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Mtodos y Tcnicas en

Biopatologa Clnica:

Laboratorio de Androloga
Jos Luis Girela Lpez
Dpto. de Biotecnologa
Universidad de Alicante
girela@ua.es

De media, un hombre produce 200 millones de espermatozoides diarios.

MEIOSIS

Aproximadamente cada 75 das, una cohorte de espermatozoides en


maduracin pasan a travs de diferentes fases de desarrollo. De clulas
primordiales a espermatocitos, a espermtides, y finalmente a
espermatozoides maduros.

Los espermatozoides acaban su paso por el epiddimo despus de unos


12 das. Aqu es donde llevan a cabo sus ltimas fases de desarrollo y
donde son finalmente almacenados.

Los fluidos producidos por las vesculas seminales y la prstata son


aadidos justo antes de la eyaculacin.

VALORACIN ENDOCRINA:

Principales hormonas implicadas:


GnRH: Hormona liberadora de gonadotropinas.
FSH: Hormona foliculo estimulante.
LH: Hormona luteinizante o ICSH: hormona

estimulante de las clulas intersticiales.


Testosterona
Inhibina

Hipotlamo
GnRH

Hipfisis
anterior

LH / ICSH

FSH
FSH

Leydig
Testosterona

Funciones
Sistmicas de la
testosterona

Sertoli
ABP

Inhibina B

Espermatognesis
y maduracin espermtica

VALORACIN ENDOCRINA BSICA EN ESTERILIDAD MASCULINA


VALORACIN CLINICA

FSH

LH

TESTOSTERONA

PROLACTINA

Espermatognesis normal

Normal

Normal

Normal

Normal

Hipogonadismo
hipogonadotropo

Baja

Baja

Baja

Normal

Espermatognesis
anormal

Alta/Normal

Normal

Normal

Normal

Fallo testicular.
Hipogonadismo
hipergonadotropo

Alta

Alta

Normal/Baja

Normal

Tumor hipofisario
productor de prolactina

Normal/Baja

Normal/Baja

Baja

Alta

ANLISIS DE SEMEN:

SEMEN:
Fluido biolgico que se observa tras la estimulacin
sexual y que recibe el nombre de eyaculado.
El eyaculado esta compuesto por:
Un componente slido: los espermatozoides.
Un componente lquido: el plasma seminal, que
tiene origen multiglandular y que vehiculiza al
anterior.

SECUENCIA Y COMPONENTES DEL EYACULADO


Orden

Glndula

Componentes
fundamentales

Volumen (%)

Uretral y
bulbouretral

Mucoproteinas

0,1-0,2 ml

Prstata

Ac. Ctrico.
Fosfatasas.
Esoermina.
Iones.
-amilasa...

0,5-1 ml.
15-30%

Glicerilfosforilcolina.
Ac. Silico.
Fosfolpidos.
Carnitina.
Proteinas.
ESPERMATOZOIDES

0,1-0,3 ml.
10%

Fructosa. Proteinas.
prostaglandinas

2-2,5 ml.
50-80%

Epiddimo.
Deferente.
Ampolla deferencial

Vesculas seminales

pH

cido

Alcalino

ESTUDIO DE SEMEN BASAL O SEMINOGRAMA:


Estudio de las caractersticas citomorfolgicas y
funcionales de los espermatozoides.

CONSIDERACIONES PRVIAS (I):


Existencia de una gran variabilidad intraindividual,
debido a que el proceso de produccin celular, la
espermatognesis, es un proceso cclico. El ciclo
de la espermatognesis dura aproximadamente
unos 75 das.
Posible existencia de factores, tanto endgenos
como exgenos, que pueden producir alteraciones
en la calidad seminal (ocupacionales, ambientales,
estados de salud,...)

CONSIDERACIONES PRVIAS (I):

CONSIDERACIONES PRVIAS (II):


Se deben seguir unas pautas estrictas en la obtencin
y procesamiento de las muestras. Estas pautas estn
establecidas mediante la publicacin peridica, por
parte de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
del "Manual de laboratorio de la OMS para el
examen del semen humano y la interaccin entre
el semen y el moco cervical" (OMS, 1999)

CONSIDERACIONES PRVIAS (III):


Instrucciones que se deben seguir para la correcta
obtencin de la muestra:
Abstinencia sexual entre 3 das (mnimo) a 7 das
(mximo).No es vlido si existe polucin nocturna.
Obtencin de la muestra de semen directamente
al frasco (masturbacin) TODO EL VOLUMEN.
Acudir con la muestra al laboratorio. ANTES DE
UNA HORA.

RECOLECIN DE UNA MUESTRA DE SEMEN:


El recipiente de recogida de muestras debe ser un frasco
estril de orina de boca ancha.

ESTUDIO DE SEMEN BASAL O SEMINOGRAMA:


Examen macroscpico

Examen microscpico

Aspecto.

Concentracin.

Viscosidad.

Motilidad.

pH.

Viabilidad.

Volumen.

Morfologa.

EXAMEN MACROSCPICO (IV)


VOLUMEN:

Debe ser > 2ml

EXAMEN MACROSCPICO (I)


ASPECTO:

NORMAL

TRANSPARENTE

EXAMEN MACROSCPICO (II)


VISCOSIDAD Y FILANCIA:

NORMAL

AUMENTADA
Hilos de filancia

10

EXAMEN MACROSCPICO (III)


pH:

Rango de pH normal: > 7,2

ALGORITMO DIAGNOSTICO MACROSCOPICO DEL EYACULADO

pH

< 6,9

6,9-8

Licuefaccin

>8

Retardada

Coagulacin

Normal

Retardada

Volumen

<1,5ml

>1,5ml

Insuficiencia Prosttica
Vesiculitis Prosttica

Normal
Insuficiencia o agenesia de
vesiculas seminales

Esperma diluido por orina

Fructosa

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EXAMEN MICROSCPICO:
En el que se valora:
Motilidad.
Viabilidad.
Recuento de espermatozoides y
clulas redondas (Concentracin).
Presencia de aglutinaciones.
Ensayo hipoosmtico (HOS-test).

MOTILIDAD:
Podemos encontrar 4 patrones de motilidad

12

MOTILIDAD (II):
Los valores de referencia son:
Al menos un 25 % de tipo +++ o
al menos un 50 % suma de tipos ++ y +++
En caso de no cumplir estos valores la muestra se
denomina ASTENOZOOSPERMIA.

VIABILIDAD:
Muestra el % de espermatozoides vivos.
Existen diferentes tcnicas para valorarla. Las
principales son:
Tincin supravital.
Marcadores del ncleo.
HOS test

13

VIABILIDAD (II):
TINCIN SUPRAVITAL
(Eosina-Nigrosina)
Eosina: Colorante vital.
Penetra en las clulas
muertas que tienen la
membrana daada.
Nigrosina: Colorante
para realzar el contraste.

VIABILIDAD (III):
MARCADORES DEL NCLEO
Bromuro de Etidio.
Naranja de Acridina.
Observacin en
el
microscopio
de fluorescencia
a 500 nm de
longitud de onda.

14

VIABILIDAD (IV):
HOS Test: Prueba de la
hinchazn
de
los
espermatozoides
en
medio hipoosmtico.
Interpretacin:
HOS +: Cola arrollada.
HOS -: Cola recta.

VIABILIDAD (V):
La viabilidad debe ser del 75% o superior.
Si todos los espermatozoides de la muestra estn muertos
la muestra se denomina NECROZOOSPERMIA.

15

CONCENTRACIN:
Se expresa en millones de espermatozoides por
mililitro (mill/ml), y se valora mediante una
cmara de recuento Makler.

CONCENTRACIN (II):

La concentracin debe ser mayor de 20 mill/ml.


En caso de ser menor se denomina a la muestra
OLIGOZOOSPERMIA.

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CONCENTRACIN (III):

Como mtodo alternativo se puede


utilizar la cmara de Neubauer.
CONCENTRACIN:
N SPZ EN UNA REGIN A x 10 x FACTOR DE DILUCIN x 1000.

(N SPZ EN UN CUADRADO A) x (FACTOR DE DILUCIN)


VOLUMEN EN UN CUADRADO A (0,1L)

N SPZ
l

PRESENCIA DE ELEMENTOS CELULARES DIFERENTES


DE LOS ESPERMATOZOIDES:
Denominadas Clulas Redondas, entre las que
se incluyen:
Clulas de la Espermatognesis.
Leucocitos.
Clulas del tracto uretral.
Su concentracin no debe exceder de los 5 mill/ml,
y la concentracin de leucocitos no debe ser
superior a 1 mill/ml.

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PRESENCIA DE AGLUTINACIONES:
Consiste en la unin especfica espermatozoideespermatozoide. Pueden ser de varios tipos:
Cabeza-Cabeza.
Pieza Intermedia-Pieza Intermedia.
Cola-Cola.
Otras combinaciones.

La unin de espermatozoides con restos celulares o


detritus se denomina Pseudoaglutinacin.

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MORFOLOGA ESPERMTICA

Se valoran los defectos morfolgicos de los espermatozoides,


fijados y teidos (Tincin de Papanicolau modificada para
espermatozoides).

RESUMEN VALORES DE REFERENCIA


Volumen

2,0 ml

pH

7,2 o superior

Concentracin

20 x 106 / ml

N total de espermatozoides

40 x 106

Motilidad

50%
con
movilidad
progresiva (tipos +++ y ++)
25% con progresin rpida
(tipo +++) a los 60 minutos de
la eyaculacin

Viabilidad

75% de espermatozoides
vivos

Leucocitos

< 1 x 106 / ml

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RESUMEN DIAGNOSTICO MICROSCOPICO DEL EYACULADO


Volumen
(ml) > 2

0,4

Concentracin
(mill /ml) > 20

Motilidad
(%) > 50

Morfologa
normal
(%) > 14

100

35

Comentarios

Posible causa

Fructosa 1 mol/l
(Baja)
pH 6,5 (cido)

Ausencia congnita de vasos


deferentes.
Obstruccin del conducto
eyaculador.
Eyaculacin retrgrada parcial.
Fallo testicular con deficiencia
de andrgenos.
Perdida de parte de la muestra.

Fructosa 15
mol/l

Obstruccin del tracto genital.


Fallo primario de tubulos
seminiferos.
Fallo secundario de tbulos
seminiferos con tratamiento
con androgenos.

70% vivos

Flagelos inmoviles.
Contaminacin o recogida
mediante condon.

RESUMEN DIAGNOSTICO MICROSCOPICO DEL EYACULADO


Volumen
(ml) > 2

Concentracin
(mill /ml) > 20

Motilidad
(%) > 50

Morfologa
normal
(%) > 14

Comentarios

100

35

20% vivos

Contaminacion o tiempo
excesivo antes del anlisis.
Necrozoospermia.
Autoinmunidad.

100

65

Pequeas
cabezas
redondas

Teratozoospermia
Globozoospermia
Astenozoospermia idioptica.
Autoinmunidad.
Prostatitis.
Tiempo excesivo antes del
anlisis.

100

25

10

Licuefaccin
incompleta.
Aglutinaciones.
40% vivos
> 1 mill/ml de
leucocitos.

30

10

Morfologa
anormal.

<1

Espermatozoides
moviles.

Posible causa

Oligozoospermia.
Criptozoospermia.
Fallo 1 tbulos seminiferos.
Obstruccin parcial.

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AZOOSPERMIA
FSH
Normal o ligeramente
aumentada o disminuida

Aumentada >2 veces

Patologa
testicular 1.

LH, T.

IAD.
Resignacin

Biopsia ?. PAAF ?
Diagnstica teraputica

Bloqueo de la
espermatognesis

Sospecha de
alteracin
gentica

Disminuida

Espermatognesis
conservada

No respuesta

Obs. Deferncial Obs.


intratesticular

IAD.
Resignacin

REP

Tratamiento
sustitutivo

FSH-LH
Vol.< 1ml

Vol. normal

FSH-LH

Cariotipo

Hipogonadismo
hipogonadotropo

Agenesia
vesculas
seminales

Obs. eyaculadores

TRA

TRA

REP

OLIGOZOOSPERMIA
Moderada-severa
(<10 mill./ml.)

Leve.
(>10mill./ml)

FSH

FSH

Aumentad
a. >2 veces
Patologa
testicular
primaria

Disminuida

Hipogonadismo
hipogonadotropo
FSH-LH

Test de
seleccin
espermtica

TRA

Normal.

Descartar factores
asociados: Infeccin,
Txicos, Varicocele,
Alt. Citogenticas....

Test de
seleccin
espermtica

Idioptica.
Biopsia???.
Tratamiento???

TRA

Test de seleccin
espermtica

Aumentada

Test de
seleccin
espermtica

TRA: IAC

Ligeramente
FSH-LH

Test de
seleccin
espermtica

TRA: IAC

TRA

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ASTENOZOOSPERMIA
DESCARTAR PATOLOGAS
ASOCIADAS MS FRECUENTES:

ALTERACIONES MICROESTRUCTURALES
DEL CITOESQUELETO:

Varicocele.

-Ausencia de mitocondrias.

Cultivo seminal y secrecin


prosttica. Estudio inmunolgico.
(mar test, IBT.)

-Alteracin de la vaina externa de la cola del


espermatozoide. Gen Oppo 1 del cromosoma
17, la proteina de este gen interviene en el
batido del flagelo.

Va unida frecuentemente a
teratozoospermia.

-Falta de algn microtbulo.


-Ausencia de uno o dos brazos de dineina. (sd.
De Cartagener.) Etiologia gentica, pero gen
desconocido

ASPERMIA

HIPOSEPERMIA

Seminograma
Azoospermia

AUSENCIA de
espermatozoides

Estudio de orina postorgasmo

PRESENCIA de
espermatozoides

FSH

Estudio y tratamiento de
las causas (si es posible)

Protocolo de
Azoospermia

Eyaculacin
con vejiga llena

No emisin

Recuperacin espermtica de
la orina post-orgasmo.

TRA: ICSI

Emisin de esp.

TRA

REP- PAAF

22

ASPERMIA
EYACULACIN RETRGRADA

AZOOSPERMIA
OBSTRUCTIVA:
Se mantiene la produccin de espermatozoides
en los tbulos seminferos.
FALLO TESTICULAR PRIMARIO:
Generalmente asociado a factores genticos.

Arresto de la espermatognesis.

Sndrome de solo clulas de sertoli.

23

AZOOSPERMIA
TCNICAS
QUIRURJICAS
ESPERMATOZOIDES:

PARA

LA

OBTENCIN

DE

1. MESA, Microsurgical epididymal sperm aspiration


2. PESA, Percutaneous epididymal sperm aspiration
3. TESA, Percutaneous testicular sperm aspiration
4. TESE, Testicular sperm extraction

AZOOSPERMIA
1. MESA, Microsurgical epididymal sperm aspiration

24

AZOOSPERMIA
2. PESA, Percutaneous epididymal sperm aspiration

AZOOSPERMIA
3. TESA, Percutaneous testicular sperm aspiration

25

AZOOSPERMIA
4. TESE, Testicular sperm extraction

INMUNOLOGA DEL SEMEN:

26

BARRERA HEMATO-TESTICULAR

BARRERA HEMATO-TESTICULAR

Previene que las clulas testiculares que muestran antgenos


extraos entren en contacto con el tejido linfoide.

Previene que las clulas inmunocompetentes entren en los


tbulos seminferos.

27

Condiciones en las que se puede romper la barrera


hemato-testicular:
Varicocele
Cirugia testicular
Torsin o traumatismo testicular
Agenesia de vasos deferentes
Biopsia testicular
Criptorquidismo
Cancer testicular
Infecciones (orquitis, prostatitis, epididimitis,)
Hernia inguinal

Inmunologa
Otros mecanismos inmunosupresores:
Tolerancia inmunolgica inducida por la escasa presencia de
antgenos espermticos.
Mecanismos inmunomoduladores en los testculos. (Esteroides,
macrofagos, T-supresoras,)
Inmunomodulacin fuera del testculo (T-supresoras
epiddimo, efecto inmunosupresor del plasma seminal,)

en

28

Inmunologa y esterilidad masculina:

Anticuerpos anti-espermatozoide (ASAb)

Inmunoglobulinas de los isotipos IgG, IgA y/o


IgM dirigidas contra varias partes del
espermatozoide (Cabeza, pieza intermedia o
cola).

Inmunologa y esterilidad masculina:

Anticuerpos anti-espermatozoide (ASAb)

Podemos encontrarlos tanto en el hombre como


en la mujer.
Pueden aparecer en suero, semen y en el
moco cervical.

29

Inmunologa y esterilidad masculina:


Problemas causados por los ASAb:
Desordenes de la espermatognesis que provocan oligo o
azoospermia.
Unin a espermatozoides maduros e inhibicin del correcto
transporte a travs del tracto genital masculino.
Aglutinacin de espermatozoides eyaculados.
Citotoxicidad espermtica mediada por ASAb.
Inmobilizacin de los espermatozoides en el tracto genital
femenino por efecto de los ASAb.
Aumento de
macrofagos.

la

fagocitacin

de

espermatozoides

por

Inmunologa y esterilidad masculina:


Problemas causados por los ASAb:
Paso inadecuado de los espermatozoides a travs del moco
cervical.
Desrdenes en la capacitacin espermtica y la reaccin
acrosmica.
Bloqueo de la interaccin ovocito-espermatozoide.(IgA)
Induccin de inmunidad frente a espermatozoides en la mujer.
Fallos reproductivos posfecundacin y abortos.

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Inmunologa y esterilidad masculina:


ESTUDIO DE SEMEN BASAL O SEMINOGRAMA:
Examen macroscpico

Examen microscpico

Aspecto.

Concentracin.

Viscosidad.

Motilidad.

pH.

Viabilidad.

Volumen.

Morfologa.

Inmunologa y esterilidad masculina:


PRESENCIA DE AGLUTINACIONES:
Consiste en la unin especfica espermatozoide-espermatozoide. Pueden ser
de varios tipos:

Cabeza-Cabeza.
Pieza Intermedia-Pieza Intermedia.
Cola-Cola.
Otras combinaciones.

La unin de espermatozoides con restos celulares o detritus se denomina


Pseudoaglutinacin.

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Inmunologa y esterilidad masculina:


BAJA VIABILIDAD:
Valoracin mediante tincin supravital con Eosina- Nigrosina:

Inmunologa y esterilidad masculina:


IMMUNOBEAD Test (IBT): Para deteccin de IgG e IgA.

Ms del 20 % positivo.

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Inmunologa y esterilidad masculina:


Mixed Antiglobulin Reaction (MAR Test): Para detectar IgG.

Sospecha si hay entre 10 y 39% de spz mviles adheridos.


Ms del 40% supone un a muy alta probabilidad de causa inmunolgica.

Inmunologa y esterilidad masculina:


OTROS MTODOS PARA DETECTAR ASAb:

Interaccin semen-mucus cervical.


ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
RIA (Radioimmunoassay)

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Inmunologa y esterilidad masculina:


TRATAMIENTO:

Tratamiento con corticoides.


Lavado seminal. Inmunoadsorcin.
Tratamiento con proteasas.
Tcnicas de reproduccin asistida.( FIV / ICSI)

Tcnicas avanzadas en el
laboratorio de Androloga.

Jos Luis Girela Lpez


Dpto. de Biotecnologa
Universidad de Alicante

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TCNICAS AVANZADAS EN EL
LABORATORIO DE ANDROLOGA.

Tcnicas de seleccin espermtica (Capacitacin)

CAPACITACIN:
Serie de cambios bioqumicos y fsicos, que afectan a las
membranas y al metabolismo energtico, requeridos por el
espermatozoide para estar en condiciones de liberar el
contenido acrosomal.

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En el Laboratorio de Androloga se pueden utilizar


diferentes tcnicas para inducir este proceso in
vitro.
Estas tcnicas se denominan en su conjunto
tcnicas de seleccin espermtica, ya que no
solo inducen la capacitacin, sino que ademas
recogen de forma especfica los mejores
espermatozoides en base a diferentes criterios.

TCNICAS DE SELECCIN ESPERMTICA:


SWIM-UP.
GRADIENTES.

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SWIM-UP o migracin ascendente:


Se basa en el principio de que Solo los
espermatozoides mviles son capaces de pasar del
pellet al sobrenadante.

LAVADO MEDIANTE CENTRIFUGACIN

37

SE AADE MEDIO SOBRE EL PELLET

INCUBACIN (1 HORA A 37C Y 5% CO2)

38

GRADIENTES:
Los mejores espermatozoides (morfologa) sern
capaces de atravesar los gradientes de densidad y
llegar al fondo del tubo.

39

Comprobacin de la Capacitacin:
Hiperactivacin espermtica
Fosforilacin de residuos de tirosina
Contenido de Glucosa-6-fosfato
Contenido de NADPH

40