Anda di halaman 1dari 7

B.

Metode Isolasi Dan Identifikasi Bakteri


1. Pengertian Isolasi
Isolasi merupakan cara untuk mengambil mikroorganisme yang terdapat di alam
dan menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari campuran
bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media
padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya (Sutedjo,
1996).
Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:
a. Isolasi pada agar cawan
Prinsip

pada

metode

isolasi

pada

agar

cawan

adalah

mengencerkan

mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari


organisme lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan yang telah
inkubasi berasal dari satu sel tunggal.
Terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode
gores kuadrat dan metode agar cawan tuang.

Metode gores kuadrat bila dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi

mikroorganisme dimana setiap koloni barasal dari satu sel.


Metode agar tuang berbeda dengan metode gores kuadrat, cawan tuang
menggunakan medium agar yang dicairkan dan didinginkan 50C, yang kemudian
dicawankan. Pengenceran tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir
mengandung koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan atau didalam cawan.

b. Isolasi pada medium cair


Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat
tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial pengenceran.
Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu sel semakin besar.
c. Isolasi sel tunggal
Metode isolasi sel tunggal dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme
berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair.
Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100x. Kemudian sel
tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun
micromanipulator, yang dilakukan secara aseptis (Admin, 2008).
Adapun prinsip dari metode cawan ini adalah sel jasad renik yang masih hidup
ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa
menggunakan alat bantu seperti mikroskop dan sebagainya. Metode hitung cawan ini
merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah jasad renik karena
beberapa hal yaitu:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik kerena koloni
yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai
penampakan yang spesifik (Muslim, 2011).

Berikut ini beberapa sifat-sifat koloni pada agar lempeng mengenai bentuk,
permukaan dan tepi yaitu:

Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, berbenang, tak teratur serupa akar dan

serupa kumparan.
Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul

mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah.


Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang berigi,
ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting (Dwidjoseputro, 2005).

Sedangkan menurut Nuniek isolasi mikroba dapat dilakukan dengan dua cara yaitu:
a. Isolasi mikroba dengan cara penggoresan
Tujuan utama dari penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni
bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih
menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan ketrampilan
yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni
yang terpisah. Ada beberapa teknik goresan, antara lain :
- Goresan T
- Goresan kuadran
- Goresan radian
- Goresan sinambung (Nuniek, 2001).
b. Isolasi mikroba dengan cara penaburan
Cara penaburan (pour plate) merupakan cara yang kedua di samping penggoresan
untuk memperoleh biakan murni dari biakan campuran mikroba. Cara ini berbeda dari
cara penggoresan dimana media agar diinokulasi dalam keadaan tetap cair yaitu pada suhu
45C, dan demikian pula koloni-koloni akan berkembang di seluruh media, tidak hanya

pada permukaan. Untuk beberapa tujuan hal ini menguntungkan, contohnya dalam
mempelajari pertumbuhan koloni streptococcal pada sel-sel darah merah. Supaya koloni
yang tumbuh dalam cawan tidak terlalu banyak ataupun sedikit maka contoh diencerkan
hingga beberapa kali pengenceran dan ditaburkan pada beberapa cawan (Nuniek, 2001).
2. Identifikasi Bakteri
Identifikasi bakteri meliputi pemeriksaan morfologi, pewarnaan gram, dan uji
biokimia antara lain: uji oksidase, uji katalase, uji motilitas, produksi indol, uji TSIA, dan
uji gula-gula. Identifikasi bakteri dilakukan dalam beberapa uji antara lain pengamatan
morfologi koloni bakteri yang dilakukan setelah mendapatkan biakan murni. Pengamatan
ini meliputi warna, bentuk, tepian koloni, ketinggian atau permukaan koloni dan struktur
dalam koloni (Jimmo, 2008).
a. Pewarnaan gram bertujuan untuk menentukan apakah bakteri tersebut
termasuk di dalam kelompok bakteri gram positif atau kelompok bakteri gram
negatif. Cara kerja dari pewarnaan gram yaitu suspensikan bakteri dengan ose,
kemudian letakkan pada objek glass dan difiksasi, tetesi dengan larutan gram
A yang mengandung kristal violet, kemudian tetesi dengan larutan gram B
yang mengandung lugol, tetesi dengan larutan gram C yang mengandung
alkohol, dan yang terakhir tetesi dengan larutan gram D yang mengandung
safranin.
b. Uji katalase bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri dalam menghasilkan
enzim katalase. Cara kerja dari uji katalase yaitu dengan menggunakan jarum
ose, koloni bakteri secara aseptik diambil dan diletakan pada gelas objek yang
bersih. Kemudian diteteskan hydrogen peroksida (H 2O2) 3% pada koloni
bakteri tersebut. Adanya gelembung-gelembung udara menunjukan tes
tersebut positif.

c. Uji oksidase bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya enzim oksidase pada
bakteri dengan menggunakan paper oksidase yang dapat dilihat perubahan
warna yang terjadi pada paper oksidase.
d. Uji motilitas dan uji indol bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri tersebut
motil atau tidak dan untuk mengetahui produksi indol dari Tryptophane. Uji
ini menggunakan media MIO (Motility Indole Ornitin).
e. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) bertujuan untuk membedakan jenis bakteri
berdasarkan kemampuan memecahkan dextrose, laktosa, sukrosa dan
pembebasan sulfida, selain itu uji TSIA berfungsi untuk mengetahui apakah
bakteri tersebut menghasilkan gas, H2S atau tidak. Media yang digunakan
mempunyai dua bagian, yaitu slant (miring) dan butt (tusuk).
f. Uji gula bertujuan untuk membandingkan kemampuan bakteri dalam
mendegradasi gula dan menghasilkan asam organik yang berasal dari tiap-tiap
jenis gula, yaitu glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, manitol dan inositol
(Waluyo, 2010).
1.

Identifikasi Pemeriksaan Pseudomonas aeruginosa


Untuk identifikasi bakteri Pseudomonas aeruginosa menggunakan media plate

MC (mac conkey), media agar ini termasuk kedalam media selektif dan diferensial bagi
mikroorganisme. Jenis mikroba tertentu akan membentuk koloni dengan ciri tertentu yang
khas apabila ditumbuhkan pada media ini (Melnick, 2012).
Bakteri gram negatif yang tumbuh dapat dibedakan dalam kemampuannya
memfermentasi laktosa. Koloni bakteri yang memfermentasi laktosa berwarna merah bata
dan dapat dikelilingi oleh endapan garam empedu. Bakteri yang tidak memfermentasikan
laktosa biasanya bersifat patogen (Jawetz, 2001).

Pada media MC (mac conkey) koloni Pseudomonas aeruginosa berbentuk sedang,


jernih/keruh, smooth, kadang-kadang sedikit kehijauan, keping, tepinya tidak rata, dan tidak
menguraikan laktosa.

Gambar 2.5 Bakteri Pseudomonas aeruginosa pada media MC


(Bacteriainphotos, 2012)
Uji biokimia Pseudomonas aeruginosa pada media TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
dilakukan secara aseptis diinokulasi biakan kuman dari media MC ke media TSIA, diambil 1
ose ditanam pada media TSIA dengan cara digoreskan pada lereng media dan ditusuk pada
dasar media. Lalu di inkubasi selama 24 jam pada suhu 37C. Pada uji fermentasi gula-gula
semua hasilnya negatif (Melnick, 2012).
1. Identifikasi Acinotobacter baumanni
Untuk identifikasi bakteri Acinotobacter baumanni menggunakan media selektif MC
(mac conkey). Pada media MC (mac conkey) koloni Acinotobacter baumanni berbentuk
kecil, tidak berwarna atau rose, smooth, keruh, dan bulat. Pada saat uji katalase hasilnya
positif, tetapi pada uji indol dan mortility (pergerakan) hasilnya negatif (Melnick, 2012).

Gambar 2.8 Bakteri Acinotobacter baumanni pada media MC


(Bacteriainphotos, 2012)
1. Identifikasi Klebsiella pneumonia

Klebsiella dapat tumbuh dengan baik pada media pembenihan seperti pada media
MC (mac conkey) pada suhu 37C. Ciri-ciri pertumbuhan bakteri pada media MC yaitu
memiliki koloni yang besar-besar, smooth, cembung, berwarna merah muda sampai merah
bata, dan bersifat mukoid yakni pada saat koloni diambil dengan ose akan kelihatan molor
seperti tali atau benang (Jawetz, 2001).
Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia,
yang biasa dilakukan diantaranya:
a. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat
kemapuan meragi glukosa, sukrosa atau laktosa.
b. Gula-gula atau karbohidrat
Dilakukan untuk menetukan kemampuan bakteri untuk memfermentasikan
beberapa jenis gula-gula seperti glukosa, laktosa, maltose, manitol dan sukrosa.
c. SIM (sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakan bakteri, produksi indol dan pembentukkan
gas H2S.

Gambar 2.10 Bakteri Klebsiella pneumonia pada media MC


(Bacteriainphotos, 2012)