotas de catecol 0.1% y 15 gotas de extracto enzimtico.
e) 15 gotas de hidroquinona 0.1% y 15 gotas de extracto
enzimtico.
f) 15 gotas de resorcinol 0.1% y 15 gotas de extracto
enzimtico.
g) 15 gotas de DL-DOPA 0.1% y 15 gotas de extracto
enzimtico.
h) 15 gotas de tirosina 0.1% y 15 gotas de extracto enzimtico.
1.5 Colocar todos los tubos en un bao maria a 37C.
1.6 Observar cualquier cambio de color despus de 5 y de 10 minutos.
C6H5-CH2-N=C=S+C6H12O6+SO42-+H+
PRACTICA No. 6
EXTRACCION DE LA CAFEINA DEL CAFE
INTRODUCCION
El principio activo que hace que el t y el caf sean utiles para el hombre es la
cafeina que penenece al grupo delos alcaloides.
Los alcaloides generalmente rienen una ponunciada accion fisiologica en el
organismo animal; muchos son venenosos. Son de considerable importancia
en farmacologia, medicina y toxicologia. El trmino "alcaloide (propiedades
alcalinas) es aplicado a un gran numero de productos nuturales de origen
vegetal que contienen nitrogeno en un anillo heterociclico, tales como; pirrol,
isoquinolina,
pero
ocasionalmerrte
se
El t y el caf no son las unicas plantas de las que se puede extraer la cafeina.
Tambin se puede obtener a partir de las nueces de cola, de las hojas de mate,
de las semillas de guarana y, en menor cantidad, de las semillas de cacao.
La cafeina en su forma natural, es probablemente el estimulante ms antiguo
empleado por el hombre. La cafena excita el sistema nervioso central y los
musculos esquelticos, despejando la mente y disminuyendo la posible
sensacion de sueo. Se puede desarrollar simultaneamente una tolerancia y
una dependeneia a la cafeina. Se ha comprobado que un bebedor de caf
(mas de cinco tazas al dia) experimenta aletargamiento, dolores de cabeza y, a
veces, nauseas despus de una abstinencia de 18 horas. Una dosis excesiva
de cafeina produce angustia, irritabilidad, insomnio y temblores rnusculares,
pudiendo llegar incluso a ser toxica, pero se ha estimado que para alcanzar
una dosis letal serla preciso beberse 100 tazas de caf en un tiempo
relativamente corto.
La cafeina siempre ha sido objeto de controversias. Algunas religiones prohiben
la ingestion de bebidas que la contengan, pues consideran que produce
dependencia. Recientemente se ha vuelto a criticar su consumo debido a su
semejanza estructural con las bases puricas edenina y guanina, que son dos
de las cinco bases que forman los acidos nucleicos en los seres vrvos. Se teme
que la substitucion de una de ellas por la cafeina en cualquiera de estos
compuestos que forman los genes se traduzca en defectos en los cromosomas.
OBJETIVO
Extraccion de la cafeina, identificacion de Ia misma y pruebas generales para
detectar alcaloides.
MATERIAL
REACTlVOS
Trozos de porcelana
Caf molido
Agua destilada
Pb(CH,COO) 2 al 10%
Cloroformo
NaOH al 10%
Agitador
Na 2SO4 anhidro
2 Embudos de separacion
Benceno V 1 2:2 s
Filtro de pliegues
HNO 3 conc.
HCl 1 N
Reactivo de Mayer
Capsula de porcelana
Reactivo de Bouchardat
4 Tubos de ensaye
Reactivo de Dragendorff
METODOLOGIA
1 AISLAMIENTO DE LA CAFEINA
1.1 Colocar 35 gr de caf molido, un pedacito de porcelana porosa y 125 ml de
agua destilada en un matraz esfrico de 500 ml equipado con refrigerante
de reflujo.
1.2 Calentar la mezcla a reflujo durante 20 minutos con el mechero.
1.3 Apagar el mechero, y cuando el polvo ha sedimentado en parte pero la
solucion esta todavia caliente, se filtra al vacio con la ayuda de un embudo
de Bchner y un papal de filtro rapido.
1.4 Pasar el Eltrado a un matraz Erleumeyer de 750 ml y afardir 20-25 ml de
solucion de acetato de plomo al 10%.
1.5 Se calienta justo hasta llegar a ebullicion en un bao de agua y se agita
durante 10 minutos, mientrs Ia solucion esta todavia caliente, para coagular
el precipitado.
1.6 Se filtra al vacio en caliente. Se deja enfriar el filtrado hasta temperatura
ambiente y se lleva a un embudo de separacion.
1.7 Se extrae con 25 ml de cloroformo. No se debe agitar demasiado fuerte, ya
que se puede formar una emulsion. Para evitarlo hay que agitar
suavemente para mezclar las dos capas e invertir el embudo con cuidado
varias veces. Se hace esto durante 5 minutos.
1.8 Dejar en reposo el embudo y esperar hasta que las capas se separen, y se
toma la inferior, que es la cloroformica, conservandola aparte.
1.9 Se agregan otros 25 ml de cloroformo a la capa acuosa. Se vuelve a agitar
suavemente durante 5 minutos y se separa la capa inferior.
1.10 Se juntan las dos fracciones cloroformicas y se lavan en utro embudo de
separacion, primero con 10 ml de solucion de NaOH al 10% y despus con
10 ml de agua destilada.
PRACTICA No. 7
CARBOHIDRATOS
INTRODUCCION
Los carbohidratos son los nutrimentos mas abundantes y baratos que se
encuentran en la naturaleza y por tanto los mas consumidos por los humanos
en muchos paises constituyen del 50 al 80% de la dieta del pueblo. Los
carbohidratos de las especies del reino vegetal se sintetizan por el proceso de
fotosintesis y son los principales compuestos quimicos almacenadores de la
energia radiante del sol. Los azucares glucosa y sacarosa, al igual que los
polisacridos, almidon y celulosa, son carbohidratos producidos a travs de
este mecanismo, y se localizan en frutas y vegetales. La mayoria de los
compuestos organicos que se encuentran en las plantas y en los animales son
derivados de carbohidratos, ya que aun Ia misma sintesis de proteinas se lleva
a cabo a travs de aminoacidos que se generan de la reaccion entre
carbohidrtos y compuestos nitrogenados.
Carbohidrato es un trmino muy general aplicable a gran numero de materiales
cuya estructura quimica y funciones biologicas abarcan un amplio espectro.
Esta designacion fue sugerida hace casi un siglo para referirse a Ias sustancias
naturales que presentan una composicin quimica acorde a la formula
Cn(H2O)n,es decir, carbonohidratos.
Entre las funciones realizadas por los carbohidratos naturales cabe mencionar
que hay sustancias tipo gel que lubrican las articulaciones oseas,
determinantes de los diferentes grupos sanguneos, componentes de algunos
antibiticos, secreciones gumiferas que ayudan a cicatrizar las heridas de los
vegetales, cubiertas protectoras de las bacterias y componentes de la pared
celular bacteriana.
OBJETIVO
Realizar algunas pruebas que permitan caracterizar los diversos hidratos de
carbono.
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
10 Tubos de ensaye
Xilosa al 1%
Xilosa
Vaso de precipitado
Arabinosa al 1%
Xilosa
De 400ml
Glucosa al1%
Glucosa
Galactosa al 1%
Glucosa
Agitador
Fructosa al 1%
Fructosa
Balanza granataria
lactosa al 1%
lactosa
Microscopio
Sacarosa al 1%
Sacarosa
Portaobjetos
Almidon al 1%
Almidon
Cubreobjetos
Glucogeno al 1%
Glucogeno
Algodn
Agua destilada
H2SO4 conc.
Reactivo de Molisch
HCI conc.
Reactivo de Bial
1-pentanol
Reactivo de Seliwanoff
Lugol
Reactivo de Benedict
Na2S2O3 al 1%
Reactivo de Barfoed
NaOH al 10%
Hidrocloruro de fenil-
CH3COONa
hidrazina
METODOLOGIA
1. PRUEBA DE MOLISCH
Es una prueba general para hidratos de carbono
1.1 Colocar 4 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos
al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa,
arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, almidon
(agitarlo) y glucogeno.
1.2 En otro tubo de ensaye colocar 4 ml de agua destilada, este tubo servira
como blanco o control.
1.3 Aadir 2 gotas del reactivo de Molisch a cada uno de los tubos de
ensaye y mezclar complemente el contenido.
1.4 lnclinar ligeramente cada uno de los tubos y agregar con precaucion 5
ml de H2SO4 conc., dejndolo resbalar por las paredes del tubo. En el
fondo de los tubos se formara una capa de acido.
1.5 Observar el color que se forma en Ia interfase, en cada tubo, y tomar
nota del mismo. Si aparece un color purpureo, indica que la prueba es
positiva.
2. PRUEBA DE BIAL
Esta prueba permite diferenciar las pentosas de las hexosas.
2.1 Colocar 2 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos
al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa,
arabinosa, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, sacarosa, almidon
(agitarlo) y glucogeno.
2.2 Agregar 2 ml de agua destilada en otro tubo de ensaye para que sirva
de control.
2.3 Aadir 3 ml del reactivo de Bial a cada uno de los tubos de ensaye.
2.4 Calentar cuidadosamente cada tubo sobre la llama de un mechero,
hasta que la mezcla comience a entrar en ebullicion.
2.5 Observar el color que se forma en cada uno de los tubos de ensaye.
2.6 Si los colores no son diferentes, aadir 5 ml de agua y 1 ml de 1pentanol a cada tubo de ensaye.
2.7 Agitar los tubos, observarlos y anotar la coloracion. EI producto de
condensacion coloreado se concentrara en la capa de 1- pentanol. Las
pentosas desarrollan un color verde azulado y las hexosas verde, pardo
o pardo rojizo.
3. PRUEBA DE SELIWANOFF
En esta prueba se pone de manifiesto las velocidades relativas de
deshidratacion de los cerbohidratos. Una cetohexosa reecciona
rapidamente, mientras que una aldohexosa reacciona mas lentamente.
3.1 Preparar un bao de agua a ebullicion en un vaso de precipitado de 400
ml.
3.2 Colocar 1 ml de cada una de las siguientes soluciones de carbohidratos
al 1% en nueve tubos de ensaye (una solucion por tubo), xilosa,
CUESTIONARIO
1. Elaborar un cuadro en donde sc concentren los resultados de las 8 pruebas
efectuadas, anotando el nombre de la prueba, el carbohidrato analizado y su
rcesultado positivo u negativo.
2. Tomando en consideracion los resultados obtenidos, sacar conclusiones
para cada uno de los carbohidratos empleados.
3. Escribir el fundamento en el cual se basan las pruebas de Molisch, Bial,
Seliwanoff, Benedict y Barfoed.
4. Escribir el mecanismo de hidrolisis del enlace acetal de Ia sacarosa.
5. Por qu razon la determinacion del punto de fusion de una osazona no es
util para identiticar el carbohidrato del cual proviene?
6. Hacer los dibujos de los cristales de las osazonas observadas al
microscopio.
PRACTICA No. 8
SINTESIS DE OCTAACETATO DE SACAROSA
INTRODUCCION
La sacarosa es el disacarido mas abundante en las plantas y se prepara
comercialmente a partir de la caa de azucar, de la remolacha azucarera y de
Ia savia de arce. Es conocida por su sabor dulce y es utilizada en muchos
alimentos como edulcorante. La acetilacion de Ios ocho grupos hidroxilo de
ste azucar, genera la formacion de octaacetato de sacarosa que posee un
sabor amargo muy intenso.
El octaacetato de sacarosa es un producto natural que ha sido aislado de las
raices de muchas especies de Clematis. La raiz de la Clematis japonica
contiene un 0.15% en peso seco de este compuesto. Presumiblemente, el sabo
amargo de este compuesto impide la predacion de estas plantas. Los humanos
han utilizado comercialmente esta sustancia como un repelente gustatorio a
causa de su sabor amargo. Se ha utilizado para desnaturalizar el alcohol, como
un disuasivo para evitar que las personas se coman las uas de las manos y
para hacer que el azucar destinada a Ia alimentacion de animales sea no
comestible para los humanos. A una concentracion de 0.06%, este compuesto
amarga el azucar Io suficiente para no ser ingerido. Se ha demostrado que este
compuesto no es toxico y que no afecta el sabor de la carne o la leche de los
animales que la consumen.
OBJETIVO
Sintetizar el compuesto octaacetato de sacarosa y probar su sabor amargo.
MATERIAL
MATERIAL
REACTIVOS
Cuerpos de ebullicin
Bao Maria
Embudo de Buchner
Anhidrido actico
Balanza granataria
Hielo
Sacarosa
CH 3COONa anhidro
Agua destilada
Etanol del 95%
Etanol del 95% frio
Cristales de octaacetato
de sacarosa
METODOLOGIA
1 SINTESIS DE OCTAACETATO DE SACAROSA
1.1 Pesar 2 gr (5.8 mmoles) de sacarosa y 1 gr (12 mmoles) de acetato de
sodio anhidro.
1.2 Agregar los compuestos anteriores y unos cuerpos de ebullicion, a un
matraz de fondo redondo perfectamente limpio y seco.
1.3 Adicionar cuidadosamente 10 ml (10.8 gr, 106 mmoles) de anhidrido
actico.
1.4 Adaptar un condensador de reflujo al matraz y calentar la mezcla hasta
que empiece a reflujar (precaucion!) lavar con mucha agua si la mezcla
entra en contacto con la piel).
1.5 Retirar la flama por unos minutos, para pemtitir que la reaccion
exotrmica termine, y despus, continuar calentando.
1.6 Mantener la reaccion a reflujo hasta que todos los reactivos se
disuelvan (5 a 10 minutos).
1.7 Calentar otros 5 minutos.
1.8 Dejar enfriar el matraz de reaccion hasta que sea posible tocarlo. Una
vez frio, pasar el contenido a un matraz Erlenmeyer de 750 ml que
contenga 50 gr de hielo y 50 ml de agua destilada.
1.9 Agitar la mezcla con una varilla de vidrio durante 5 a 10 minutos (hasta
que los productos se condensen como una miel densa en la varilla, en
las paredes y fondo del matraz).
1.10
Decantar el agua de la miel y adicionar 100 ml de agua destilada
al matraz.
1.11
Agitar el matraz durante 5 minutos, de tal manera que los
productos se laven con el agua.
1.12
Decantar el agua de lavado y repetir la misma operacion de
lavado 2 veces mas, utilizando 100 ml de agua destilada en cada
ocasion.
1.13
Cuidadosamente se decanta toda el agua del lavado final.
PRACTICA No. 9
EL ETANOL Y LA QUIMICA DE LA FERMENTACION
INTRODUCCION
Entre los procesos quimicos que se conocen desde mas antiguo se encuentran
la elaboracin del vino, de la cerveza y del pan. Aunque las fermentaciones se
hayan empleado durante siglos, no fue sino hasta el siglo pasado cuando los
quimicos empezaron a entenderlas desde un punto de vista cientifico.
La transformacion del azucar en etanol y dioxido de carbono se debe a un
complejo enzimatico notablemente activo llamado zimasa. La zimasa es un
complejo de al menos 22 enzimas distintas, cada una de las cuales cataliza
uno de los pasos de la secuencia de reacciones que produce la fermentacion.
Las principales fuentes de azucares para fermentaciones son los almidones y
melazas que se obtienen como residuos del refinado del azucar de caa. La
zimasa es segregada por celulas de levadura tales como Saccharomyces
cerevisiae y Saccharomyces ellipoidus.
En el proceso se libera calor, por lo que debe enfriarse la mezcla para
mantener la temperatura por debajo de los 32 C y evitar la inactivacion de las
enzimas. Al principio se necesitan grandes cantidades de oxigeno para que las
clulas de levadura se reproducen en condiciones optimas, pero el proceso de
elaboracion de alcohol es en si mismo anaerobico. Durante la fermentacion, el
desprendimiento de dixido de carbono establece en seguida las condiciones
anaerobias necesarias, ya que si hubiese un aporte continuo de oxigeno solo
se produciria agua y dioxido de carbono.
OBJETIVO
Obtencion de etanol a partir de sacarosa por medio del proceso de
fermentacion.
MATERIAL
MATERIAL
REACTIVOS
Tapon monohoradado
Sacarosa
Agua destilada
de 3 o 4 litros
Papel filtro
Solucion Pasteur
Levadura de parmderia
Manguera de 1 m
Ba(0H) 2 al 5%
Tierra de diatomeas
Embudo Buchner
Xileno, queroseno o
aceite mineral
Acodado
METOLOGIA
1. OBTENCION DE ETANOL
1.1 Colocar 80 gr de sacarosa en un frasco de 4 litros; aadir 700 ml de
agua destilada a temperatura ambiente, 70 ml de solucion Pasteur y
unos 15 gr de levadura de panaderia.
1.2 Agitar vigorosamente y tapar el frasco con un tapon monohoradado del
que salga un tubo que conduzca a un recipiente con una solucion de Ba
(OH)2.
1.3 Proteger la solucion de hidroxido de bario del aire, con una capa de
xileno o queroseno que la cubra. La formacin de un precipitado blanco
de carbonato de bario nos indicara el desprendimiento de CO 2.
1.4 Una vez montado el aparato, dejar reposar Ia mezcla a 25 C hasta que
la fermentacion sea completa, es decir, hasta que no se desprenda mas
gas. En general, se precisara una semana para ello.
1.5 Cuando la fermentacion se ha completado, se destapa el frasco y se
"sifona" el liquido procurando no agitar el sedimento.
1.6 Si el liquido esta turbio, se puede clasificar como sigue; aadir 2
cucharadas de tierra de diatomeas a 200 ml de agua, agitar
vigorosamente y filtrar al vacio, se formara una fina capa de tierra de
diatomeas sobre el papel filtro, se desecha el tiltrado y se procede a
filtrar la solucin alcoholica.
1.7 La solucion clarificada se pasa a un aparato de destilacion simple y se
destila hasta que se hayan recogido 200-250 ml del liquido o se ha
alcanzado la temperatura de ebullicin del agua (94 C para Ia ciudad
de Morelia).
1.8 Calcular el rendimiento en etanol suponiendo que el producto obtenido
tiene un 75% de agua.
CUESTIONARIO
1. Cuales son los mtodos empleados industrialmente para obtener etanol
absoluto?
PRACTICA No. 10
AISLAMIENT0 DE LA LACTOSA
INTRODUCCION
El carbohidrato que se presenta en mayor proporcion en la leche es la lactosa
(alrededor del 5%). La lactasa es el unico carbohidrato sintetizado por los
mamiferos. Cuando se hidroliza da una molcula de D-glucosa y otra de DgalactosaLa lactosa se sintetiza en las glandulas mamarias, y es en ellas
donde tiene lugar la conversion de una molcula de glucosa en galactosa y la
posterior union de esta ultima a la glucosa.
Cuando la leche se deja durante mucho tiempo a temperatura ambiente, se
agria. En la leche hay muchas bacterias, particularmente lactobacilos. Estas
bacterias actuan sobre Ia lactosa de la leche proporcionandole un gusto agrio
debido al acido lactico. Estos microorganismos hidrolizan la lactosa y producen
acido lactico a partir de la galactosa. Dada que la formacion de acido lctico
implica un descenso del Ph de la leche, sta coagula cuando se agria.
Muchos derivados de la Ieche se elaboran permitiendo que esta se agrie antes
de empezar a elaborarlos. Por ejemplo, se suele dejar que la leche o la crema
se agrie un poco por accion de las bacterias del cido lactico antes de batirla
para preparar la mantequilla; el fluido que queda despus de batir esa lche
ligeramente acida se denomina suero de mantequilla. Otros productos similares
son la crema agriada, el yogurt y ciertos tipos de quesos.
OBJETIVO
Aislar la -lactosa de la leche y hacer su caracterizacion.
MATERIAL
REACTIVOS
Leche descremada
3 Agitadores
Espatula
Carbon activado
3 Tubos de ensaye
Lactosa
Placa calefactora
Glucosa
Galactosa
Embudo Buchner
Agua destilada
Crisol
HNO3 conc.
Abatelenguas de madera
HCI conc.
Hielo
Termometro
CaO
Microscopio y portaobjetos
METODOLOGIA
1. AISLAMIENTO DE LA -LACTOSA
1.1 Colocar 200 ml de leche descremada en un vaso de precipitado de 600
ml y calentar la leche hasta aproximadamente los 40 C.
1.2 Aadir gota a gota una solucion de acido actico diluido, con un gotero.
Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el
proceso de adicion.
1.3 Continuar agregando acido actico hasta que no precipite mas caseina
(aprox. a un pH de 4.7), Debe evitarse un exceso de acido porque
puede hidrolizarse parte de la lactosa (utilizando papel pH se puede ir
verificando el cambio de pH).
1.4 Agitar la caseina hasta que se forme una gran masa amorfa. Separar la
caseina con ayuda de una varilla o espatula y colocarla en atro vaso.
1.5 Agregar, inmediatamente, 5 gr de carbonato de calcio en polvo al vaso
que contiene el liquido del que se ha separado la caseina y agitar esta
mezcla durante unos minutos.
1.6 Calentar la mezcla a ebullicion suave durante aproximadamente 10
minutos. Este provocara la precipitacin casi completa de las albuminas.
1.7 Filtrar la mezcla caliente al vacio y utilizando papel filtro Whatman No, 1.
Con esto se lograra separar las albuminas precipitadas y el carbonato
de calcio que aun quede.
1.8 Concentrar el filtrado, en un vaso de precipitado de 600 ml con un
mechero, hasta aproximadamente 30 ml. Utilizar varios agitadores para
ayudar a conseguir una ebullicion homognea y evitar las salpicaduras
que se producirian al ir aumentando el precipitado.
1.9 Tambin se puede formar espuma si Ia mezcla entra en ebullicion con
demasiada fuerza.Esto puede controlarse soplando suavemente sobre
la superficie de lu disolucion de lactosa.
1.10
Agregar 175 ml de etanol del 95% (cuidado! lejos de cualquier
llama) y 1.5 gr de carbon activado a la disolucion caliente.
1.11
Despus de mezclar bien, filtrar la solucion caliente al vacio a
travs de papel filtro Whatman No, 1. El filtrado debe ser transparente.El
filtrado puede enturbiarse debido a la cristalizacion rapida de Ia lactosa,
despus de la filtracion al vacio. Si la turbidez aumenta con relativa rapidez al
dejarla en reposo, debe evitarse otra filtracion, ya que se puede perder el
producto.
1.12
Pasar Ia solucion a un matraz Erlenmeyer y dejarla reposar
durante una semana. En algunos casos, se requieren varios dias para
que la cristalizacion termine.
1.13
La lactosa cristaliza en la pared y en el fondo del matraz.
Desalojar los cristales y filtrarlos al vacio. Lavar el producto con unos
pocos mililitros de etanol acuoso frio al 25%.
1.14
La lactosa cristaliza en una molcula de agua C 12H22O11.H20.
pesar el producto cuando est completamente seco.
1.15
La densidad de la leche es de 1.03 gr/ml, Con este valor, calcular
el porcentaje de lactosa en la Ieche.
2. PRUEBA DEL ACIDO MUCICO
Esta prueba permite identificar a la lactosa.
2.1 Colocar 0.2 gr de Ia lactosa aislada, 0.1 gr de glucosa y 0.1 gr de
galactosa en tres tubos de ensaye.
2.2 Aadir 2 ml de agua destilada a cada uno de los tubos y disolver los
solidos mediante calentamiento, si es necesario.
2.3 Agragar 2 ml de HNO3 conc. a cada uno de los tubos.
2.4 Calentar los tubos en un bao de agua a ebullicion durante 1hora,
utilizando una placa calefactora y la campana de extraccion (se
desprenderan oxidos de nitrogeno muy toxicos).
2.5 Retirar los tubos del bao y dejar que se enfrien lentamente. Rascar los
tubos de ensayo con agitadores limpios, para inducir la cristalizacion.
2.6 Cuando los tubos hayan alcanzado la temperatura ambiente, colocarlos
en un bao de hielo.
2.7 Aproximadamente una hora y media despus de haber apartado los
tubos del bao de agua, empezara formarse un fino precipitado de acido
mucico en los tubos de galactosa y de lactosa.
2.8 Dejar reposar los tubos de ensaye durante una semama, para que se
complete la cristalizacion.
2.9 Asegurarse de la insolubilidad del solido formado, aadiendo
aproximadamente 2 ml de agua destilada y agitando la mezcla
resultante. Si el solido no se disuelve, es que se trata de acido mucico
H6H10O8(acido galactarico).
2.10
Filtre al vacio y lave el producto varias veces con agua destilada.
Conservar los cristales para las siguientes pruebas.
3. IDENTIFICACION DEL ACIDO MUCICO
Formacion de pirrol
3.3 Colocar una pequea cantidad de ac. mucico en un tubo de ensaye y
agregar unas gotas de NH4OH conc. hasta que ya no se vea reaccion
(se produce mucato de amonio). Calentar la sal que se formo y acercar
a la boca del tubo un abatelenguas humedecido con HCI concentrado.
La formacion de un color rojo indica la evolucion de pirrol.
C6H8O8(NH4)2
CUESTIONARIO
1. Dar un mecanismo para la hidrolisis catalizada por acido del enlace
acetal de la lactosa.
2. En el equilibrio existente entre la -lactosa y la -lactosa en solucion
acuosa, esta ultima se encuentra en gran proporcion Por qu?
3. En una mezcla de lactosa en equilibrio hay una pequea cantidad en
forma de aldehido libre sin embargo, la prueba de Benedict da positiva.
Explicar este hecho.
4. Qu porcentaje de lactosa se aislo de la leche?
5. Qu resultado se obtuvo en la experiencia 2.9?
6. Escriba las reacciones de formacion de acido mucico (exp. 2) a partir de
la lactosa y la galactosa.
7. Qu compuesto se forma al utilizar glucosa en la experiencia 2?
8. Si se determinara la rotacion optica del acido mucico Qu valor seria
de esperar? Por qu?
9. Hacer un dibujo de los cristales de mucato de potasio observados al
microscopio.
10. En las experiencias 3.2 y 3.3 se pone de manifiesto la relacion existente
entre las hexosas y los compuestos heterociclicos de cinco miembros
como el furano y el pirrol. Cual es la estructura de estos compuestos?
Qu resultados se obtuvieron en estas experiencias?
PRACTICA No. 11
HIDROLISIS DE POLISACARIDOS
INTRODUCCION
La hidrolisis de una macromolcula puede efectuarse ulilizando diversos
procedimientos; catalizando con acidos o bases fuertes, con catalizadores
organicos e inorganicos y por medio de enzimas hidroliticas. Las enzimas son
especificas en su moda de accion, tienen la particularidad de acelerar el
desdoblamiento (digestion) de diversas molculas, introduciendo una molcula
de agua entre las uniones glicosidicas (en el caso de los polisacaridos). En el
caso del almidon, casi todos los vegetales contienen dos enzimas hidroliticas
diferentes, conocidas tradicionalmente como -amilasa y -amilasa. Ambas
atacan Ia fraccion de amilosa y amilopectina en los enlaces (1,4). Existen
otros catalizadores, llamados enzimas desramificados, que hidrolizan
especificamente el enlace (1,6) presente en la amilopectina.
A diferencia de la celulosa, el almidon puede ser digerido por los seres
humanos (y por la mayoria de los organismos) debido a la presencia de
amilasa salival y amilasa pancreatica en las secreciones digestivas (la accin
de ambas enzimas es parecida a la de la -amilasa de las plantas), las cuales,
en accion combinada con otras enzimas digestivas (sobre todo maltasa y
enzimas desramificadoras), degradan por completo el almidon a -D-glucosa,
la cual es absorbida y metabolizada posteriormente.
MATERIAL
MATERIAL
REACTIVOS
Pipeta Pasteur
Bao Maria
Almidon al 1%
Vaso de p.p. de 50 ml
Pipeta de 5 ml
HCl conc.
Agitador
Probeta graduada
Lugol
NaOH al 20%
12 Tubos de ensaye
Papel pH
Reactivo de Lucas
Reactivo de Benedict
o azulejo blanco
NaCl 0.1 M
METOLOGIA
1 HIDRLISIS ACIDA DEL ALMIDON
1.1 Colocar 20 ml de la solucion de almidon al 1% en un vaso de precipitado de
100 ml, agregar 20 gotas de HCL conc. y calentar de modo que hierva
suavemente. Agitar constantemente.
1.2 Cada 5 minutos, se toma una gota de la mezcla con una pipeta Pasteur y
se deposita sobre una excavacin de una placa de porcelana (o sobre un
azulejo blanco).
1.3 Adicionar una gota de lugol y anotar el color producido.
1.4 Continuar calentando hasta que ya no se produzca la coloracion azul con la
solucion indicadora de lugol (un color amarillo indica hidrolisis total).
1.5 Tomar con una pipeta 1 ml del hidrolizado que queda en el vaso y colocarlo
en un tubo de ensaye. Ajustarle el pH a neutralidad, adicionando NaOH al
20% (aprox. 18 gotas).
1.6 Realizar la prueba de Benedict con el hidrolizado neutro.
2 HIDROLISIS ACIDA CA TALLMDA DEL ALMIDON
2.1 Colocar 10 ml de la solucion de almidon al 1% en un vaso de precipitado de
100 ml y agregar 3 ml del reactivo de Lucas (precaucion! causa
quemaduras graves).
2.2 Calentar el vaso durante 3 minutos de modo que la mezcla hierva
suavemente, dejar enfriar y tomar una muestra para realizar la prueba de
lugol.
2.3 Neutralizar el hidrolizado del vaso, adicionando NaOH al 20)% (aprox. 8
ml).
2.4 Tomar una muestra de 1 ml del hidrolizado neutralizado y realizar la prueba
de Benedict.
3 REACCION CON I3
3.1 En un tubo de ensaye se colocan 5 ml de la solucion de almidon al 1% y se
agregan 2 gotas de lugol. Calentar el tubo a ebullicion.
3.2 Dejar enfriar el tubo de ensaye a temperatura ambiente. Como se explica
que ocurran estos cambios de color? (azul rojizo).
4 HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON
4.1 Enjuagarse la boca con agua.
4.2 Colectar unos 3 ml de saliva en un vaso de precipitado de 50 ml (una
persona normalmente secreta 1500 ml de saliva por dia).
4.3 Determinar el pH de la saliva utilizando papel pH.
4.4 Utilizando una pipeta, se colocan 2 ml de saliva en una probeta graduada y
se diluyen con agua destilada hasta obtener un volumen final de 50 ml.
4.5 Preparar un lote de 10 tubos de ensaye, cada uno conteniendo 4 ml de
agua destilada y 5 gotas de lugol.
4.6 En un tubo de ensaye grande, se agregan 10 ml de una solucion de
almidon al 1% y 2 ml de una solucin 0.1 M de NaCl.
4.7 Preparar un bao de agua a una temperatura de 38 2 C e introducir el
tubo de ensaye que contiene la solucion almidon/NaCl.
( 4 minutos)
( x minutos para lamuestra) (y dilucin) = unidades
1 ml
4 min
8 min
CUESTIONARIO
1. Hacer un cuadro en el cual se comparen las diferentes condiciones utilizadas
(pH, temperatura y catalizador) y el tiempo necesario para la hidrolisis del
almidon, en cada uno de los distintos mtodos empleados.
2. Por qu se realiza la prueba de Benedict como parte de los experimentos?
3. Por qu razon se realiza la prueba de lugol?
4. Por qu es necesario neutralizar los hidrolizados para realizar la prueba de
Benedict?
5. Cual es el modo de accion de un catalizador?
6. Respuesu a la pregunta del inciso 3.2
7. Por qu la hidrlisis enzimatica se realizo a una temperatura de 38 2
C? `
8. Que funcion tiene el NaCl durante la hidrolisis enzimtica?
PRACTICA No. 12
CUANTIFICACION DE VITAMINA C
INTRODUCCION
La unica vitamina para Ia cual es valedora una investigacin sencilla es la
vitamina C (acido ascrbico). Esta investigacion puede utilizarse para indicar la
presencia de acido ascorbico en un alimento y tambin puede usarse para
calcular Ia cantidad que del mismo existe. El mtodo que aqui se describe no
se puede utilizar en alimentos fuertemente coloreados.
EI acido ascrbico es una sustancia que actua naturalmente como reductor.
Por esta accin reductora, decolora la tintura azul de diclorofenol-indofenol, con
la que se une, produciendo una solucion incolora. La cantidad de solucin de
tintura azul (de concentracion conocida), que se decolora por un cierto volumen
de solucin problema, es una medida de la cantidad de acido ascorbico
presente en la solucion.
El acido ascorbico es un antioxidante natural, razon por la cual inhibe el
pardeamiento de frutas y verduras, pero llega un momento en que l mismo
llega a oxidarse y de esta manera se inutiliza su accion. Por esto si se agrega
acido ascorbico, hay un retraso en la aparicin del pardeamiento. EI retraso es
aun mayor, consiguiendo una concentracion alta de acido ascorbico. Es esta,
una de las aplicaciones de la vitamina C en la tecnologia de los alimentos.
OBJETIVO
Determinar la presencia de vitamina C, cuantiticarla en jugos de naranja
comerciales y demostrar su efecto de antioxidante natural.
MATERIAL
REACTIVOS
Embudo de separacion
Eter etilico
Carbon activado
Embudo de Buchner
Acido oxalico
Mortero y pistilo
Agua destilada
5 Tubos de ensaye
Acido actico al 5%
Embudo de plastico
Solucion de 2,6-diclorofenol-indofenol
Pipeta de 10 ml
Hortalizas y frutas
Una marnzana
5 Vidrios de reloj
comerciales
CUESTIONARIO
1
2
3
4
5
6
PRACTICA No. 13
AISLAMIENTO DE ACIDO OLEICO
INTRODUCCION
El aceite de oliva ha sido apreciado desde tiempo lnmemorial. Se ha utillzado
como ingrediete en la preparacin de alimentos. cosmeticos y modicamentos.
Su presencia en nuestros dias aun ess muy importante. El aceite de oliva
consiste principalmente de glicerol esterificado con acidos grasos. El mas
importante constituyente del aceite de oliva es la trioleina (el glicerol esta
esterificado con tres molculas de acido oleico). Al lgual que otros triglicridos,
la trioleina existe como tres poliformas. El acido oleico presenta un doble
enlace tipo cis y tiene la formula C 17H33COOH, representa del 64-80% de los
acidos grasos presentes en el aceite de oliva.
OBJETIVO
Aislar el acido oleico del aceite de oliva.
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
Aceite de oliva
Acetona
Placa calefactora
Trietilenglicol
Hielo/acetona
KOH
Urea
Embudo de separacin
Agua destilada
Metanol
Embudo
HCl conc.
Eter etlico
Bao Maria
METODOLOGIA
1 SEPARACION DE ACIDOS GRASOS SATURADOS
1.1 Pesar 10 gr de aceite de oliva en un matraz Erlenmeyer de 125 ml,
adicionar 20 ml de trietilenglicol y 2.0 gr de KOH.
1.2 Calentar la mezcla a 160 C en una placa calefactora durante 10 minutos,
para hiidrolizar los steres glicerol.
1.3 Dejar enfriar la mezcla. Agregar 50 ml de agua destilada y 10 ml de HCI
concentrado.
1.4 Extraer la mayoria de los acidos grasos no-saturados presentes en la
emulsion resultante, utilizando un embudo de separacion y tres porciones
de 10 ml de ter etilico. Reunir los 30 ml de extraccion etrea.
1.5 Reducir el contenido de agua del extracto etreo, lavando con una sulucion
saturada de NaCl y por adicion de un poco de Na2SO4 anhidro.
1.6 Filtrar la mezcla y evaporar la solucion resultante a volumen constante
utilizando un bao Maria (hacerlo en la campana de extraccion).
1.7 Agregar 75 ml de acetona y enfriar la mezcla en un bao de hielo/acetona (15 C), para crislalizar los acidos grasos saturados presentes.
1.8 Filtrar la mezcla para remover los cristales, utilizando papel fritro Whatman
No. 1, embudo Buchner y bomba de vacio.
1.9 Finalmente se evapora el filtrado en bao Maria bajo campana de
extraccion.
2 AISLAMIENTO DEL ACIDO OLEICO
2.1 Preparar una solucion de 10 gr de urea y 50 ml de metanol (cuidado! es
muy toxico, se absorbe por la piel), adicionar todo el volumen de esta
solucion al filtrado obtenido en la experiencia 1.9
2.2 Enfriar la solucion en un bao de hielo/acetona, para cristalizar el complejo
de inclusion urea-acido oleico.
2.3 Separar los cristales usando tiltracion al vacio (esto deja a los otros acidos
grasos no saturadcs en el filtrado).
2.4 Transferir los cristales a un embudo de separacion y adicionar 50 ml de
agua destilada.
2.5 Extraer tres veces utilizando 20 ml de ter etilico en cada ocasion y reunir
los extractos etreos.
2.6 Evaporar el ter etilico con un bao de agua hirviendo bajo la campana de
extraccion, para obtener el acido oleico puro.
CUESTIONARIO
1
2
3
4
5
6
PRACTICA No. 14
EXTRACCION DE LIPIDOSY ALGUNAS DE SUS PROPIEDADES
INTRODUCCION
El termino lipido se utiliza para describir a las sustancias grasas que son
insolubles en agua pero solubles en solventes organicos tales como etanol,
cloroformo y ter. Qumicamente son esteres de acidos grasos de cadena larga
y se clasifican de acuerdo a la naturaleza de su aocohol. La hidrolisis alcalina
de los lipidos da como productos un alcohol y sales de sodio o potasio de los
acidos grasos que los constituyen. Esto es conocido como saponificacin y los
productos de la hidrlisis frecuentemente son solubles en agua, a diferencia de
los lpidos originales. Qumicamente, se pueden dividir en dos grandes grupos:
lpidos simples y lpidos compuestos. Los esteroides y las vitaminas
liposolubles tambin se consideran como lpidos a causa de susu
caractersticas de solubilidad, a estos compuestos se les conoce como
derivados de lpidos. Sin embargo, muchos de los derivados de lpidos son
alcoholes y no esteres y por tanto no pueden ser saponificados.
OBJETIVO
Realizar la extraccion de los fosfulipidos lecitina y cefalina de la yema de
huevo, y determinar algunas de las propiedades generales de los lpidos.
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
20 Tubos de ensaye
Eter etilico
Acetona
Hielo
Agua destilada
Huevo
Embudo
Anhidrido actico
Mantequilla
Agitador
H2SO4 conc
Margarina
Bao Maria
Ciclohexano
Manteca
Ciclohexano
Aceite de olivo
KMnO4 0.1 M
METODOLOGIA
1
Mantequilla
Manteca
Aceite de olivo
Agua
Acetona
Cloroformo
ter
Etanol
2.2 Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el cuadro de solubilidad,
colocar gotas de la mezcla mas soluble en un trozo de papel filtro.
2.3 Dejar secar las gotas y observer el resultado colocando el papel filtro frente
auna fuente lumnosa.
2.4 Nuevamente considerando el cuadro de solubilidad, seleccionar una mezcla
preparada con etanol y que haya resultado soluble.
2.5 Adionarle 1 ml de agua destilada y mezclar perfectamente.
2.6 Observar la solucion inmediatamente despus de agitar, dejar en reposo el
tubo 10 minutos y observarlo nuevamente.
2.7 En 2 tubos de ensaye colocar 3 ml de agua destilada, agregar 10 gotas de
aceite de oliva a uno de los tubos y al otro 10 gotas de una solucion de
lecitina disuelta en aceite de oliva (se repara agregando 2 ml de aceite de
7. Que efecto tiene la lecitina sobre la solubilidad del aceite de oliva? Como
se explica tal efecto? (experiencia 2.8)
8. Cual es el proposito de realizar la prueba de estandarizacion? (experiencia
3)
9. Describir lo observado en la experiencia 3.4
10. Qu resutados se obtuvieron en la experiencia 3.7? Qu se puede
concluir acerca de los mismos?
11. Anotar los resullados obtenidos en la experiencia 4
PRACTICA No. 15
INDICES DE SAPONIFICACION, DE YODO Y DE
PEROXIDO, EN GRASAS Y ACEITES
INTRODUCCION
Existe un gran numero de anllisis para evaluar las caracteristicas fisicas y
quimicas de las grasas y aceites, pero los mas comunes son los desarrollados
por la American Oil Chemists Society (AOCS) que muchos paises han
adoptado posteriomente. Los mtodos instrumentales de cromatografia y de
resonancia magntica nuclear actualmente son muy impactantes y
REACTIVOS
Balanza granataria
Fenolftaleina
HCl 0.5 N
CHCl 3 o CCI4
Tubos de vidrio de 1 m
Soln. de Wijs
Bao Maria
Agua desiilda
Bureta
KI al 10%
Casquetito de vidrio
Almidon al 1%
Papel aluminio
Solvente A
Solvente B
Na 2S2O3 0.002 N
Grasas y aceites
METODOLOGIA
1 INDICE DE SAPONIFICACION
La determinacion del indice de saponificacion, cuya medida indica Ia cantidad
de materia saponificable presente, se expresa como el numero de mg de KOH
requeridos para saponificar 1 gr de muestra.
Ind. De saponificacion =
MINIMO
MEDIO
MAXIMO
Oliva
185
190
194
Uva
185
190
195
Mani
186
190
194
Girasol
188
192
194
Maz
188
192
195
Algodn
191
193
196
Coco
246
253
260
Manteca
221
227
233
Cebo vacuno
193
195
198
INDICE DE YODO
Este indice se define cumo el numero de gramos de yodo que reaccionan
con 100 gr. De lpidos, y es una medida del promedio de dobles enlaces o
insturaciones que contienen los aceites y las grasas.
2.1 Pesar 0.5 gr de muestra detro de un matraz Erlenmeyer de 500 ml con
tapon.
2.2 Disolver la muestra en 15 ml de cloroformo o tetracloruro de carbono.
Calentar si es necesario empleando un bao Maria y la campana de
extraccin.
2.3 Dejar enfriar complemente.
2.4 Hacer un blanco en otro matraz, poniendo 15 ml de cloroformo o
tetracloruro de carbono, pero sin muestra.
2.5 Agregar a cada uno de los matraces 25 ml de solucion de Wijs.
2
MINIMO
MAXIMO
ACEITE
MINIMO
MAXIMO
Oliva
78
90
Maz
107
120
Mani
93
106
Soja
125
135
Nabo
102
108
uva
130
140
Ssamo
103
105
Girasol
123
137
Algodn
104
117
cacahuate
88
98
Coco
10
Ricino
83
84
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
INDICE DE PEROXIDO
Se define como los milimoles de peroxido (-0-0-) por Kg de aceite. Esta
prueba proporciona una idea del grado de oxidacion de una grasa o aceite,
y con ello un indice de su mayor o menor propension al enranciamiento.
Pesar exactamente 0.2 gr de aceite en un casquetito de vidrio, previamente
tarado.
lntroducirlo en un matraz Erlenmeyer con tapon y agregar 25 ml del
solvente A.
Agitar suavemente para disolver la muestra.
Agregar 1 ml del solvente B. Agitar por rotacion suave durante 60
segundos exactos a la oscuridad (envolver totalmente el matraz con papel
aluminio).
Inmediatamente agregar 100 ml de agua destilada recientemente hervida y
fria, y 2 ml de solucion de almidon al 1%.
ml de Na2 S 2O 3
gr de muestra
Aceite fresco
10
15 a 20
CUESTIONARIO
1 Que utilidad tiene el conocer el indice de saponificacion de una grasa o
aceite?
2. Calculo del indice de saponificacion de la muestra.
3. Qu relacion existe entre el peso molecular del material a saponificar y su
indice de saponificacion?
4. Calculo del indice de yodo de la muestra.
5. Tomando como base el indice de yodo Qu es un aceite secante,
semisecante o no secante?
6. Qu problema se puede presentar cuando se determine el indice de yodo
de un aceite secante?
7. Cual es el fundamento quimico de la determinacion del indice de peroxido?
8. Calculo del indice de peroxido de la muestra.
9. Que limitantes tiene la determinacin del indice de perxido, con respecto a
la oxidacion de una grasa o aceite hasta compuestos con carbonilos e
hidroxilos?
PRACTICA No. 16
PREPARACION DE UN JABON
INTRODUCCION
El jabon, tal como lo conocemos hoy en dia, no apareci hasta el siglo I de
nuestra era. Hasta ese momento la ropa se lavaba mojandola y restregandola
sobre roca. Algo mas tarde se desucubrio que ciertas hojas, raices, frutos y
cortezas formaban espumas jabonosas que solubilizaban y eliminaban la
suciedad. Actualmente se conoce a estas sustancias naturales por el nombre
de saponinas.
MATERIAL
REACTIVOS
Estufa
Agua destilada
Balanza granataria
NaOH
Bomba de vacio
Bao Maria
Embudo Buchner
NaCl
Abatelenguas
Hielo
Papel filtro
CaCl 2, al 4%
Na 3PO4
Grasa o aceite
METODODOGIA
1 PREPARACION DE JABON
1.1 Preparar una disolucion de 10 gr de NaOH en una mezcla de 18 ml de
agua y 18 ml de etanol del 95%.
1.2 Poner 10 gr de manteca de cerdo (o de otra grasa o aceite) en un vaso de
precipitado de 250 ml y agregarle la solucion anterior.
1.3 Calentar la mezcla en un bao de agua durante unos 30 minutos, durante
los cuales, y para evitar la formacion de espuma, se iran aadiendo poco a
poco 40 ml de una mezcla al 50% de etanol y agua. Mantener una
agitacion constante.
1.4 Preparar una solucion de 50 gr de NaCl en 150 ml de agua en un vaso de
precipitado de 400 ml. Si es necesario, calentar el vaso para favorecer la
disolucion de la sal, pero antes de continuar es conveniente enfriar la
solucion.
1.5 Agregar rapidamente la grasa saponificada sobre la solucion fria de NaCl.
1.6 Agitar vigorosamente durante unos minutos y enfriar hasta temperatura
ambiente en un bao de hielo.
1.7 Recoger el precipitado formado por filtracion al vacio con un embudo
Buchner y lavarlo dos veces con agua helada.
1.8 Dejar pasar aire a travs del precipitado hasta que quede medianamente
seco.
1.9 Secar el producto en una estufa, pesarlo y calcular el rendimiento.
2 ENSAYOS CON JABON
2.1 Colocar 0.15 gr del jabon obtenido y 10 ml de agua destilada en un matraz
Erlenmeyer de 125 ml.
2.2 Disolver el jabon, cerrar el matraz con un tspon de neopreno y agitar con
fuerza durante 15 segundos.
2.3 Dejarlo reposar durante 30 segundos y observar el nivel de la espuma.
2.4 Agregar 4 gotas de solucion de CaCl2 al 4%
2.5 Agitar vigorosamente la mezcla 15 segundos y dejar reposar 30 segundos.
Observar el efecto del CaCl2 sobre la formacion de espuma.
2.6 Aadir 1 gr de fosfato de sodio y agitar de nuevo 15 segundos, dejar en
reposo 30 segundos y observar.
CUESTIONARIO
1. Por qu Ias sales de potasio de los acidos grasos resultan ser jabones mas
blandos?
2. Por qu el jabon que se obtiene del aceite de coco es tan soluble?
3. Por que al agregar la solucion de NaCl precipita el jabon?
4. Por qu se utiliza para la saponificacion una mezcla de etanol-agua en
lugar de agua sola?
5. Por qu limpia un jabon?
6. Qu ingredientes se le pueden aadir a un jabon? Con que fines?
PRACTICA No. 17
MITOSIS EN APICE RADICAL DE HABA (Vicia faba)
INTRODUCCION
En la dcada de 1860, F. Miescher aislo de los nucleos celulares una sustancia
acida a la que dio el nombre de nucleina y mas tarde, acido nucleico. La
funcion biologica de este material no se descubrio sino casi un siglo despus,
cuando (en la dcada de 1940) Avery, MacLeod y McCarty establecieron que
ese material nucleico acido y especialmente el DNA- contenia la informacion
hereditaria. Cuando Watson y Crick informaron en 1953 que habian resuelto la
astructura molecular del DNA, dio comienzo una nueva era en la bioquimica y
la biologia.
REACTIVOS
Lmpara de alcohol
Soln. Aceto-orceina
Vidrio de relej
Soln. Farmer
Estuche de diseccion
Papel secante
HCI 1 N
Porta y cubreobjetos
5 Semillas de haba .
3 PROCESO CITOLOGICO
3.1 Colocar una porcion de 1 a 2 cm del apice radical en un vidrio de reloj que
contenga una mezcla de 10 ml de aceto-orceina y 1 ml de HCI 1 N.
3.2 Calentar el vidrio de reloj sobre una lmpara de alcohol de 3 a 4 veces en
un lapso de 10 minutos. Evitar que llegue a ebullicion.
3.3 Transferir aproximadamente 1 mm del apice a un portaobjetos y se agrega
una gota de colorante diluido (acetato-orceina/ac.actico al 45% 1:1 v/v),
tratando de desmenuzar el tejido con una aguja.
3.4 Calentar nuevamente, pasando el portaobjetos sobre la lampara de alcohol
y evitando que la preparacin llegue a ebullicion.
3.5 Utilizando papel, se sbsorbe la mayor cantidad posible de la solucion y se
agrega nuevameme una gota de colorante diluido.
3.6 Repetir las exp. 3.4 y 3.5 de dos a tres veces.
3.7 Una vez que se absorbe la solucion (del ultimo calentamiento), se agrega
una gota de aceto-orceina sobre el tejido y se coloca el cubreobjetos.
Calentar nuevamente sin llegar a ebullicion.
3.8 Cubrir la preparacin con papel secante y presionar ligeramente con Ia
yema del pulgar.
3.9 Observar la preparacion al microscopio con el objetivo 10X y si es
necesario se presiona por segunda vez con mas fuerza.
3.10 Sino es suficiente con la presion aplicada, se agrega una gota de ac.
actico al 45% y se calienta sin llegar a ebullicion. Posteriormente se
presiona como se indico en Ia exp. 3.8
3.11 Utilizando el objetivo de 10X es mas facil encontrar las fases de la
mitosis, si se localizan las clulas adecuadas, se cambia al objetivo de 40X
para observarlas con mayor detalle.
3.12 Esquematizar cada una de las fases de la divisin celular observadas en
el microscopio.
CUESTIONARIO
1. Qu ventajas representa la utilizacion de apices radicales en estudios
citogenticos?
2. En qu consiste cada una de las fases mitoticas?
3. Qu es la cariocinesis?
4. Qu es la citocinesis?
5. Qu es la eucromatina?
6. Qu es la heterocromatina?
7. Esquemas de la experiencia 3.12
PRACTICA No. 18
TERPENOS
INTRODUCCION
Sometiendo a destilacion suave las partes mas fragantes de una planta se
puede aislar una mezcla de las sustancias volatiles responsables de su olor o
aroma caracteristico. A esteconcentrado" de la planta se le suele dar el
nombre de aceite esencial. En la actualidad los mtodos mas usuales para
obtener dichas esencias vegetales son destilacin por arrastre de vapor y la
extraccion con solventes organicos.
Las primeras investigaciones sobre la composicion quimica de los aceites
esenciales, demostraron que, entre los constuyentes fundamentales habia
hidrocarburos de formula C10H16; a estos hidrocarburos de 10 carbonos se les
llamo terpenos. La palabra terpeno se refiere a una estructura de hidrocarburo
derivada de la union de dos o mas unidades de isopreno [CH 2=C(CH3)CH=CH2]. Luego se descubri que algunos constituyentes de los aceites
esenciales, que tambin contenian 10 atomos de carbono (monoterpenos),
poseian funciones oxigenadas (alcoholes, cetonas y aldehidos, principalmente).
Por utro lado, de las plantas tambin pueden aislarse a menudo otros
componentes menos volatiles, que tienen 15 C (sesquiterpenos), 20 C
(diterpenos), 30 C (triterpenos) o 40 C (tetraterpenos).
El Iicopeno es un pigmento rojo del jitomate, un carotenoide de 40 C
(tetraterpeno) formado por 8 unidades de isopreno. El -caroteno, pigmento
amarillo de la zanahoria, es un isomero del licopeno, en el cual los dobles
enlaces en C1 C2 y C1 - C2 se han sustituido por enlaces entre C 1 - C6 y C1 C6' para formar anillos. El croroformo en cada caso es un sistema de 11 dobles
enlaces cunjugados en posicion trans; al cerrarse los dos anillos dan caroteno, que es menos coloreado que el licopeno.
La presencia de dobles enlaces permite la bromacion de estos tetraterpenos y
su distinto color su cromatogzfia.
OBJETIVO
Obtencion de un aceite esencial por arrastre de vapor, caracterizacion de
grupos funcionales de dicho aceite, bromacion y cromatografa de
carotenoides.
MATERIAL
MATERIAL
REACTIVOS
Balanza
Agua destilada
Acetona
Probeta
Cloroformo
2 Tapones bihoradados
Agitador
Na 2SO4 anhidri
2 Tapones monohoradados
Etanol
2 M. Erlenmeyer de 125 ml
Pipeta Pasteur
Tapon ranurado
Reactivo de Schiff
2 Anillos
Reactivo de Tollens
Nuez
Embudo de separacin
2 Rejillas de asbesto
Arena
2 Soportes universales
Canela molida
Papel aluminio
Jugo de tomate
Hojas verdes
METODOLOGIA
1 EXTRACCION DEL ACEITE ESENCIAL DE CANELA
El aceite esencial de canola (Cinnamonum zeylanicum), tiene 85% de
cinamaldehido (trans-3-fenilpropenaI).
1.1 Montar un aparato como el que se muestra en la figura.
Amarillo-naranja
Lutena
Amarillo
Violaxanthina
Amarillo
Clorofila a
Verde
Clorofila b +
Neoxantina
Amarillo - verde
CUESTIONARIO
1. Cules son las caracteristicas organolpticas del aceite esencial de canela?
2. Cul fue el rendimiento del aceite esencial obtenido?
3. Qu resultados se obtuvieron en las exp. 2.1, 2.2 y 2.3?
4. Qu es desterpenar un aceite esencial?
5. Como se desterpena un aceite esencial?
6. Respuesta a la pregunta de la exp. 3.6
7. Observaciones y resultados pedidos en la exp. 4.5
8. A qu pigmentos corresponden cada una de las manchas obtenidas en el
cromatograma?
PRACTICA No. 19
EXTRACCION DE COLESTEROL
INTRODUCCION
Los esteroides forman un grupo importante de productos naturales, cuya
caracteristica
esencial
es
la
estructura
tetraciclica
de
ciclopentanoperhidrofenantreno. Los podemos encontrar tanto en animales
como en plantas, aunque los mas importantes se hallan en los primeros en
donde cumplen varias funciones esenciales. Las hormonas masculinas y
femeninas de los mamiferos son esteroides, como tambin lo son los acidos
biliares y las hormonas de la corteza adrenal.
El esteroide mas abundante es el colesterol. Se encuentra en todos los tejidos
de los mamiferos, siendo particularmente abundante en la espina dorsal, en el
cerebro y en los calculos biliares. En un hombre de 75 Kg de peso hay unos
250 gr. de colesterol en promedio. Gracias a su amplia distribucion fue el primer
esteroide que se aislo. Sin embargo, debido a su complicada estructura,
REACTIVOS
Dioxano
Embudo de pliegues
Metanol
Placa calefactora
Carbon activado
Agua destilada
Embudo Buchner
Br 2+CH3COONa/ac. actico
Balanza
Hielo
Gotero
Agitador
Zn en polvo
Embudo de separacion
NaOH al 10%
2 Tubos de ensaye
Microscopio
Papel filtro
Na 2SO4 anhidro
Bomba de vacio
Cloroformo
Anhidrido actico
H 2SO4 conc.
Calculos biliares
METODOLOGIA
1 AISLAMIENTO
1.1 Pesar 2 gr de calculos biliares triturados, en un matraz Erlenmeyer de 125
ml.
1.2 Aadir 10 ml de dioxano, calentar Ia mezcla agitando suavemente para que
se disgregue el solido y se disuelva mejor el colesterol (calentar sobre placa
calefactora).
1.3 Filtrar en caliente en un filtro de pliegues; para ello es aconsejable calentar
el embudo previamente (el residuo pardo que quedara en el filtro es la
bilirrubina).
1.4 Diluir el filtrado con 10 ml de metanol.
1.5 Agregar un poco de carbon activado para decolorar la solucion resultante y
calentarla en un bao de vapor.
1.6 Filtrar en caliente rapidamente a travs de un filtro de pliegues.
1.7 Calentar de nuevo Ia disolucion verdosa y aadir agua gota a gota hasta
que se enturbie (de este modo se consigue mantener saturada la solucion
en caliente).
1.8 Dejar enfriar la solucion para que cristalice el colesterol.
1.9 Separar los cristales por filtracion al vacio en un embudo Buchner. Lavarlos
con metanol frio y dejarlos en el embudo hasta que se sequen. Pesar el
producto.
2 BROMACION
2.1 En un matraz Erlenmeyer de 175 ml, disolver 1 gr del colesterol obtenido en
10 ml de ter etilico anhidro es posible que sea necesario calentar
suavemente en un bao de vapor (cuidado! es muy inflamable).
2.2 Con Ia ayuda de un gotero aadir lentamente 5 ml de una solucion de
bromo y acetato de sodio en aicido actico (precaucion! esta soln. produce
quemaduras si entra en contacto con la piel), hasta obtener un color
amarillento persistente.
2.3 El dibromocolesterol empezara a cristalizar al cabo de 1 minuto ms o
menos. Enfriar con hielo y agitar para obtener una cristalizacion completa.
2.4 Separar los cristales por filtracion al vacio y lavarlos con una solucion fria
de 3 ml de ter en 7 ml de ac. actico glacial.
2.5 Volver a lavar con metanol frio y mantener el paso de aire a travs del
embudo hasta que los cristales estn secos.
3 DESBROMACION
3.1 Pasar los cristales de dibromuro a un matraz Erlenmeyer de 125 ml, aadir
20 ml de ter. 5 ml de ac. Actico glacial y 0.2 gr de Zn en polvo.
3.2 Si la reaccion es lenta agregar algo mas de zinc y calentar suavemente. El
dibromuro se disolvera y precipitara acetato de zinc a los 5-10 minutos.
3.3 Agitar durante otros 10 minutos y aadir agua gota a gota hasta que se
redisuelva.
3.4 EI sobrenadante se pasa a un embudo de separacin, y se extrae la
solucion etrea con agua (dos veces) para eliminar el acetato y el
dibromuro de zinc.
3.5 Lavar la parte etrea con NaOH al 10% que arrastrara el acido actico.
3.6 Repetir el paso anterior hasta que una gota de disolucion etrea no vire a
rojo el papel azul de ternasol.
3.7 Agitar, por ultimo, con una solucion saturada de NaCl para reducir el
contenido de agua.
3.8 Separar la fraccion eterea y filtrarla a travs de una capa de Na 2SO4
anhidro, para completar el secado.
4 RECRISTALIZACION
4.1 Colocar 10 ml de metanol a la disolucion etrea y evaporar los disolvente
sobre un bao de vapor, hasta que se haya eliminado la mayor parte del
ter y el colesterol empiece a cristalizar.
4.2 Dejar reposar la solucion a temperatura ambiente durante unos minutos y
enfriarla luego en un bao de hielo para favorecer la cristalizacion.
4.3 Separar los cristales por friltracion al vacio, lavarlos con algo de metanol frio
y dejarlos secar.
4.4 Una vez seco el producto, observar los crisiales al microscopio y hacer un
esquema de lo observado.
5 IDENTIFICACION
Reaccin de Liebermann-Burchard
5.1 Poner en un tubo de ensaye seco, una pequea cantidad de colesterol, 2
ml de cloroformo, 10 gotas de anhidrido actico y 2 gotas de H 2SO4
concentrado.
5.2 Agitar el lubo y observar la aparicion y cambio de colores, ya que, la
solucion se pondra de color azul, que pasa a verde en caso de ser positiva
la prueba.
Reaccion de Salkowski
5.3 Colocar en un tubo de ensaye seco, una pequea cantidad de colesterol y
3 ml de cloroformo.
5.4 Teniendo el tubo de ensaye inclinado, viertase lentamente por la pared del
tubo 2 ml de H2SO4 concentrado, de manera que formen dos capas
superpuestas.
5.5 Agitar cuidadosamente el tubo para que haya una ligera mezcla de las dos
capas. Observar los colores en ambas capas. Una coloracion amarilla en la
capa acida (superior) y roja en la capa cloroformica (inferior), indica que la
prueba es positiva.
CUESTIONARIO
1. Esquematizar el mtodo seguido en la extraccion del colesterol de los
calculos biliares.
2. Qu cantidad de colesterol impuro se obtuvo en Ia exp. 1.9? Qu
caracteristicas presentaba?
3. El bromo se adiciona en trans al doble enlace del colesterol. Dibujar un
modelo tridimensional del mecanismo de este proceso, representando los dos
anillos que intervieron en l, en su conformacion de silla o semisilla.
PRACTICA No. 20
IDENTIFICACION DE SAPONINAS
INTRODUCCION
Las saponinas son glicosidos triterpenoides o esteroidales. Muchas saponinas
se encuentran en plantas y en algunos organismos marinos tales como el
pepino marino y la estrella de mar. Son producidas por los organismos marinos
para defenderse de sus predadores. Se ha demostrado que las saponinas de
plantas poseen actividades biolgicas muy interesantes, tales coma actividad
espermicida y muluscocida. Las saponinas de pepinos marinos han mostrado
una gran actividad en contra de hongos patgenos, tales como Trichophyton
mentagrophytes, Microsporum gypseum, Candida albicans y Candida utilis.
Las interesantes propiedades farmacologicas asociadas con la droga China
ginseng, la cual es considerada una panacea y una droga para la longevidad,
son atribuidas a las varias saponinas presentes en el ginseng, Saponinas de
plantas tales como la dioscina son comercialmente importantes ya que se
utilizan como material de inicio para la sintesis de hormonas esteroidales. Las
saponinas, son pues, un grupo quimica y farmacologicamente interesante de
productos naturales.
Las saponinas, cuando se agitan en agua, reducen la tension superficial del
agua y producen espuma. Las saponinas se comportan como jabones, razon
por la cual su nombre derive de la palabra Latina para jabon. Todas las
REACTIVOS
Balanza granataria
Metanol al 75%
Base de Agar-sangre
Cajas Petri
Agua deslilada
Olla de presin
Plantas medicinales
Organismos marinos
Varilla de vidrio
Sangre desfibrinada
Pipetas Pasteur
Ginseng
Centrifuga clinica
NaCl al 0.85%
PRACTICA No. 21
PIGMENTOS VEGETALES
INTRODUCCION
El color es una propiedad de la materia directamente relacionada con el
espectro de la luz y que por lo tanto se puede medir fisicamente en terminos de
su energia radiante o intensidad, y por su longitud de onda. El color es muy
importante, ya que es el primer contacto que se tiene con los productos
naturales.
Normalmente, cuando se habla de color de los vegetales nos referimos a
frutas, flores, hojas, tallos y raices, ya que son los que contienen la mayor
concentracion de pigmentos. En general, los pigmentos vegetales se clasifican
en seis grupos:
a) Carotenoides
b) Clorofilas
c) Antocianinas
d) Flavonoides
e) Taninos
f) Betalainas
MATERIAL
REACTIVOS
REACTIVOS
Mortero y pistilo
Agua destilada
H 2SO4 conc.
5 Tubos de ensaye
HCI al 5%
Solvente C
Embudo
CH3COOH al 2%
Solvente D
Embudo de separacin
CH3COOH
Benceno
NaHCO3
KOH al 5%
Papel filtro
NaOH al 10%
NH4OH
Betabel y ptalos
Flor de jamaica
Mg
Alas de mariposa
HCI conc.
METODOLOGIA
1 ANTOCIANINAS
Se analizara el efecto en el pigmento por variacion del pH de la solucion.
1.1 Desmenuzar alrededor de 25 gr de una hortaliza roja.
PIGMENTO
COLOR
Flavonas y flavonoles
Amarillo
Flavonas e isoflavonas
Tonos de rojo
Chalconas
Purpura
Flavonoles
Caf-naranja
Antocianinas
Azul
2.3 Obtener 5 ml de un extracto alcoholico (incoloro o ligeramente amarillo) de
tres distintos vegetales, agregarles un trocito de Mg y unas gotas de HCl
concentrado (prueba de Shinoda).
PIGMENTO
COLOR
Flavona
Naranja
Flavononas
Rosa
Flavonoles
Rojo-azuloso
Flavononoles
Violeta
COLOR
Flavonas y flavonoles
Amarillo
Flavanonas
Naranja o guinda
Chalconas y auronas
COLOR
5-hidroxiflavonas
Naranja o rojo
COLOR
5-hidroxiflavonas
3 QUINONAS
3.1 Obtener el extracto de tres distintos vegetales, utilizando benceno. Una vez
extraidos se les adiciona NaOH al 10% hasta que viren de color.
PIGMENTO
1,4-naftaquinonas
Amarillo
Rojo
1,2-naftaquinonas
Rojo
Azul violaceo
ACETO-ORCEINA (solucin)
ALBUMINA (solucin)
ALMIDON AL 1% (solucin)
B (solvente)
BARFOED (reactivo)
BENEDICT (reactivo)
BIAL (reactivo)
BOUCHARDAT (reactivo)
C (solvente)
CROMATOGRAFICO (solvente)
D (solvente)
DICLOROFENOLINDOFENOL
(DPIP) (solucin)
Se prepara en agua al 2 o 3%
DRAGENDORFF (reactivo)
FARMER (solucin)
LUCAS (reactivo)
LUGOL (solucin)
1 gr de I2 y 2 gr de KI se disuelven en
25 ml de agua y despus se agregan
75 ml de agua para un total de 100
ml.
MAYER (reactivo)
MOLISH (reactivo)
NINHIDRINA (solucin)
PASTEUR (solucin)
SCHIFF (reactivo)
SELIWANOFF (reactivo)
TOLLENS (reactivo)
Disolver 3 gr de AgNO3 en 30 ml de
agua, se aaden 1.5 gr de NaOH
disueltos en 30 ml de agua, en
seguida se agrega, gota o gota,
NH4OH diluido (1:1) hasta que se
disuelva el precipitado formado. Se
prepara al momento del uso, despus
de 10 horas de preparado forma
compuestos explosivos.
WIJS (solucin)
REFERENCIAS
1) UNAM, Manual de prcticas de laboratorio de Bioquimica y Biologia
Molecular (1993), facultad de Medicina.
2) Bohinski C. Robert , Bioquimlca (1991), ed. Addison-Wesley lberoarnericana
en
Quimica
Organica
(1975),