Breve resea histrica

Los orgenes del microscopio son inciertos; probablemente en Holanda, en la ciudad

de Middelburg entre 1590 y 1610, algunas personas relacionadas con el mundo del
espectculo inventaron tanto el microscopio compuesto como el telescopio.
Hans Janssen y su hijo Zacharias, fabricantes
de anteojos, se mencionan como posibles
inventores.

Galileo Galilei su invencin en la primera mitad del siglo XVII, gracias a

que l difundi el microscopio y su uso. El microscopio compuesto
original consista en dos o ms lentes colocadas en un tubo rgido.
Los primeros usuarios bien conocidos fueron M. Malpighi, de Italia,
Van Leeuwenhoek, de Holanda;
Hooke y N. Grew, de Inglaterra.
Leeuwenhoek fabric un microscopio simple y Hooke utiliz un
microscopio compuesto. Los instrumentos empleados por
Leeuwenhoek eran superiores a aquellos utilizados por Hooke,
en parte debido a que se desconoca el efecto de las
aberraciones de las lentes y como corregirlas.
El microscopio compuesto de Hooke sumaba los defectos de los
dos juegos de lentes (objetivo y ocular), dificultando la observacin, de manera que
en la historia de la microscopa fue Leeuwenhoek quien realiz la mayor cantidad de
descubrimientos con su microscopio simple.
Sin embargo, el microscopio compuesto sera el instrumento con ms futuro. El
instrumento de Hooke del ao 1665 tena las partes bsicas, dos lentes (una que
aumentaba la imagen de la otra), una estructura mecnica, mecanismos de enfoque y
un frasco esfrico para concentrar la luz Mejoras considerables se han realizado
desde entonces.
El verdadero microscopio til apareci con la invencin de las lentes acromticas,
desarrolladas en Inglaterra por Chester Moore Hall en 1729.
El desarrollo de los instrumentos de ptica es inseparable del de la industria del vidrio
y la fabricacin de las lentes Sin embargo, an era difcil fabricar lentes acromticas

poderosas y a finales del siglo XVIII Jan y Harmanus van Deyl lo lograron e iniciaron
la comercializacin de objetivos acromticos.
Las lentes con mayores aperturas numricas fueron realizadas alrededor de 1890.
Un fabricante famoso de microscopios de calidad superior era la firma de Powell y de
Lealand, quienes elaboraron objetivos de alto poder, apocromticos y de inmersin
con una apertura numrica de 1,50.
Otros creadores fueron Ross y Smith. Karl Zeiss Jena realiz objetivos de inmersin
diseados por Ernst Abbe quien fue el fundador de la teora ptica de las lentes del
microscopio y desarroll el diseo de las mismas basado en un procedimiento
matemtico riguroso
A finales del siglo XIX los microscopios de campo claro fueron modificados para
obtener campo oscuro y polarizacin, detalles que permitieron incrementar el
contraste.
A principios del siglo XX la fabricacin de microscopios se concentr en Alemania y
en los aos sucesivos se desarroll la fluorescencia, contraste de fase, interferencia,
holografa, luz ultravioleta, rayos X, mtodos con electrones y protones, microscopios
computarizados para la observacin, cuantificacin y anlisis tridimensional. Estos
instrumentos abrieron muchas posibilidades en el campo de la microscopa.
Los fabricantes (Leitz, Zeiss, Olympus, y otros) respondieron a muchas necesidades,
haciendo microscopios ms efectivos, de uso universal, capaces de utilizar el tipo de
radiacin (luz visible o no) que revele de la mejor manera posible la naturaleza del
espcimen y convierta detalles invisibles de la imagen en un patrn visible que pueda
ser analizado.

Partes del microscopio compuesto moderno

El microscopio compuesto de uso comn tambin se conoce con el nombre
microscopio ptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes
pticas.
Est
constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados de tal manera
que garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico:
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y dems
elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver, tubo).
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y
resolucin (objetivos y ocular)
Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o no)
y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos que van
a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo, condensador y
diafragma).
Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del instrumento
(cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, entre otros).

Sistema mecnico del microscopio

La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es de forma y
dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante.
De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeos o
porttiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un
trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar los
trabajos ms variados y su costo es el ms elevado. Los modelos medianos no
convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos puesto que su precio
es menor gracias a su construccin ms simple. Los microscopios porttiles
responden a necesidades ms restringidas y producen aumentos menores,
conviniendo para observaciones someras.
Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos:
pie
o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revlver y el tubo del ocular.
- Pie o base
Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser rectangular, con un
peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la
fuente de iluminacin y puede contener un mecanismo para regular la intensidad
luminosa.
Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato. La
columna puede ser inclinada; en su parte ms inferior se dispone el condensador y la
parte superior posee una cremallera que permite desplazar en sentido vertical el
condensador, la platina o el revlver y el tubo. Las ventajas que procura el
microscopio inclinado son mltiples y la posicin es ms confortable para el
observador (actividad que es muy incmoda cuando el tubo del microscopio es
vertical).
Mecanismo de enfoque
Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el
espcimen o ya sea el revlver donde estn colocados los objetivos, de modo que se
pueda centrar el punto focal del objetivo que se est utilizando es ese momento.
Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rpido del tornillo macromtrico y
segundo, otro lento del tornillo micromtrico.
La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico posee
dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque
aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para subirlos
rpidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado histolgico.

El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que cada divisin de
la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm.
Esta disposicin permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos,
considerando el nmero de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte ms
superficial y luego la ms profunda.
El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm
aproximadamente y est limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los
objetivos de mayor aumento.
La platina
Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas. Presenta en
el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la fuente
luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de forma cuadrada y
posee un sistema de fijacin e inmovilizacin de la lmina porta-objeto compuesto por
pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro. Este dispositivo
permite el examen metdico y completo de la preparacin al proporcionar un
desplazamiento hacia adelante o hacia atrs y de derecha a izquierda y viceversa.
Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor en 1631),
tambin llamado nonius, consiste en dos pequeas reglas graduadas en milmetros
cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de referencia
para localizar una estructura determinada en la preparacin. En la prctica, el uso del
vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y ms difcil
an colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestin. Adems, estas cifras
solo son vlidas para el microscopio en el cual se obtuvieron. Hay otros
procedimientos ms simples para tal fin.

-El revlver
Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que
permite el intercambio rpido de objetivos mediante un movimiento de rotacin. El
revlver est constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los
cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que est
colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual
manera, alojar un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms).
-El tubo
Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud variable,
cuyo interior est pintado de negro mate y posee un diafragma para impedir la
formacin de reflejos y facilitar la observacin. El tubo puede ser doble y alojar dos
lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de microscopios grandes
destinados a la microfotografa, hay un tercer tubo accesorio, generalmente ms largo
y vertical que sirve para conectar una cmara fotogrfica sin necesidad de lente
ocular.

Sistema ptico del microscopio

Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes
aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los componentes
pticos estn colocados en una base estable que permite un intercambio rpido y un
alineamiento preciso.
El sistema ptico est constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.
# Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal
funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una imagen
ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben
estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir exactamente para
formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales
(espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su
precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las
aberraciones.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras de
objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los objetivos
apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos, los objetivos
secos y los objetivos de inmersin.
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja.
Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz de
color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. Se asume que un
objetivo es acromtico cuando no posee ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen
para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de esfericidad es
para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y estn
mejor diseados para la microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y
por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores (azul
oscuro, azul, rojo y verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores. Son los
mejores objetivos para microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de

correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los acromticos
y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo de observacin
se presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta
como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan planacromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubreobjeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos secos el
medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del
ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos
denominados de inmersin el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del
objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este
lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee un
ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de
la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia la
luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en los objetivos secos, est
disminuida.
El empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor
resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados
y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento. 100 x.
ptica finita y ptica infinita:
La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus
sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver por un
extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y
los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud (longitud
finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En
muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilneo y los rayos de luz
transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas,
especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear objetivos
diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no
corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por
una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y
prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos los
fabricantes estn elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseados
para realizar una correccin infinita.
Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que
se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los
objetivos con esta correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa.

Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparicin de

imgenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no
obstante estos nuevos modelos son de mayor tama.o.

Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al infinito.

Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center
(66).

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento antireflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas. En la parte externa
posee grabadas las especificaciones y caractersticas

.-Tipos de objetivos.
(a) Objetivo acromtico que contiene una lente frontal y dos pares internos,
(b) objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro pares de lentes y
(c) objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente
esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
Nomenclatura de los objetivos:
La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a
la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las especificaciones
necesarias para su uso apropiado. La minuciosa informacin, generalmente en el
idioma ingls, puede contener.
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semiapocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo); ICS
(infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view
plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras especificaciones
cuya nomenclatura depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en
milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con correccin infinita.

 Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay

diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un collar
de correccin en las lentes internas para realizar la correccin y se denominan CR,
Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo,
expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones
tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo a la
Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se designan
con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones.
El dimetro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca ms
amplia y slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32
mm respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y
para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI
(homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores
para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en este

objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial (DIC
differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en

microscopios con platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M,

Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Cdigo de color
de inmersin

Medio de inmersin

Negro

Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o multiuso

Cdigo de color
de aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos. Modificado de Davison M,

Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).
El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son
separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va
introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real
e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:
Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la
imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente el ojo
endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.
La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la
imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina colectora y es la que
aplana y aclara el campo

Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados por
dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el objetivo y el
diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado ocular negativo porque la
imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn en modelos de microscopios
antiguos
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes
unidas entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente corrigen
aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos al infinito
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento
para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en los
objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen
en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para
exhibicin.
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente
plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del
campo ptico.
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con
objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero
con una doble lente ocular.

Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de
Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre las dos lentes
(colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las
lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan que contiene

siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas, la curvatura de campo y su
empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran poder de aumento.

.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular negativo.Modificado de

M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).
Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (mono-oculares),
sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms modernos son
trinoculares, especiales para la microfotografa. Los binoculares tienen los objetivos
dispuestos con una inclinacin de 45 para realizar la observacin cmodamente.
Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el ocular.
Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible observado a travs de
las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el
campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma del
campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de
forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy til al
realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere reconstruir la
totalidad del campo de observacin de la preparacin, lo cual se dificulta con un
campo circular clsico al quedar zonas superpuestas.

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El

valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es de

10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo que consiste en el
dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar desde
18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus
caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin
microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de
estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el
nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular
de vidrio con una escala o gradilla, la cual aparece enfocada y superpuesta a la
imagen del espcimen al encontrarse en el plano de formacin de la misma. Los
oculares para la medicin poseen un mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se
debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada objetivo que se use.En la
actualidad se puede emplear algn software de computacin para realizar mediciones
sobre las imgenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el mtodo
ms econmico y de uso ms generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa
(alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de indicar de
manera especfica alguna estructura en particular en el campo de observacin. El
sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del borde del campo hacia el
centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una
parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra, impedir la
formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos microscopios
binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta las dioptras en
caso que el observador posea una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se
realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual
manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y
75 mm).

Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa un campo

rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son en el orden
de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el nmero de
divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado,
dando como resultado un valor que corresponde al tamao de la misma. Si la clula
mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se
divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy
from the very begining. 2 ed. (13).

Sistema de iluminacin
El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio que
producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la
observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a considerar en la
microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espcimen. Si
la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se
obtiene se ver afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema ptico.
La iluminacin ptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe
dispersarse de manera uniforme en el campo de observacin.
Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine
fotnico. En sus inicios, la microscopa se practicaba con iluminacin por reflexin; se
utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto, luz
artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lmparas de aceite o petrleo) y la
desviaba hacia la preparacin. Este mtodo se mantuvo durante mucho tiempo, en
parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que
consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vaco y dentro del cual va
colocado un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno, entre otros) que al paso de una
corriente elctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50).
Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios pueden
utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de microscopios
actuales, desde los ms sencillos y econmicos hasta los ms sofisticados, an
poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la bombilla, en el caso
que sta no se encuentre alineada con la platina.
El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el condensador y un
diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminacin est colocado debajo
de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la mayora de
los casos el estudio de las preparaciones histolgicas se hace por transiluminacin.
En otros casos muy especficos se emplea el mtodo de luz reflejada, en el cual se
ilumina la superficie del espcimen mediante epi-iluminacin La fuente de luz emite
una radiacin que es recogida por un dispositivo denominado condensador, que a su
vez forma un cono luminoso necesario para la visualizacin con objetivos de mayor
aumento.
-Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen
numerosas fuentes de iluminacin artificial, tanto para la observacin rutinaria como
para la microfotografa. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales como la
constancia, la uniformidad y la intensidad; adems es muy favorable para los
mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:
Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz estn
dotados de lmparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se emplean
como fuentes principales o accesorias. Estas lmparas son radiadores trmicos que

emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300 1200 nm. Estn
constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un filamento de
tungsteno que es activado por una corriente elctrica produciendo una importante
cantidad de luz y calor. Varan mucho en tamao, diseo y forma. Producen una luz
blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La luz puede ser muy brillante
para la observacin y se reduce con filtros que disminuyen la intensidad,
denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la intensidad sin alterar los
colores. Tambin se emplean filtros de colores que compensen el color rojo, de
manera que se pueda observar la imagen del espcimen sobre un fondo iluminado
neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el tinte amarillo que tiene la luz
incandescente y se obtiene una luz suave y agradable que aumenta la definicin.
Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases (vapor de
mercurio, xenn o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromtica
con filtros apropiados, ideal para microfotografa en blanco y negro o a colores.
Tambin se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia).
Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation, Amplificacin de Luz por Emisin Estimulada de
Radiacin) , que consiste en un dispositivo que genera un haz de luz con
caractersticas de tamao, coherencia, forma y pureza controladas. El lser de argn
es uno de los ms utilizados, cuya emisin est en el orden de 488-514 nm. Su costo
es muy elevado y se emplea principalmente en microscopa confocal.
LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un
dispositivo emisor de luz con caractersticas muy prximas a la luz monocromtica
(espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente elctrica pasa a travs
del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que estn hechos . Se
utilizan en una amplia gama de artefactos y lmparas. En comparacin con las
bombillas incandescentes, son ms interesantes porque permiten ahorro de energa
con un mayor rendimiento lumnico. Para microscopa se emplean LED de larga
duracin que proveen una luz muy brillante y fra; esto ltimo es una gran ventaja,
puesto que no genera calor y la observacin es ms cmoda para el usuario. En la
actualidad se producen combinaciones de diodos que emiten una luz blanca.
-Condensador
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con
aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El
trmino condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una
condensacin de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la
seccin del cono luminoso que a su vez forma una imagen ms clara.
El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de la platina
del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espcimen. El primer
condensador que se fabric en 1838 (por Dujardin) posea tres lentes acromticas. Al
igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento y
tambin producen aberraciones, sin embargo, stas tambin pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones pticas.

 Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el ms

econmico. Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una apertura
numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observacin de rutina y
con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin. Una de las ventajas es
el amplio cono de iluminacin que puede producir.
Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.
Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes
corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es til para observaciones de
rutina con objetivos secos y para microfotografa (blanco y negro o color).
Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el
condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca. Puede contener
ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y objetivos de mayor aumento.
El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada para
optimizar la intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez que se cambia un objetivo
se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la apertura
numrica del nuevo objetivo. A menudo no es prctico utilizar el mismo condensador
para un amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos de bajo poder de
aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una lente frontal adicional
que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante un mecanismo
activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercndolo o no a la platina donde
est colocado el espcimen.
Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro,
existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan en
diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del contraste entre
los detalles de la estructura del espcimen. Se han desarrollado condensadores
especiales para microscopa de campo oscuro, contraste de fase, luz polarizada,
contraste de interferencia diferencial.

.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un condensador con dos

lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio fotnico. El medio de inmersin,
en este caso aceite, se puede colocar tanto entre la lente frontal del condensador y el
preparado histolgico como entre el preparado y la lente frontal del
objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus
Microscopy Resource Center (15).
-Diafragma o iris
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe permitir
cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es la de obtener
conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. Los
primeros diafragmas consistan en un disco de metal con agujeros de diferente
dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad. Estos discos fueron substituidos por
el iris, otro dispositivo ms elaborado y con un diseo que le permite cambiar de
dimetro. La apertura del diafragma se regula en relacin con el tipo de objetivo que
se est utilizando. El diafragma o iris est pintado de negro con la finalidad de
eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la iluminacin del objeto.

Iris con mecanismo para variar la apertura. Tomado de Cross M, Cole M. Modern
Microscope (70).
Iluminacin Khler
La iluminacin es una variable crtica que hay que considerar al poner en
funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminacin,
an en equipos sofisticados, conduce a la obtencin de imgenes defectuosas. El
espcimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede
producir artificios en la imagen que se observa.
En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin para
optimizar la observacin microscpica y la microfotografa, que permite aprovechar al
mximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio
con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al del rea de captura del
objetivo. Los microscopios modernos estn diseados para aplicar la iluminacin
Khler y los requerimientos son
Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
Bombilla con lente colectora.
Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y un
diafragma de apertura, colocado debajo del condensador.

Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el esquema. La lmpara

posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada por la lente colectora L1 y
regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S del filamento de la lmpara es
proyectada al plano del segundo diafragma D2. Este primer paso se realiza con D1
completamente abierto. La altura del condensador L2 se regula de manera que su
punto focal est en el plano D2. La imagen del diafragma de campo D1 es proyectada
en el plano de la preparacin por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas
de campo y apertura. Microscopio (72).
El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida del
diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cundo el condensador se
encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de campo regula el dimetro
de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los contrastes. Una vez
ajustada la iluminacin Khler no se debe regular la intensidad de la luz o el brillo
bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se
regula la intensidad de la lmpara mediante un ajuste de voltaje.

.-Trayectoria de la luz en la iluminacin Khler. Modificado de Davison M, Abramowitz

M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Formacin de la imagen en el microscopio compuesto

. El ojo humano est constituido de tal manera que slo puede tener una visin clara
cuando los rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente divergentes,
debido a que la retina requiere la participacin del cristalino para enfocar los rayos en
su superficie.
El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede observar
claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6 y
10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor
considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente de un objeto depende del
ngulo formado por dos lneas proyectadas desde el centro del ojo a las
extremidades de dicho objeto.

. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ngulo, el cual es dos veces
ms grande que el ngulo de las lneas O-W. De igual manera, la distancia del ojo a
la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La flecha en AR
aparece dos veces ms grande que la flecha en OW. Las proporciones se mantienen
al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History,
Construction and Applications (73).

Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual (73). La
utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste en
la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de
manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si
emanaran de un objeto situado ms all del lmite de visin cercana y en
consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 4-15).

Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una flecha pequea
(objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de los rayos de luz
divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del objeto muy
cercano, al incidir en la pupila, son an tan divergentes que no permiten formar una
imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la lente son desviados para
formar lneas casi paralelas que si pueden ser captadas por el ojo si ste est a su
vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History,
Construction and Applications (73).

Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son
recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto)
ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin cercana del observador
(aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao entre la flecha real y la flecha
imaginaria estar determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen
formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una placa
fotogrfica; es una imagen mental. Por esta razn la imagen se denomina virtual y la
distancia desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia focal virtual
Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ngulo de
visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande.

Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo formado por las lneas
punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos bf y cg emanados de las
extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el ojo en direccin f y g,
los cuales crean un ngulo visual mayor que hace que la fecha se vea ms grande (de). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications
(73).
Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender el
principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la lupa
(microscopio simple) en base a que est conformado por dos sistemas de lentes, los
cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje ptico. El primer sistema,
cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia focal muy
corta y es posible colocar el objeto un poco ms all de su punto focal para obtener
una imagen real, invertida y aumentada.
El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se denomina ocular y
funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La
distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen
real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal. El aumento del
microscopio depender en principio de la longitud focal del objetivo. Mientras ms
pequea sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, ms grande ser la
imagen real. El aumento tambin depende de la distancia focal del ocular y mientras
ms corta sea esta, mayor ser el aumento.

Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos emanados del
espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes objetivo y ocular para la
formacin de las imgenes. La flecha ab corresponde al espcimen, que est
colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una imagen real,
aumentada e invertida en ab. Esta imagen se forma por dentro del foco (f ) de la
lente ocular. El ojo del observador percibir a travs del ocular la imagen virtual,
aumentada y derecha ab de la imagen real ab. Modificado de Langueron M. Prcis
de Microscopie (11).

Accesorios del microscopio

Medir y cuantificar: Consiste en la micrometra (morfometra) aproximada de los
especmenes observados al microscopio. Para cuantificar longitudes, cantidades
(conteo de clulas, ncleos, partculas), ngulos. Se emplean oculares de medicin
con retculos o gradillas en combinacin con micrmetros especializados, lminas
calibradas, cmaras de conteo y el vernier. En la actualidad se han desarrollado
instrumentos para morfometra que emplean tecnologa digital y los datos obtenidos
pueden ser transmitidos a un computador, permitiendo as la automatizacin, el
almacenamiento de los datos y la obtencin de variables estadsticas a partir de ellos.
Dibujar: Dibujar las preparaciones microscpicas es una actividad de las ms
completas y precisas que permite obtener una representacin fiel del espcimen en
estudio tal y como el observador la percibe y representa la suma de detalles que se
observan al cambiar el plano de enfoque, obtenindose la sensacin de relieve y
profundidad. Se emplean las cmaras claras y otros dispositivos para dibujar que
estn concebidos con una serie de espejos y prismas que hacen coincidir en la retina
o en una pantalla tanto el campo observado como el plano en el cual se debe dibujar.
Se sigue sobre una hoja de papel el contorno de la imagen observada al mismo
tiempo que se dibuja con un lpiz.
Fotografiar: Una manera de preservar lo observado al microscopio es mediante la
microfotografa. Las imgenes obtenidas se archivan y se emplean en publicaciones
cientficas y presentaciones con fines docentes y banco de datos. Se necesitan
adaptadores para conectar la cmara a un tubo semejante al tubo del ocular en
microscopios trinoculares. Se emplean desde las cmaras fotogrficas clsicas hasta
las cmaras digitales especializadas para acoplar al microscopio y las cmaras
fotogrficas digitales de uso comn. Actualmente la fotografa clsica resulta
complicada, costosa, de resultados menos atractivos y ha sido desplazada por la
fotografa digital que es de ms fcil y prctica ejecucin. Con las cmaras digitales
de alta resolucin se obtienen resultados muy satisfactorios e inmediatos que pueden
ser archivados en el computador para su posterior anlisis y procesamiento.
Filmar: La captura de imgenes en movimiento se realiza mediante cmaras de
video (digitales o no) que registran la actividad de especmenes vivos, clulas en
cultivo, cmaras de perfusin, dispositivos con motor y automatizados, entre otros,
para la demostracin y anlisis de procesos fisiolgicos en videomicroscopa.
Incrementar el contraste: Para facilitar la observacin de especmenes con una
estructura particular y clulas vivas se emplean filtros, condensadores y otros
dispositivos que transforman al microscopio de campo claro en un instrumento para
tal fin, logrndose la microscopia fotnica especial (campo oscuro, contraste de fases,
polarizacin, entre otras).

 Procesamiento de imgenes: Con el empleo del computador y de software

especializados para captura, administracin y procesamiento de las microfotografas,
en la actualidad se ha llegado a nuevos niveles en facilidad de uso y sofisticacin que
simplifican la investigacin cientfica

Tipos de microscopios
Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la naturaleza de los
sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imgenes.
El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para
microfotografa). En los microscopios binoculares la observacin se hace con los dos
ojos y esto permite una observacin ms cmoda y se percibe una mayor nitidez de
los detalles en la imagen. Se fabrican en diferentes tamaos incluyendo microscopios
pequeos porttiles o de viaje. Dentro de los tipos de microscopios se describen:
Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a partir de los
modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la
platina. Es el microscopio de uso ms comn.
Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en comparacin
al microscopio convencional. La fuente de luz est ubicada por encima de la platina y
el principio de funcionamiento y formacin de la imagen es el mismo que el del
microscopio tradicional. Utilizado principalmente para cultivos celulares (clulas vivas)
sin una preparacin previa y para monitorear actividades (crecimiento,
comportamiento)

Microscopio invertido con el revlver y objetivos por

debajo de la platina. La fuente de luz se ubica en la
parte superior. Tomado de Instrumental Pasteur.
Microscopio Olympus. (78).

 Microscopio estereoscpico: Este tipo de microscopio proporciona una imagen

estereoscpica, en tres dimensiones (3D) del espcimen. Se fundamenta en la visin
binocular convencional, en la que los dos ojos observan el espcimen con ngulos
levemente distintos. El microscopio estereoscpico debe ser binocular. Se utiliza para
observar especmenes de gran tamao, sin corte o preparacin previa puesto que
emplea luz incidente y no funciona por trans-iluminacin. Es ideal para realizar
microdiseccion

.-Microscopio estereoscpico. Tomado de Kosmos Scientific de Mxico (79).

 Microscopio quirrgico: Es un microscopio que se emplea en microciruga.

Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras
anatmicas, facilitndole al cirujano una mayor visibilidad de los tejidos sanos y
patolgicos que sern manipulados ms cuidadosamente y con menores
posibilidades de lesin. Algunos modelos ms sofisticados tienen piezas
automatizadas robticas. Se utiliza principalmente en intervenciones quirrgicas en
las que se amerite una minuciosa diseccin, como por ejemplo del crneo y cerebro o
del globo ocular.

Cirujano empleando microscopio quirrgico. Tomado de Cerrn, V (80).

Microscopios fotnicos especiales: Ciertos especmenes, principalmente las
clulas vivas o muestras no coloreadas, al ser observados en el microscopio comn
de campo claro, muestran un muy pobre contraste de sus estructuras y no aportan
datos relevantes, a pesar del poder de resolucin de los objetivos empleados. Para
ello se han creado microscopios con ciertas particularidades que permiten la
observacin de ese tipo de especmenes con un incremento muy satisfactorio del
contraste. Entre ellos se citan:
Microscopio de campo oscuro.
Microscopio de luz ultravioleta.
Microscopio de fluorescencia.
Microscopio de polarizacin.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopios interferenciales.

EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.
Las clulas estn constituidas a partir de sustancias qumicas orgnicas e inorgnicas
las cuales se organizan en diversos niveles para formar la estructura de los
organoides celulares (membranas, mitocondrias, ncleo, citoesqueleto, entre otros) y
permitir las funciones celulares. El poder de resolucin del microscopio ptico o
fotnico es de 0,2m, y este hecho limita la observacin y el estudio de la
organizacin de los compuestos qumicos celulares y los organoides. La microscopa
electrnica es el nico mtodo que hace posible la toma de imgenes directas de
esas estructuras a niveles supramoleculares; detalles que tambin son denominados
con el trmino de ultraestructura celular. El lmite o poder de resolucin terico del
microscopio electrnico es de 0,2nm y esto es en parte posible gracias a un
tratamiento especial al que se somete el tejido que va a ser examinado.
Desde el ao 1878 se conoca que el poder de resolucin del microscopio fotnico
estaba limitado en parte por la longitud de onda de la luz utilizada, pudiendo ser
mejorado mediante objetivos de inmersin o el empleo de luz ultravioleta.
La posibilidad de lograr un mayor poder de resolucin no se vislumbr hasta
que se realizaron dos descubrimientos cientficos que fueron decisivos :
1. El descubrimiento de las propiedades de los electrones libres, en 1924.
2. El hallazgo de la analoga entre el efecto de una resistencia magntica sobre
un haz de electrones libres y el efecto de las lentes convergentes sobre un rayo
de luz, en 1926.
A partir del hecho que la longitud de onda de los electrones en movimiento es menor
que la longitud de onda de la luz visible, se concibi la idea que las partculas ms
pequeas (como la ultraestructura celular) podran ser observadas con un haz de
electrones enfocado con lentes electromagnticas.
El primer microscopio electrnico fue construido y mostrado pblicamente en el ao
1931 por Max Knoll y Ernst Ruska (estudiante de tesis doctoral), quienes trabajaban
en el High Tension Laboratory of the Technical University (Technische Hochschule),
Berln, Alemania. Ellos presentaron dos publicaciones referentes al instrumento, a la
ptica de los electrones y otros conceptos.
En el ao 1933 presentaron otro modelo de microscopio electrnico ms
perfeccionado. Sin embargo, a pesar de los hechos, algunos atribuyen a Reinhold
Rdenberg la invencin del microscopio electrnico debido a que fue la primera
persona que registr la patente de invencin, pero curiosamente l no aport nada al
desarrollo del instrumento. Cuando Rdenberg introdujo la primera patente ya Knoll y
Ruska haban construido el primer microscopio electrnico.

El venezolano Humberto Fernndez-Morn (nacido en Maracaibo (Edo. Zulia) el

18.2.1924 y fallecido en Estocolmo, Suecia, el 17.3.1999) contribuy al desarrollo de

la tcnica de la microscopa electrnica y sus aplicaciones en biologa, medicina y

ciencia de los materiales. Fue quien por primera vez utiliza el concepto de
crioultramicrotoma, invent el crio-microscopio electrnico y la cuchilla de diamante
para el corte ultrafino de materiales biolgicos y metales; as como tambin tcnicas
para microscopa electrnica (lentes superconductoras a temperatura de helio lquido
en microscopios electrnicos, filamentos de punta, porta-especmenes para nitrgeno
y helio lquidos). Fernndez-Morn mostr las primeras micrografas electrnicas que
revelaban la complejidad de la estructura de las membranas mitocondriales, defini la
partcula submitocondrial en la superficie de las membranas de las crestas
mitocondriales (denominadas partculas elementales o partculas de FernndezMorn, actualmente conocidas como ATPasa)
El electrn libre: Haz de electrones.
En el ao 1897, J. J. Thompson detect al electrn y lo defini como la primera
partcula elemental, lo que quiere decir que no puede ser dividida en constituyentes
ms pequeos.
El tomo est compuesto por tres tipos de partculas, los protones, neutrones y
electrones. Los protones y neutrones conforman el ncleo del tomo y los electrones
giran en una nube alrededor del ncleo.
Los electrones se representan con la letra e-; poseen una masa en reposo de 9,1
10-31 kg y tienen una carga elctrica negativa (-1,6 10-19 coulomb).
Son determinantes en las uniones de los tomos entre s y su movimiento produce
una corriente elctrica. En condiciones especiales pueden ser separados de los
tomos de ciertos metales. La energa cintica y el movimiento de los electrones se
incrementan con la temperatura a causa del aumento en la vibracin de los iones, los
cuales chocan con los electrones y los aceleran. Si la temperatura aumenta, algunos
electrones pueden adquirir suficiente velocidad y en consecuencia se despegan,
abandonando la superficie del metal. La pieza de metal (que debe ser como un
alambre fino) se puede calentar haciendo pasar una corriente elctrica.
En una cmara al vacio, el filamento se carga con un potencial negativo (ctodo) y se
aplica un fuerte campo electrosttico entre el alambre y otra superficie adyacente
positiva (nodo). Al aplicar electricidad, los electrones acelerados se desprenden del
ctodo hacia el nodo. La velocidad a la cual los electrones viajan depender de la
fuerza del campo magntico entre el ctodo y el nodo. El nmero de electrones que
se desprendern depender de la temperatura a la cual es calentado el alambre, la
cual a su vez depende de la cantidad de corriente que pasa por el mismo. De esta
manera se forma un haz de electrones libres colimados (paralelos entre s) que viajan
a gran velocidad en un alto vaco.

Si hay molculas de aire presentes entre el ctodo y el nodo, los electrones libres
chocarn con las molculas de gas del aire y sern detenidos o dispersados por esas
colisiones. En el vacio los electrones viajan en lnea recta y si no son afectados por
campos electrostticos o magnticos, la velocidad ser constante. El dimetro del haz
puede variar dependiendo de varios factores (83):
El haz tiene tendencia a ensancharse, debido a que los electrones se repelen por su
carga elctrica. Cuanto ms elevada sea la intensidad del haz (y por lo tanto el
nmero de electrones), mayor ser la seccin transversal del mismo (y su dimetro).
Para obtener un haz muy fino hay que corregir la divergencia caracterstica del haz.
La lente electromagntica permite la concentracin del haz al crear un campo
magntico (cuando pasa una corriente elctrica por una bobina formada por un hilo
de material conductor). Este campo concentra y aproxima los electrones y se reduce
el dimetro del haz.
Debido a que se estudian elementos de dimensiones atmicas, es necesario, como
en la descripcin de la luz visible, emplear la definicin cuntica de la naturaleza de
los electrones. Hay que considerar al electrn como onda en ciertas condiciones y
como partcula en otras. La colisin de dos electrones se comprende mejor al
imaginar a cada electrn como una partcula; sin embargo, al estudiar fenmenos
tales como la difraccin, los electrones deben ser considerados como ondas.

Tcnicas de microscopa electrnica

El principio de la microscopa electrnica es muy similar al de la microscopia de luz y
se han desarrollado dos principales tcnicas:
1. Microscopa electrnica de transmisin: Se observa a travs del espcimen
(trans- iluminacin). El espcimen se corta en lminas ultrafinas (en el orden de
nanmetros) que se colocan en una rejilla de cobre, la cual es bombardeada con un
haz de electrones enfocado. Una silueta del espcimen se proyecta en una pantalla
fluorescente o placa fotogrfica situada por debajo del mismo. La resolucin puede
ser de 0,2nm.
2. Microscopa electrnica de barrido: Se observa la superficie de un espcimen
slido (epi-iluminacin). Se puede lograr una resolucin de 10nm y un aumento hasta
de 20.000x. Se producen imgenes muy interesantes en 3D (tridimensionales)
gracias a una mayor profundidad de campo. Se escanea la superficie del espcimen
con un haz de electrones (primarios) y los electrones que rebotan (secundarios) son
recogidos por un detector. La seal se observa en un monitor de televisin. Los
tomos del espcimen producen rayos X que tambin son detectados.
.-Diseo del microscopio electrnico de transmisin
A partir del modelo construido por Knoll y Ruska en 1931 varias casas comerciales
(RCA, Siemens, GE, entre otras) han producido diversos modelos de microscopios
electrnicos modernos, pero todos ellos basados en el modelo original.
Conformacin del microscopio electrnico de transmisin:
Una cmara al vaco, el cual es generado por una bomba.
Una columna donde se genera y viaja el haz de electrones.
Un sistema ptico que forma una imagen en una pantalla fluorescente o en una
placa fotogrfica.
Circuito electrnico estabilizador de voltaje.
Como se vio anteriormente, el haz de electrones se obtiene calentando el filamento
del ctodo; los electrones se aceleran aplicando un voltaje entre el ctodo y el nodo.
El ctodo posee un potencial altamente negativo.
El sistema ptico consiste en un condensador que concentra y dirige el haz de
electrones hacia el espcimen; una lente objetivo y otra lente proyectora, las cuales
en conjunto producen una imagen aumentada que se proyecta en una pantalla
fluorescente o en una foto El espcimen se coloca en un dispositivo que permite
moverlo en dos direcciones, en un plano perpendicular al plano del eje del

microscopio. La columna posee un sistema de vaciado conectado a bombas de

difusin o bombas mecnicas que crean el vacio.
El alto voltaje negativo aplicado al ctodo es producido por un circuito elctrico de alto
voltaje y las corrientes aplicadas a las lentes son producidas por circuitos de bajo
voltaje. Las bombas de difusin e incluso las lentes (en ciertos modelos de
microscopios) son enfriadas mediante un mecanismo de circulacin de agua

.-El primer microscopio electrnico desarrollado por Knoll y Ruska (1931). (1) Tubo de
descarga, (2) ctodo, (3) vlvula, (4) espacio para lente electrosttica (opcional), (5)
lente magntica objetivo, (6) lente de proyeccin, (7) columna de alto vaco, (8) salida
a la bomba de vaco, (9) caja de Faraday para medir la corriente del haz de
electrones, (10) pantalla fluorescente o placa fotogrfica, (11) vlvula para medir el
vaco, (12) apertura del nodo, (13) aperturas o diafragmas, (14) vlvula de vaco,
(15) ventana de observacin, (16) pantalla fluorescente removible para observacin,
(17) cmara. Ntese que este primer modelo carece de condensador. Modificado de
Freundlich M. (1963) (20).

Elementos que conforman el microscopio electrnico de transmisin:

Emisor de electrones:
Al igual que en el microscopio fotnico, la fuente de irradiacin es pequea, a partir
de la cual se genera un estrecho haz de electrones. El haz de electrones de alta
energa puede obtenerse de varias maneras
- Por emisin termoinica: Es la forma ms comn y se realiza a partir de un delgado
filamento de tungsteno dispuesto en forma de V. El metal debe calentarse a una muy
alta temperatura mediante una corriente elctrica (muy alto voltaje) para acelerar a un
nmero importante de electrones que se desprendern de la punta de la V. Los
electrones que se liberan tienden a formar una nube prxima a la superficie del metal
y con la aplicacin de un campo elctrico entre el filamento (ctodo) y una porcin de
la columna (nodo) los electrones son acelerados. Otros materiales pueden ser
empleados en la confeccin del ctodo, tales como oxido de bario, platino, lantano,
entre otros.
-Por emisin de campo: Se aplica un fuerte campo elctrico (109 Vm) para extraer los
electrones del filamento de metal (tungsteno). La temperatura es mucho menor que
en la emisin termoinica. Se obtiene un haz de electrones de mayor intensidad y se
requiere de un vaco absoluto.
Condensador:
Con la introduccin del condensador, conformado por una lente electromagntica, el
haz de electrones puede ser enfocado de manera ms precisa en el espcimen. La
lente est colocada aproximadamente a media distancia entre el ctodo y el plano del
objeto (equivalente a la platina en el microscopio fotnico). En algunos microscopios
se coloca un doble condensador con la finalidad de lograr mayor resolucin y
aumento; de esta manera se reduce el riesgo de dao trmico y contaminacin del
espcimen. En la bsqueda de un mayor aumento, es necesario emplear un haz de
electrones ms potente e intenso, lo cual literalmente quema el espcimen, de all
que la observacin deba hacerse rpidamente para que el tiempo de exposicin a los
electrones sea corto.
Sistema ptico:
Un microscopio electrnico de transmisin funciona de manera anloga al
microscopio de luz. En lugar de un haz de fotones, se emplea un haz de electrones
aumentado y enfocado ya sea por lentes elctricas (electrostticas) o magnticas
(electromagnticas). Un electrn al moverse por un campo magntico cambia su
direccin y se desplaza en ngulo recto con respecto a la direccin del campo
magntico. El grado de desviacin es inversamente proporcional a la fuerza del
campo y a la carga del electrn. De igual manera, un electrn que se mueve en un
campo elctrico tambin cambia su direccin. Como resultado de la atraccin entre
una placa de carga positiva y la carga negativa del electrn, ste ltimo es desviado
hacia la placa. En consecuencia, hay dos vas para desviar los electrones con la
finalidad de utilizarlos de manera anloga a un rayo de luz y producir una imagen
aumentada de un objeto. Esto se logra mediante un campo elctrico o mediante un
campo electromagntico. Ambos tipos de campos seran empleados como lentes.

Los tipos de lentes empleadas en el microscopio electrnico obedecen entonces a

dos modelos, las lentes electrostticas y las lentes electromagnticas. Durante aos
los fabricantes se han debatido entre ambos tipos de lentes, con la finalidad de
demostrar cual lente era la ms eficiente y daba mejores resultados. Los modelos
electromagnticos demostraron ser superiores (86).
Lentes electromagnticas y aberraciones:
De manera simplificada se puede decir que las lentes electromagnticas son
electroimanes que estn formados por un solenoide o bobina muy bien comprimida,
constituida por un material conductor filamentoso, por el cual pasa una corriente
elctrica constante. El solenoide est alojado dentro de un contenedor de metal en
forma de anillo, el cual posee una hendidura o ranura en su cara interna El flujo
magntico y las lneas de fuerza se concentran en la ranura y en el centro del anillo.
Propiedades de las lentes electromagnticas: Las propiedades de las lentes son:
Cada campo magntico posee una simetra axial y acta como una lente para los
electrones.
Todas las lentes electromagnticas son positivas.
La velocidad de los electrones no se ve afectada.
La imagen formada est rotada e invertida en relacin al objeto.
Aberraciones: Las mismas aberraciones que afectan las lentes pticas de cristal
afectan la formacin de las imgenes en las lentes electromagnticas:
Aberracin de esfericidad: Es la ms importante en la microscopa electrnica y es
el factor que ms limita el poder de resolucin.
Distorsin: Cambios en la imagen de la forma de los objetos (en barril, en
almohadilla y distorsin espiral).
Curvatura de campo.
Astigmatismo.
Aberraciones cromticas: Originadas por variaciones en la velocidad de los
electrones, los cuales pueden abandonar el ctodo emisor a diferentes velocidades,
las cuales pueden ser modificadas al ser sometidos a la aceleracin por la diferencia
de voltaje.
Otras: producidas por la rotacin de los electrones al pasar por el campo magntico.

.-Comparacin entre una lente electromagntica y una lente de cristal. En la primera

(izquierda) en corte longitudinal, una bobina de cobre (material conductor) est
aislada en una cubierta de metal que posee una ranura en la cara interna (N-S). En la
parte superior, la lnea azul representa el objeto y en la parte inferior, la imagen del
mismo obtenida por la lente. En amarillo se muestra el trayecto de electrones y
fotones, dependiendo del tipo de lente. Modificado de Matter. Electromagnetic
Lenses.
La mayora de microscopios electrnicos emplean lentes electromagnticas. Una
razn de peso es que las lentes electrostticas, en comparacin a las magnticas,
son ms sensibles a la calidad del vaco y limpieza de los componentes; de igual
manera, en las primeras, algunas aberraciones son ms severas y requieren de
campos electrostticos muy poderosos los cuales pueden ocasionar alteraciones
elctricas dentro de la columna del microscopio, afectando el haz de electrones.
El sistema ptico se emplea para producir una imagen del espcimen. Generalmente
se colocan tres lentes (fig. 5-4):
- Lente objetivo: Es la ms importante, pues determina el poder resolutivo del
microscopio.
- Lente intermedia.
- Lente de proyeccin: En algunos casos es doble. La funcin de esta lente es la de
producir el aumento final.

 Platina:
Cumple una funcin similar a la platina en el microscopio fotnico garantizando el
intercambio de especmenes y el movimiento preciso del mismo durante la
observacin. En el microscopio electrnico de transmisin la platina es un dispositivo
extrable en el cual se coloca la rejilla de cobre sobre la cual se ha depositado el corte
ultrafino del tejido. La platina debe conservarse muy limpia, de lo contrario se ver
afectado el movimiento de la muestra, entorpeciendo la observacin.
Pantalla o visor y la cmara fotogrfica:
La imagen se proyecta en una pantalla fluorescente en la cual la energa cintica de
los electrones se transforma en luz gracias a la fluorescencia. La pantalla consiste en
una superficie revestida de una capa de cristales de sulfato de zinc. Cada cristal es
una unidad que emana luz cuando sobre ella inciden electrones y en consecuencia la
resolucin de la pantalla depender de la talla de los cristales.
Las imgenes pueden grabarse en una pelcula fotogrfica. Al igual que los fotones,
los electrones al incidir sobre la emulsin fotogrfica producen cambios en los
cristales de bromuro de plata, obtenindose un negativo en blanco y negro, que una
vez revelado por mtodos clsicos fotogrficos puede ser copiado en papel. De esta
manera se obtiene la microfotografa (micrografa) electrnica.
Sistema de vaco:
Los electrones al chocar con las molculas de aire se dispersan y luego de repetidas
colisiones son detenidos. Esta dispersin puede arruinar las posibilidades de obtener
imgenes bien definidas. Es por ello que el haz de electrones empleado en la
microscopia electrnica debe viajar en un espacio al vaco, es decir, bien evacuado y
sin molculas de aire. La diferencia de alto voltaje entre el ctodo y el nodo podra
ocasionar descargas si existiera un nmero suficiente de molculas de gas que
facilitaran la ionizacin en este espacio. De all que es necesario mantener una baja
presin de gas en la cmara donde se encuentra el filamento emisor de electrones, lo
cual a su vez alarga el tiempo de vida til del mismo al prevenir la oxidacin del
filamento de tungsteno. Un vaco deficiente se identifica gracias a las descargas
producidas.
La presin del aire en la columna del microscopio debe estar entre 10-4 a 10-5 mm
Hg. Esto es considerado como alto vaco y se produce mediante el uso de bombas
mecnicas que extraen el aire del interior de la columna del microscopio. Las bombas
pueden ser de difusin en las cuales las molculas de aire difunden en vapor de
aceite y de mercurio.

Izquierda: Modelo Philips moderno acoplado a una computadora. Derecha: Primer

microscopio Electrnico de Transmisin del occidente del pas, utilizado por el Dr.
Julio M. Sosa en la Universidad de Los Andes. Tomado de The Electron Gun. Electron
Microscopy. y Oficina de Prensa Universidad de Los Andes. Centro Latinoamericano
y del Caribe para la Investigacin sobre la Enseanza de la Ciencia (Celciec) y
respectivamente.
-Diseo del microscopio electrnico de barrido
Los cortes finos de tejido no muestran el arreglo tridimensional de los constituyentes
celulares y aunque la tercera dimensin puede ser reconstruida a partir de cortes
seriados, es un mtodo largo y pesado. El microscopio electrnico de barrido permite
la visualizacin de las muestras en 3D y el haz de electrones no atraviesa la muestra,
por el contrario, incide sobre la superficie de la misma y los electrones secundarios
son captados por un detector y la seal es enviada a una pantalla de televisin. La
profundidad de campo obtenida por este microscopio es considerable; la imagen es
constituida de zonas brillantes y zonas oscuras que dan un aspecto tridimensional.
Sin embargo, solamente la superficie puede ser observada. La tcnica se emplea
para estudiar clulas intactas y tejidos.

Componentes bsicos del microscopio electrnico de barrido:}

Sistema de alto vaco.
El filamento emisor de electrones (ctodo).
Lentes (electromagnticas, electrostticas o superconductoras).
Generador del escaneo: El haz de electrones es desplazado por la superficie del
espcimen de una manera predeterminada.
Detector de electrones secundarios.
Pantalla de televisin.

Diagrama esquemtico que muestra los componentes fundamentales del microscopio

electrnico de barrido. Modificado de Nixon W. The General Principles of Scanning
Electron Microscopy (89).

El haz de electrones o electrones primarios, al incidir en la superficie de la muestra

genera electrones secundarios, los cuales se originan del espcimen y son
colectados por un detector de electrones. Adems de electrones secundarios,
tambin se producen rayos X, infra-rojos, y ultravioleta.
El espcimen es colocado en una platina portaobjeto y puede ser desplazado o
rotado en varias direcciones, permitiendo un amplio rango de posibilidades de
observacin.
Otros accesorios pueden aadirse al microscopio, tales como computadoras para
anlisis directo, impresoras, videocmaras, circuito cerrado de televisin, entre otros.

.-Microscopio electrnico de barrido. A la izquierda se aprecia el microscopio

propiamente dicho, notablemente la columna y la cmara en la cual se coloca el
espcimen. A la derecha los monitores acoplados para la observacin de las
imgenes en 3D. Tomado de The Science and Education Resource Center ,
Charleton College.

Formacin de la imagen en los microscopios electrnicos

Los pasos bsicos de la formacin de la imagen en el microscopio electrnico, tanto
de transmisin como de barrido son :
1. Un haz de electrones se forma en el ctodo y es acelerado hacia el espcimen
gracias a un potencial elctrico positivo.
2. El haz de electrones es enfocado mediante el empleo de lentes electromagnticas.
3. En la muestra irradiada ocurren interacciones las cuales afectan el haz de
electrones.
4. Las interacciones y efectos son detectadas y transformadas en una imagen.
5. La imagen es formada en un dispositivo (pantalla fluorescente, monitor de
televisin, placa fotogrfica).

.-Representacin esquemtica del sistema

ptico del microscopio electrnico de
transmisin, en el cual se aprecia un
proceso de aumento en tres etapas y
la formacin de la imagen.

Formacin de imagen en microscopio de transmisin y de barrido

Poder de resolucin: Aumentos El poder de resolucin est determinado en parte
por la longitud de onda de la radiacin empleada para iluminar el espcimen y es
inversamente proporcional a la misma, es decir, a menor longitud de onda, mayor
poder de resolucin. El haz de electrones puede tener longitudes de onda variables,
las cuales influyen en el lmite de resolucin que a su vez depender del voltaje
empleado para acelerar los electrones
Voltaje de
Longitud de onda ()
Aceleracin (kV)

Limite de resolucin
terico ()

10

0.122 (0.122nm)

3.7 (0.37nm)

20

0.086 (0.0086nm)

2.9 (0.29nm)

50

0.054 (0.0054nm)

2.1 (0.21nm)

100

0.037 (0.0037nm)

1.7 (0.17nm)

200

0.025 (0.0025nm)

1.3 (0.13nm)

500

0.014 (0.0014nm)

0.9 (0.9nm)

1000

0.009 (0.0009nm)

0.7 (0.07nm)

Relacin de voltaje de aceleracin, la longitud de onda del haz de electrones y

el poder de resolucin en el microscopio electrnico de transmisin expresadas
en kilovoltios(kV), angstroms() y nanmetros (nm).

Con el microscopio electrnico se puede alcanzar una resolucin de

aproximadamente 40.000 veces ms que el poder de resolucin del microscopio
de luz y 2 x 106 veces el poder de resolucin del ojo humano.
Aumentos en el microscopio electrnico
En el microscopio fotnico para obtener imgenes a mayores aumentos, simplemente
se cambia el objetivo. En el microscopio electrnico esto no es posible y el aumento
se obtiene modificando el haz de electrones y el voltaje de la lente proyectora, puesto
que el aumento de la lente objetivo es fijo. Por ejemplo, para observar a mayores
aumentos es necesario utilizar una mayor e intensa radiacin de electrones y
modificar la distancia focal de la lente proyectora, pero disminuyendo a su vez el
dimetro del haz, con un tiempo de exposicin del espcimen sumamente corto. Al
intensificar el haz de electrones se incrementa tambin la temperatura y se puede
quemar la muestra que se observa. Al aumentar la potencia del haz se reduce el
tamao del rea que se observa y el campo visual representa reas muy diminutas
en el objeto. Para un aumento de aproximadamente 80.000x, el dimetro del rea del
campo visual es menor a un micrn (1m). Esta rea diminuta que se observa
ocupar todo el dimetro de la pantalla de observacin o de la placa fotogrfica. De
manera inversa, para observar a menores aumentos, el haz de electrones posee un
mayor dimetro y el rea de observacin a su vez tambin es mayor; en
consecuencia, a mayor dimetro del haz de electrones, menor aumento y a menor
dimetro del haz, mayor aumento.
Microscopa electrnica de transmisin
La resolucin que se puede lograr con el microscopio electrnico depende del
espesor del corte del tejido y de factores que determinen el contraste. Si el corte es
grueso se enmascaran los detalles finos, los cuales se hacen cada vez ms
imperceptibles y oscuros debido a la superposicin de elementos que se presentan
en los diversos planos de profundidad. De all que es imperativo el empleo de cortes
ultrafinos.
De manera resumida, los pasos necesarios en el procesamiento del tejido antes de
ser observado al microscopio electrnico de transmisin son los siguientes (14, 21,
23):
1. Fijacin: El tejido debe ser fijado, endurecido y preservado con tetraxido de
osmio (OsO4) y glutaraldehdo, con un cuidadoso manejo del pH (con cacodilato de
sodio), para mantener las membranas y las protenas celulares en una malla
tridimensional resistente. Los aldehdos crean puentes cruzados entre s y enlaces
covalentes con los grupos amino que estn libres en las protenas. De esta manera
se previene la degradacin oxidativa por la muerte del espcimen.
2. Contraste: Las organelas y estructuras de inters deben ser electrn-densas y
contrastar con el fondo (background). La electrondensidad se incrementa con el

nmero atmico de los elementos y solo tomos pesados crean contraste. Se

contrasta con tetraxido de osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo.
3. Deshidratacin: El espcimen va a estar en el vaco y no puede contener agua,
pues esta se evaporar y dispersar los electrones. El agua se elimina mediante
alcoholes en grado creciente de concentracin.
4. Inclusin: El espcimen deshidratado se coloca en xido de propileno y resinas
epxicas o acrlicas, las cuales se endurecen y forman un bloque slido de plstico
muy duro.
5. Corte: Se emplea un ultramicrtomo que permite rebanar el tejido en cortes
ultrafinos con una cuchilla de diamante, logrando cortes del orden de los 100 nm. Los
electrones tiene un bajo poder de penetracin y no es conveniente usar cortes
gruesos.
6. Observacin y toma de micrografas.
Algunas aplicaciones del Microscopio electrnico de transmisin:
Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales, animales y humanos (91,92, 93).
Realizacin de estudios de histoqumica e inmunohistoqumica para
identificarcompuestos especficos.
Reconocimiento de virus y sus caractersticas ultraestructurales.
Estudios de citoqumica.
Estudios de estructuras moleculares.
Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales y otros materiales.
Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros.
Determinacin del tamao de partculas.
Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos.

Microscopa electrnica de barrido

La preparacin de los especmenes difiere un poco de la preparacin para el
microscopio electrnico de transmisin, pues el microscopio electrnico de barrido
muestra imgenes en tres dimensiones (3D) en aumentos de hasta 20.000x y una
resolucin que puede llegar a los 5nm.
Preparacin de la muestra
1. Fijacin: Segn mtodos estndar de fijacin.
2. Deshidratacin: Mediante varios mtodos, pero uno de los ms utilizados es el de
deshidratacin por punto crtico en CO2, en el cual el agua pasa rpidamente de
estado lquido a vapor sin ebullicin. La deshidratacin por alcohol produce artificios
en el espcimen y no es utilizada.
3. Corte: Algunos especmenes no ameritan ser rebanados, pues se observar la
superficie del mismo.
4. Contraste: El espcimen deshidratado es revestido por una capa de grafito o de
oro.
5. Observacin y toma de microfotografas.
Algunas aplicaciones del Microscopio electrnico de barrido:
Morfologa de clulas y tejidos animales, humanos o vegetales (91).
Morfologa interna de clulas y tejidos.
Morfologa superficial de minerales.
Formas de cristalizacin de minerales.
Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos.
Estudio de molculas.
Reconocimiento de fsiles.

.-Microfotografa electrnica: Interpretacin de las imgenes

Al observar y estudiar las microfotografas electrnicas se debe ser muy cuidadoso en
la interpretacin de las imgenes de la ultraestructura celular. Muchas interrogantes
han persistido en la mente de los microscopistas, quienes han tratado de explicar y
buscar respuestas a ellas. Durante muchos aos se ha planteado la duda si en
realidad lo que se observa en las micrografas electrnicas de transmisin
corresponde a la realidad, o si por el contrario, es el aspecto de los elementos
celulares modificados por las sustancias y mtodos empleados en el procesamiento
del tejido (artificios de tcnica); o debidos a la muerte celular y sus efectos en el
citoplasma, notablemente en los lisosomas. Estas dudas sobre los artificios de
tcnica han podido disiparse (en parte) mediante el uso de controles negativos y al
comparar entre s las micrografas de microscopa de luz, electrnica de transmisin y
de barrido. Con el empleo de tcnicas ms recientes como inmunofluorescencia y
microscopa confocal muchas estructuras presentes en la clula han sido estudiadas,
corroborando su aspecto morfolgico observado previamente en las micrografas
electrnicas.
El contraste observado en las microfotografas electrnicas de transmisin depende
de ciertas propiedades del espcimen, del sistema ptico del microscopio y de las
condiciones de iluminacin y reproduccin fotogrfica.
Las regiones del espcimen que contienen metales pesados empleados en la
obtencin del preparado, aparecen como regiones oscuras (electron-densas) debido
al poder que poseen los tomos del metal pesado en dispersar los electrones que
inciden sobre la muestra. Las regiones del espcimen (por ejemplo cristales) que
poseen una mayor densidad aparecern ms oscuras que las regiones vecinas
amorfas (fig. 5-10). A mayor cantidad de metal depositado, mayor electrondensidad,
lo cual permite un marcado contraste, el cual es revelado en una amplia gama que va
desde el negro, pasando por los tonos de gris hasta llegar al blanco; esto ltimo
representa las zonas en las que no se deposit el metal. Variaciones en el espesor
del espcimen afectan la interpretacin debido a la superposicin de elementos; a
mayor espesor, mayor contraste, de all que el espesor del corte debe ser mnimo
(alrededor de 100 nanmetros). Los cortes son colocados en una rejilla (portaobjeto)
de cobre revestida de una pelcula plstica y este material puede incrementar la
granulosidad en la imagen y puede interferir seriamente con el contraste de la
microfotografa (14).
Las microfotografas electrnicas de barrido muestran una imagen 3D (tridimensional)
del espcimen analizado. En la micrografa las zonas ms oscuras corresponden a
los planos ms profundos y las zonas ms claras a los planos ms superficiales del
espcimen, a partir de los cuales se origin una mayor cantidad de electrones
secundarios. Al componerse la imagen de zonas claras y oscuras se puede apreciar
el relieve y las depresiones, que en conjunto, conformarn el aspecto tridimensional

.- Microfotografa electrnica de una mitocondria al Microscopio electrnico de

transmisin. Las zonas ms oscuras son denominadas electron-densas y las zonas
claras son denominadas electron-lcidas. Ntese la variada electrondensidad, la cual
depende del grado de afinidad de las estructuras por los metales empleados para el
contraste. Aumento 60.000x. Tomada de Raisman, J., Gonzlez A. Hipertextos en el
rea de biologa. Microscopa electrnica (94).

- Microfotografa electrnica de un glomrulo renal al Microscopio electrnico de

barrido. La imagen obtenida se observa en tres dimensiones, donde la profundidad de
campo permite visualizar los diversos relieves. Aumento 1.200x.

Semejanzas y diferencias entre la microscopa electrnica y la microscopia de

luz
5.7.1.-Semejanzas (fig. 5-12):
Diseo y funciones de sus elementos.
En relacin al sistema de iluminacin: La radiacin empleada incide directamente
sobre la muestra en estudio. Est conformado por una fuente emisora de la radiacin
y un condensador que enfoca el rayo sobre el preparado histolgico.
El espcimen se coloca entre el sistema de iluminacin y los objetivos o sistemas de
formacin de la imagen.
En relacin al sistema ptico: Las lentes acopladas producen una imagen
aumentada del espcimen en estudio. Conformado por una lente objetivo que forma
una imagen intermedia y la lente proyectora (ocular, en el caso del microscopio
fotnico) que a su vez aumenta la imagen intermedia para formar la imagen
aumentada final.
Pueden convertir la radiacin empleada en una imagen permanente
(microfotografa).

5.7.2.-Diferencias: Tabla 5-2

Elemento

LENTES

AUMENTO

Microscopio fotnico

Microscopio electrnico

De cristal o vidrio, con Magnticas, a partir de metales

distancias focales fijas magnticos, alambre de cobre
enrollado, cuya distancia focal
vara en relacin con la
corriente que pasa por la bobina
de cobre

Se consigue
cambiando los
objetivos, rotando el
revlver

El aumento del objetivo es fijo

(distancia focal) mientras que la
distancia focal de la lente
proyectora vara para lograr los
aumentos

PROFUNDIDAD
DE CAMPO

Pequea, por lo que se Mayor, por lo que se puede ver

pueden ver diferentes enfocado todo el espesor del
corte ultrafino del espcimen
planos de enfoque al
mover el tornillo
micromtrico

FUENTE DE LA
RADIACIN

Haz de luz: fotones.

Generalmente situada
por debajo del
espcimen (aunque
hay excepciones)

Haz de electrones.
Ubicada siempre en lo alto del
instrumento, por encima del
espcimen

ALTO VACO

No es necesario

Imprescindible, para facilitar el

desplazamiento de los
electrones

RESOLUCIN

0,2 m

0,2nm

Tabla 5-2.-Comparacin entre las caractersticas generales de los microscopios de

luz y microscopios electrnicos.

.-Comparacin de tres tipos de microscopios y sus caractersticas ms resaltantes.

LA MICROSCOPA:
NUEVAS TENDENCIAS.
Los adelantos e innovaciones en diversas reas tecnolgicas, sobretodo en la
informtica, as como en la fabricacin de instrumentos y un exigente control de
calidad, son condiciones que contribuyen al desarrollo y perfeccin de los sistemas
pticos y dems dispositivos que se emplean para la formacin y la adquisicin de las
imgenes microscpicas. La microscopa ha sido y seguir siendo una tcnica
insustituible de inestimable valor en la investigacin cientfica y los avances
tecnolgicos conducirn sin lugar a dudas al perfeccionamiento de la misma y al
diseo de nuevos mtodos cada vez ms sofisticados.
La tcnica microscpica se ha desarrollado con el transcurso de los aos, logrando
resoluciones antes insospechadas como la visualizacin de tomos a un aumento
sorprendente. De igual manera se ha logrado intensificar el contraste mediante
numerosas tcnicas al estudiar clulas y tejidos; sin embargo, la mayora de ellas
producen alteraciones que pueden distorsionar la realidad, o peor an, pueden ser
letales para las clulas vivas; motivo por el cual el estudio de clulas muertas y
fijadas se ha visto favorecido, permitiendo primordialmente el examen detallado de la

morfologa celular. En estas circunstancias la investigacin de las funciones celulares

se ha visto limitada en cierta medida, no obstante, el reto futuro es el
perfeccionamiento del estudio microscpico de clulas vivas, a una resolucin
importante, mediante aumentos y contraste suficientes y cada vez ms especficos,
tanto para el estudio in vitro como el de las clulas dentro del organismo; ste hecho
considerado ideal ya ha sido logrado en cierta manera.
La microscopa evolucionar para permitir el estudio y comprensin, no slo de
nuevos aspectos de la morfologa a una escala nanomtrica, sino tambin para
obtener nuevos datos al observar la clula viva, en plena actividad y desarrollo de sus
funciones vitales; as como su comportamiento y respuestas ante diversas
modificaciones de su medio y su relacin con las clulas vecinas.
Como respuesta a las inquietudes y limitaciones planteadas, en la actualidad se
realizan congresos en los que profesionales tales como bilogos celulares, mdicos,
fsicos, qumicos, matemticos, ingenieros y representantes de otras profesiones,
asisten con el propsito de promover la colaboracin interdisciplinaria y la
introduccin de nuevos mtodos y aplicaciones biolgicas, con la finalidad de cambiar
el concepto que el estudio y la obtencin de imgenes de la clula viva es slo una
tcnica ms de la biologa celular, para convertirlo en una nueva ciencia experimental
que involucre numerosos campos de investigacin
En los ltimos aos los estudios de clulas vivas han venido mejorando notablemente
gracias a los avances y hallazgos crticos en fluorescencia, notablemente con la
ptica de dos fotones.

En microscopa y formacin de imgenes las tendencias e instrumentos ms

resaltantes son:
Deconvolucin
Microscopios confocal
Microscopa CARS
Microscopa de Resonancia Magntica de Fuerza
Microscopa Virtual
Digitalizacin y procesaiento de imgenes microscpicas
Nuevas tecnologas

Deconvolucin
Trmino de reciente empleo que se refiere al tratamiento de imgenes defectuosas
(image deconvolution, trmino en ingls).
Es una tcnica de restauracin de imgenes borrosas o sucias que permite
desenmascarar datos para obtener informacin valiosa a partir de ellas, mediante la
aplicacin de tratamientos matemticos computarizados. La deconvolucin fue
empleada inicialmente en sismologa y astronoma (imgenes telescpicas) y sus
ventajas han ganado campo en la microscopa y otras tcnicas biomdicas.
Si los objetos son ms pequeos que la resolucin del microscopio, la imagen se ve
borrosa. Mediante la deconvolucin se reconstruyen los elementos eliminando las
seales de ruido que contaminan la imagen. Se puede reconstruir la estructura celular
en tres dimensiones.

.-Macrfago marcado con anticuerpos fluorescentes para tubulina (amarillo) actina

(rojo) y el ncleo (azul). A la izquierda se aprecia la imagen obtenida con un
microscopio fluorescente y a la derecha la imagen mejorada mediante la
deconvolucin gracias a la aplicacin de programas de computacin.Tomado de
Deconvolucin Huygens. Scientific Volume Image .

Microscopios confocal
Dentro de las diversas tcnicas microscpicas conocidas, la confocal es sin lugar a
dudas una de las que ms atractivos ofrece y se mantendr a la vanguardia de los
mtodos para visualizar y estudiar el micromundo. El perfeccionamiento de los
marcajes fluorescentes y la disponibilidad de sistemas de fuentes de luz cada vez
ms verstiles son algunas de las variables que mantendrn durante mucho tiempo al

microscopio confocal como un instrumento de primera lnea en la investigacin

biomdica.
Microscopa CARS
Tambin conocida como microscopa Raman. Es una de las tcnicas de vanguardia y
sin precedentes (CARS: Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) y una de las
tcnicas pticas no lineales o NLO (Non Linear Optics) que permite obtener imgenes
de alta resolucin en tejidos vivos o recientemente extrados. Como una de las
ventajas de esta tcnica es que, al contrario de la microscopa convencional, con esta
tcnica no se requieren ni cortes finos o colorantes, los cuales pueden ocasionar
alteraciones en las clulas. Por el contrario, se estudian piezas gruesas de tejidos u
rganos y sin coloracin alguna se obtiene imgenes 3D, incluso de los tejidos
profundos.
Es una tcnica fotnica de alta resolucin que permite obtener en pocos segundos
informacin sobre la temperatura, composicin qumica y estructural de casi todo tipo
de material, orgnico o inorgnico.
Se realiza un anlisis mediante espectroscopia que se fundamenta en el estudio de la
luz dispersada por el espcimen al incidir sobre l un rayo laser, sin la necesidad de
realizar ningn tipo de preparacin y no produce daos sobre el tejido que se estudia,
es una tcnica no invasiva.
Una pequea porcin de la luz que entra en un material sufre cambios de su
frecuencia, es decir, cambios de color. Estos cambios son caractersticos de cada
material, lo que facilita su identificacin.
Con este mtodo se puede detectar las vibraciones de los enlaces qumicos de los
componentes celulares, notablemente de los lpidos, como por ejemplo los contenidos
en la mielina. Se emplea una luz monocromtica (laser) y el patrn de dispersin de
la luz (espectrograma) refleja los cambios en los estados de las molculas.
.-El fenmeno Raman
Fue descrito inicialmente por el fsico indio Chandrasekhara Venkata Raman en el
ao 1928, motivo por el cual gana el premio Nobel de Fsica en el ao 1930.
Mediante un experimento sencillo demostr que el color azul del agua proceda de un
fenmeno propio o de dispersin de la luz al interactuar con las molculas de agua.
Uno de sus colaboradores not que la luz solar filtrada cambiaba de color al pasar por
el agua y alcoholes, efecto que no fueron capaces de suprimir y lo atribuyeron como
una caracterstica propia de esas sustancias. Este fenmeno se denomin radiacin
secundaria y se logra al hacer incidir sobre una muestra un rayo de luz de una
frecuencia determinada. La luz dispersada por la muestra puede tener la misma
frecuencia de la luz incidente pero esto es irrelevante; o por el contrario, la luz
dispersada puede presentar una frecuencia diferente a la de la luz incidente y esta si
aporta datos sobre la composicin molecular de la muestra y es lo que se denomina
dispersin Raman.
Estas variaciones de frecuencia corresponden a variaciones de energa.

Los tomos e iones de la muestra estn en constante movimiento (vibracin y

rotacin) el cual est determinado por la masa y los enlaces qumicos.
A cada movimiento corresponde un determinado nivel de energa molecular.Cuando
los fotones de la luz incidente tienen una energa mayor, estos chocan con las
molculas de la muestra y la mayora de los fotones la atraviesa; pero unos pocos
fotones son dispersados (uno por cada 1011). Cada fotn incidente ocasiona cambios
en las molculas, llevndolas a un nivel de energa superior y estas para recuperar
rpidamente el equilibrio emiten un fotn, el cual al ser liberado, a su vez tendr una
frecuencia determinada. El fotn dispersado puede tener una frecuencia diferente a la
de los fotones incidentes, la cual puede ser mayor o menor y se visualiza con un color
diferente al de la luz incidente. Cada material tendr un patrn caracterstico de
dispersin de los fotones y en ocasiones se produce un efecto de fluorescencia Esta
tcnica permite el anlisis de materiales sin la necesidad de preparaciones especiales
y no ocasiona daos a las muestras, las cuales pueden ser slidas, lquidas o
gaseosas. Es inocuo para las clulas y tejidos vivos.

El microscopio CARS
Los primeros experimentos en microscopa con el mtodo CARS se iniciaron en la
dcada de 1980 por Duncan y colaboradores (148), pero en el ao 1999 Xie y
colaboradores revivieron esta tcnica microscpica (149) y desde entonces
numerosos avances se han logrado combinando varias tcnicas, dentro de ellas la
microscopa multifotnica multimodal (MMM). Se logra combinando varias tcnicas
para conformar un microscopio muy complejo.
Conformacin del microscopio:
Estas tcnicas han abierto nuevas perspectivas en microscopa, permitiendo
principalmente la obtencin de imgenes tridimensionales. De manera simplificada,
para facilitar la comprensin de la configuracin y principios de este instrumento, se
puede decir que es un microscopio de barrido que emplea rayos lser y est
diseado con la combinacin de las tcnicas
Fluorescencia con iluminacin de dos fotones.
Frecuencia de suma (SFG: Sum Frecuency Generation): Generacin de una luz
cuya frecuencia es la suma de otras dos frecuencias.
ptica no lineal (NLO) basada en CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering):
Se logra con lser de alta intensidad y emitido en pulsaciones de alta frecuencia el
cual al pasar por un medio transparente produce cambios en la frecuencia de la luz
(mezcla de frecuencias, armnicos).

Esquema simplificado del microscopio de barrido lser CARS que permite la

formacin de imgenes mediante la combinacin de CARS, fluorescencia de dos
fotones (TPEF) y generacin de frecuencia de suma (SFG). Se emplean dos rayos
lser de pulso sincronizado (wp ws). Tomada de Cheng .J. X. Coherent anti-Stokes
Raman scattering microscopy.
Como fuente de iluminacin se emplean dos rayos lseres de zafiro, sincronizados
mediante un controlador electrnico en pulsos en el orden de 5 picosegundos (150) y
dispuestos de manera paralela para ser combinados en uno solo (SFG) el cual es
enviado a un microscopio de barrido confocal.
Ventajas de la microscopa CARS :
Permite un contraste basado en las vibraciones moleculares que son intrnsecas y
propias de la muestra. Por lo tanto, no se requiere coloracin u otro medio de
contraste fluorescente, evitando as la toxicidad de dichas sustancias qumicas y
algunos artificios de las tcnicas de coloracin o marcaje.
Gracias a la ptica no lineal (NLO) y a la alta intensidad del lser, permite la
obtencin de cortes pticos tridimensionales de clulas y es muy til en el estudio de
tejidos gruesos.
Mediante el empleo de longitudes de onda cercanas al espectro infra-rojo, se tiene
un mayor poder de penetracin en la muestra de alrededor 0.3mm, permitiendo la
obtencin de imgenes en muestras gruesas de tejidos.

 En condiciones de uso normal, hay absorcin escasa o nula de los dos rayos lser
empleados, lo cual reduce el dao del tejido producido por las radiaciones utilizadas.

Diagrama esquemtico de un microscopio CARS multimodal que permite deteccin

CARS (E-CARS: epi-deteccin, F-CARS: (forward) deteccin anterior), fluorescencia
de dos fotones (TPEF) y generacin de frecuencia de suma (SFG). Dos rayos lseres
de zafiro se sincronizan y combinan para ser enfocados en el espcimen. Las seales
CARS son recogidas por un condensador y detectadas por un fotomultiplicador 1
(PMT1), otras seales (E-CARS), de fluorescencia de dos fotones (TPEF) y de
frecuencia de suma (SFG) son colectadas por el objetivo y detectadas por otro
fotomultiplicador 2 (PMT2). Un espectrmetro analiza seales para anlisis
microespectral con una resolucin de un pixel mediante barrido confocal. Tomado de
Wang H W, Le T, Cheng J X, (2008). Opt. Comm., 281, 1813-1822. (151).

Aplicaciones:
Este microscopio se aplica en numerosas reas tales como la petroqumica y
notablemente en la biomedicina el estudio de protenas, lpidos, carbohidratos y otras
molculas en su estado fisiolgico natural y en el estudio de procesos como la
respuesta inmune, enfermedades del sistema nervioso central y desarrollo de otros
tumores
El estudio de dominios lipdicos y la heterogeneidad en la composicin de las
membranas celulares es crucial para entender fenmenos de transduccin de

seales, trfico de membranas y en enfermedades. El empleo de CARS para la

deteccin de la vibracin de CH2 de los lpidos de membrana ha permitido el anlisis
cualitativo y cuantitativo de los mismos
Se ha utilizado recientemente en la observacin de pacientes con daos de la mdula
espinal y nervio citico y en estudios de cncer, enfermedades cardiovasculares y
obesidad . Las perspectivas que se tienen con este mtodo de obtencin de
imgenes son muchas, como por ejemplo el estudio de la difusin de medicamentos y
su distribucin en los tejidos en tiempo real (gracias a la fluorescencia de ciertos
polmeros biodegradables que se emplean como vehculo para los medicamentos).
Otra de las aplicaciones es en la endoscopia para diagnosticar tumores de rganos y
lesiones en las arterias.
En el futuro se plantea la aplicacin de los tratamientos mdicos de manera
individualizada en pacientes que no responden a los frmacos habituales, al
permitirles a los mdicos un estudio detallado de la arquitectura de las lesiones y su
progreso o mejora. Se promete por este medio un mejor diagnstico y un tratamiento
adecuado a cada paciente en particular.

.-Imgenes de la vaina de mielina obtenidas por CARS a partir de la mdula espinal

de un animal de experimentacin (cobayo). A, Esquema que muestra el
procedimiento para la obtencin de la muestra de sustancia blanca de la mdula
espinal del cobayo. B, perfil del espectro de la mielina en CARS. C, Mielina (lneas

blancas) en axones paralelos mediante F-CARS. D, imagen de un nodo de Ranvier

mediante CARS. E, imagen de dao en el nodo de Ranvier, causado por
lisofosfatidilcolina.

.-Imgenes de cortes de pared de arteria cartida obtenidas mediante ptica no lineal

(NLO) en un microscopio multimodal CARS, dos fotones (TPEF) y de frecuencia de
suma (SFG) con un objetivo 20x. En a, imagen CARS en gris de la pared arterial. Se
ha superpuesto la imagen de las bandas de elastina obtenida mediante la tcnica de
fluorescencia de dos fotones (en verde, imagen del centro). En b, en la parte superior
se aprecia un modelo que muestra un corte transversal de la arteria y en verde la
fluorescencia de las bandas de elastina en la pared. En c, imagen de frecuencia de
suma donde el colgeno se ve de color azul y superposicin de la imagen b para
mostrar simultneamente la disposicin de colgeno y elastina en la capa media de la
arteria.

.-Imagen tridimensional de adipocitos mediante la tcnica de fluorescencia de dos

fotones (rojo) y fibras de colgeno tipo I mediante la tcnica de frecuencia de suma
(SFG) (verde).
Microscopa de Resonancia Magntica de Fuerza
Tcnica lograda por cientficos de la compaa IBM y an en desarrollo que combina
la resonancia magntica con el microscopio de fuerza atmica para obtener imgenes
tridimensionales a una escala atmica y molecular. Ideal para el estudio de la
estructura tridimensional de las protenas, medicamentos y dems elementos a una
escala nanomtrica.
Microscopa Virtual
A finales del siglo XX, en la dcada de los aos 1990, los avances en informtica
permitieron el uso de cmaras de video acopladas a los microscopios como
herramientas indispensables para la captura y digitalizacin de imgenes, tanto de
imgenes en movimiento como microfotografas estticas. Las imgenes obtenidas
se visualizaban en los monitores de las computadoras y su principal aplicacin era la
docencia (enseanza y evaluacin de contenidos prcticos a distancia). La aparicin
y perfeccionamiento de programas para la captura, edicin y anlisis de las imgenes
permiti el uso de estas tcnicas con fines no solo docentes, sino tambin cientficos
y de diagnstico. Los libros de Histologa actuales incluyen lminas virtuales
presentadas en formato CD-ROM (1, 95) y en algunos casos la casa editorial permite
a los usuarios el acceso al sitio web para ver las imgenes del texto disponibles en la
red.

La internet tambin permite que los microscopistas del mundo entero puedan
intercambiar imgenes rpidamente y de esta manera se facilita la discusin sobre
sus apreciaciones y diagnsticos patolgicos.
Esto ha conducido al desarrollo de lo que actualmente se conoce como microscopa
virtual, en la que varios computadores conectados mediante redes de alta velocidad
permiten la manipulacin de micrografas digitales y la comunicacin entre los
cientficos para facilitar la investigacin a distancia.
La microscopa virtual es un sistema que contempla:
La observacin microscpica de un preparado histolgico. Generalmente se emplea
un microscopio automatizado para recorrer el preparado y facilitar la operacin.
La captura o adquisicin y digitalizacin de la imagen microscpica de la totalidad
del preparado (o de una zona determinada que revista de especial inters). Las
imgenes son de muy alta resolucin. La captura se realiza a diferentes aumentos y
se obtienen varias imgenes que luego son ensambladas mediante programas de
computacin para formar lo que se conoce como una mega-imagen, reconstruida a
partir de imgenes seriadas
Almacenamiento en computadores servidores con gran capacidad.
Acceso a los servidores para navegar y observar a distancia, mediante programas
de computacin, las microfotografas a varios aumentos, simulando un microscopio
convencional.
Comunicacin de los investigadores entre s, mediante sitios web que contienen
foros, chats o correos electrnicos.
La microscopa virtual se utiliza notablemente en el diagnstico patolgico a distancia
y otras aplicaciones derivadas. Muchas universidades y otras instituciones de
diversos pases poseen sitios web con microscopios virtuales.

Una vez digitalizada la muestra A mediante un microscopio y almacenada en la

computadora B es enviada al servidor C. Generalmente se realiza el escaneado o
digitalizacin a varios aumentos, en este caso se realiza a 20x y 40x. Las imgenes
son catalogadas y almacenadas mediante el uso de programas adecuados que
permiten al usuario acceder a la base de datos D y visualizar la micrografa en el
monitor E de su computadora y as discutir con los colegas

Aplicaciones de la microscopa virtual

El uso a distancia de recursos e instrumentos interactivos en tiempo real para
investigaciones cientficas.
Acceso a instrumentos a distancia para evaluar su desempeo y uso de servicios de
diagnstico y asistencia tcnica.
En docencia, permite a los estudiantes el acceso a bases de datos remotas de
imgenes microscpicas para completar sus estudios y consultar tutores a distancia.
Reconstruccin de imgenes tridimensionales a partir de mltiples micrografas.

 Amplio registro de informacin al permitir compartir las bases de datos de las

diversas instituciones cientficas.

Prototipo de programa de computacin o microscopio virtual. Se pueden obtener tres

aumentos. La imagen a mayor aumento (40x) reproduce el rea de los recuadros que
se aprecia en la parte superior. Arriba y a la izquierda la imagen en menor aumento,
con un recuadro que es ampliado y visualizado arriba y a la derecha a mediano
aumento. La imagen del fondo representa el mayor aumento.

Digitalizacin y procesamiento de imgenes microscpicas

Las tcnicas de fotografa y video convencionales se ven opacadas por las tcnicas
modernas de fotografa digital, las cuales son cada da ms excelentes. Las
imgenes obtenidas mediante un microscopio convencional pueden ser capturadas
con cmaras digitales y procesadas con programas especiales para tal fin. El

resultado es el incremento de detalles e informacin que se puede obtener a partir de

la imagen original. Dentro de estas tcnicas se describe la deconvolucin.
Como una de las ventajas de estas tcnicas informticas est la posibilidad de
revertir los cambios realizados y adems se obtienen imgenes de mayor calidad (fig.
7-9). Una vez capturada la imagen, se procesa con un programa que permite la
aplicacin de una serie de filtros para modificar el ruido de fondo, el contraste, el brillo
y la saturacin de colores; variables stas que son manipuladas para mejorar
sustancialmente el aspecto final de la imagen (12). En la actualidad el procesamiento
de las imgenes es una de las herramientas que se considera indispensable en la
obtencin de micrografas de calidad.
Las tcnicas de microfotografa evolucionarn gracias a los avances en computacin
y al diseo de cmaras y otros dispositivos de captura cada vez ms eficientes y al
desarrollo y perfeccionamiento de novedosos programas de computacin para
procesamiento de imgenes.

.-Imagen de campo claro de una diatomea. a, imagen original. b, despus de la

aplicacin de un filtro de enfoque, el cual a su vez incrementa el ruido de fondo. c,
luego de la aplicacin de filtro Sigma noise reduction y filtro de enfoque moderado. d,
despus de la aplicacin de otro filtro de enfoque.

Nuevas tecnologas
Algunas de las tendencias ms novedosas que han llamado la atencin en el campo
de la microscopa, altamente influenciadas por la informtica y las
telecomunicaciones.
CellScope

Aprovechando los avances en telecomunicaciones, investigadores en la Universidad

de Berkeley en California (Estados Unidos) han desarrollado un instrumento que
consiste en un microscopio que se puede conectar a un telfono celular para facilitar
los diagnsticos a distancia (telemicroscopa). Permite aumentos que van desde 5x
hasta 60x y es utilizado tanto para diagnsticos macroscpicos como microscpicos
en preparados histolgicos de rutina (biopsias, frotis). Posee iluminacin LED
potente. Se encuentra en periodo de prueba en reas rurales de algunos pases de
frica y Asia donde la presencia de mdicos es limitada

.CellScope o microscopio porttil adosado a un telfono celular para diagnsticos a

distancia. Gracias a las telecomunicaciones, este microscopio permite la visualizacin
en directo de lesiones macroscpicas y de especmenes en lminas histolgicas.
Microscopio USB
Microscopio digital que se conecta a una computadora mediante un puerto USB
(universal serial bus) con buena calidad visual para observar muestras directamente
en la pantalla del monitor. Es muy sencillo y permite aumentos de 20x, 50x y 200x. El
software suministrado permite la toma de micrografas. Es de suma utilidad en
muchas situaciones, ya sea para inspecciones industriales, colegios, estudios
forenses, control de calidad y muchas otras aplicaciones. La iluminacin es mediante
LED. Este instrumento es interesante porque puede tenerse en el hogar y de esta
manera la microscopa puede estar al alcance de todos, sobretodo de los nios, a
quienes este instrumento podra resultar atractivo y motivarlos a observar el mundo
microscpico.

Pequeo microscopio digital que se conecta a la computadora mediante un puerto

USB.
Las nuevas tecnologas son atractivas, cada vez ms eficientes y seguirn
planteando nuevos retos a los investigadores; sin embargo, el clsico
microscopio de luz es el instrumento que seguir acompaando durante mucho
tiempo a los microscopistas en su esfuerzo por conseguir diagnsticos
precisos y en sus sueos con revelar los misterios que an se reservan las
clulas y tejidos.

CONCLUSIONES
El microscopio, el cual permite la observacin y obtencin de imgenes aumentadas
de esos especmenes diminutos, que a simple vista resultan invisibles.
El microscopio ha sido y ser el instrumento de mayor utilidad en el estudio de las
clulas y tejidos.
La interrelacin de disciplinas ha sido y ser siendo necesaria para permitir el diseo
de los microscopios y otros instrumentos de laboratorio empleados para resolver
limitaciones en el estudio de las clulas.
Para resaltar los detalles de los especmenes, adems de las coloraciones se han
creado microscopios especiales para tal fin, permitiendo adems la observacin de
clulas vivas.. El poder de aumento de los microscopios se ha perfeccionado al
conocer los mecanismos involucrados en la formacin de las imgenes, modificando
en los instrumentos algunos elementos tales como el tipo de iluminacin, el sistema
ptico o el mtodo para obtener las imgenes, logrando incrementar la resolucin de
los instrumentos. Actualmente pueden verse desde elementos ultraestructurales
cuyas dimensiones estn en el orden de las micras, hasta elementos atmicos de
dimensiones nanomtricas.
Dilucidar las caractersticas de la luz visible, su comportamiento y propiedades, as
como tambin su rol en la formacin de las imgenes ha permitido comprender las
diferencias entre una imagen real y una imagen virtual, siendo esta ltima una imagen
subjetiva que no puede ser proyectada sobre un medio fsico. Slo existe en la mente
del observador y se forma mediante un complejo mecanismo que involucra leyes de
la fsica ptica. Por el contrario, la imagen real puede ser recogida sobre un medio
fsico, como por ejemplo una pantalla o una placa fotogrfica.
Se ha demostrado que la capacidad de aumento de un microscopio depende de la
longitud de onda del tipo de radiacin que se emplee, establecindose la relacin de
manera inversamente proporcional, es decir, a menor longitud de onda, mayor poder
de resolucin. Disminuir la longitud de onda permite ver objetos cada vez ms
pequeos de manera individualizada.
Los sistemas pticos no son perfectos, pueden presentar ciertos defectos que
interfieren con la calidad de las imgenes formadas.
En el diseo de los microscopios modernos prevalece el concepto de ptica infinita
que permite flexibilizar el modelo clsico para adaptarlo a las nuevas exigencias de la
microscopa.
Los microscopios son instrumentos que permiten tanto la observacin del aspecto y
forma de las clulas y tejidos como la cuantificacin de variables observadas, tales
como dimensiones, dimetros, longitudes, cantidades, entre otras. Adems de su uso
en la biologa, tienen un sinfn de aplicaciones en medicina forense, mineraloga,
ciencia de los materiales, entre otras.

La microscopa ha tenido un renacimiento con la invencin del microscopio confocal y

el microscopio basado en el fenmeno Raman. Son tcnicas innovadoras que
permiten formar imgenes ms ntidas e inclusive en tres dimensiones, tanto de
clulas muertas o fijadas como de clulas vivas, lo cual es una propiedad que facilita
la apreciacin de las estructuras celulares de una forma ms aproximada.
La informtica ha contribuido de manera decisiva mejorando la tcnica microscpica
gracias al uso de hardware y software adaptados a las necesidades crecientes de los
investigadores. Muchos modelos de microscopios modernos tienen partes
electrnicas que permiten la automatizacin. Muchos programas informticos
simplifican, agilizan y permiten la captura y digitalizacin de las imgenes para su
posterior tratamiento y anlisis ms detallado, lo cual es una gran ventaja en relacin
con las tcnicas convencionales. La internet ha favorecido la comunicacin a
distancia de investigadores quienes intercambian sus bases de datos y opiniones con
fines docentes, de diagnstico y de investigacin.
An cuando se ha logrado un progreso considerable en la microscopa, no todo est
dicho. En el futuro, tal cual como se ha demostrado en el pasado, a medida que
avance la tecnologa se implementarn instrumentos y tcnicas cada vez ms
eficientes y con aplicaciones novedosas que permitirn incrementar los
conocimientos en el mbito de la biologa celular y la histologa. Cada vez son ms
frecuentes los nuevos aportes que sorprenden a los interesados en el tema y debido
al gran y constante incremento en la informacin es casi imposible estar al tanto de
tod o, a pesar del fcil acceso a internet, que en los ltimos aos se ha convertido en
la base de datos ms grande que existe. La microscopa seguir evolucionando.